本發(fā)明涉及植物的組織培養(yǎng)技術(shù)，具體涉及白花泡桐無(wú)毒種苗的培育方法。

背景技術(shù)：

白花泡桐Paulownia fortunei(Seem.)Hemsl為玄參科、泡桐屬高大喬木，主產(chǎn)于中國(guó)南方，高可達(dá)30米，主干直，胸徑可達(dá)2米，是一種用途廣、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、速生優(yōu)質(zhì)的用材落葉樹(shù)種。白花泡桐優(yōu)良無(wú)性系的特點(diǎn)是：(1)抗逆性好、適應(yīng)性強(qiáng)、長(zhǎng)江流域以南均可種植；(2)生長(zhǎng)速度快、5-6年即可采伐、平均胸徑42cm、平均畝產(chǎn)量33m³；(3)材質(zhì)輕、韌性好、密度低、強(qiáng)度及抗彎強(qiáng)度大，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高。

為保證優(yōu)樹(shù)性狀能穩(wěn)定遺傳，其種苗繁殖必須通過(guò)無(wú)性繁殖方式進(jìn)行?，F(xiàn)有泡桐的無(wú)性繁殖方式通常有嫁接、分根和組培等多種方式。其中，嫁接繁殖需要較多的人力、物力和財(cái)力，不適于泡桐種苗大規(guī)模生產(chǎn)。而泡桐分根育苗主要是選取1-2年生泡桐種根，一般于2月下旬至3月上旬埋根育苗，其方法雖然簡(jiǎn)單快捷，出苗率高，成本低，但需要比較多的植物材料，速度和產(chǎn)量有限；而且對(duì)土壤的要求較高，需要土質(zhì)良好、無(wú)病蟲害、干燥無(wú)積水、肥力充足等土壤條件；所選擇的種根必須無(wú)病蟲害、損傷較輕，若選擇不當(dāng)，很容易造成出苗率低和引發(fā)泡桐叢枝病。相比嫁接和分根繁殖，組培脫毒快繁更加快捷高效，且不受分根育苗的時(shí)間、材料和土質(zhì)的限制，能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得大量無(wú)毒優(yōu)質(zhì)種苗，減輕移栽后泡桐叢枝病的發(fā)生和危害。

雖然白花泡桐的種苗脫毒快繁技術(shù)目前已有報(bào)道，但不同的白花泡桐優(yōu)良單株，其最優(yōu)的組培脫毒技術(shù)和方法不同(李芳東，中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30卷8期，22-28頁(yè))。本申請(qǐng)人在研究白花泡桐優(yōu)良無(wú)性系種苗組培快繁產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)中仍存在三個(gè)影響產(chǎn)業(yè)效率的主要問(wèn)題：一是組培材料脫毒時(shí)間長(zhǎng)，效果不夠理想，脫毒效率不高；二是在高激素濃度的單一培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)多次繼代培養(yǎng)后，材料容易玻璃化，通常第5代玻璃化率約為20％，并隨著繼代次數(shù)的增加玻璃化率有升高的趨勢(shì)，大幅影響種苗質(zhì)量、繁殖率、生根率和成活率；三是組培苗在瓊脂為支撐物的培養(yǎng)基上生根時(shí)，根系表面長(zhǎng)出大量的長(zhǎng)約5mm的細(xì)絨毛，吸附大量的培養(yǎng)基，洗苗費(fèi)工費(fèi)時(shí)，在洗苗容易對(duì)種苗造成損傷，影響洗苗效率和移栽成活率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種白花泡桐無(wú)毒種苗的培育方法。該方法操作簡(jiǎn)單，脫毒、增殖及生根效率高，所得的生根苗植株健壯、根系發(fā)達(dá)、根系上的細(xì)絨毛短(<1mm)，洗苗省工省時(shí)，移栽成活率高。

本發(fā)明所述的白花泡桐無(wú)毒種苗的培育方法，包括以下步驟：

1)以白花泡桐帶腋芽的莖段為外植體，消毒后接種于初代培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)，直至外植體上的腋芽發(fā)育生長(zhǎng)形成初代幼苗；

2)將所得幼苗剪成帶有1或2個(gè)以上腋芽的莖段，轉(zhuǎn)入脫毒培養(yǎng)基中，在36-39℃結(jié)合藍(lán)光照射的條件下進(jìn)行脫毒培養(yǎng)，得到脫毒材料；

3)將所得脫毒材料剪成帶有1或2個(gè)以上腋芽的莖段，交替接入高濃度植物激素繼代培養(yǎng)基和低濃度植物激素繼代培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)，得到叢生苗；其中：

所述的高濃度植物激素繼代培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA 3.5-4.5mg·L^-1+IBA 0.35-0.45mg·L^-1+蔗糖25-35g·L^-1+瓊脂3.0-4.0g·L^-1，pH 5.6-6.0；

所述的低濃度植物激素繼代培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA 0.2-0.6mg·L^-1+IBA 0.02-0.06mg·L^-1+蔗糖25-35g·L^-1+瓊脂3.0-4.0g·L^-1，pH 5.6-6.0；

4)將所得叢生苗分株，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)，得到生根苗；所述的生根培養(yǎng)基配方為：1/2MS+NAA 0.1-0.4mg·L^-1+蔗糖15-25g·L^-1+卡拉膠3.2-3.6g·L^-1，pH 5.6-6.0。

上述培育方法的步驟1)中，對(duì)外植體的消毒處理與現(xiàn)有技術(shù)相同，具體的消毒處理可按下述方法進(jìn)行：取外植體置于質(zhì)量濃度為1-3％的洗潔精水溶液中浸泡3-5min，取出后用流水沖洗干凈，再置于超凈工作臺(tái)上用體積濃度為70-75％的乙醇浸泡50-70s，取出后再置于質(zhì)量濃度為0.1-0.2％的HgCl₂中浸泡5-8min，取出，無(wú)菌水清洗3-5次。

上述培育方法的步驟1)中，所述的初代培養(yǎng)基配方優(yōu)選為：MS+6-BA1.0-4.0mg·L^-1+IBA 0.1-0.4mg·L^-1+蔗糖25-35g·L^-1+瓊脂3.0-4.0g·L^-1，pH5.6-6.0；更優(yōu)選為：MS+6-BA 2.0mg·L^-1+IBA 0.2mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1，pH 5.8。該步驟中，所述的光照培養(yǎng)條件為：溫度為27±5℃，光照時(shí)間為10-15h/d，光照強(qiáng)度為40±5μmol·m^-2·s^-1；進(jìn)一步優(yōu)選為：溫度為28±2℃，光照時(shí)間為10-12h/d，光照強(qiáng)度為40μmol·m^-2·s^-1。該步驟中，通常是當(dāng)外植體上的腋芽發(fā)育生長(zhǎng)至2-3cm時(shí)即認(rèn)為形成初代芽苗。

上述培育方法的步驟2)中，所述的脫毒培養(yǎng)基配方優(yōu)選為：MS+6-BA3.5-4.5mg·L^-1+IBA 0.35-0.45mg·L^-1+蔗糖25-35g·L^-1+瓊脂3.0-4.0g·L^-1，pH5.6-6.0；更優(yōu)選為：MS+6-BA 4.0mg·L^-1+IBA 0.4mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1，pH 5.8。該步驟中，所述藍(lán)光照射時(shí)所用的藍(lán)光波長(zhǎng)為465±10nm，其光照強(qiáng)度為40±5μmol·m^-2·s^-1、光照時(shí)間10-15h/d；進(jìn)一步優(yōu)選藍(lán)光光照強(qiáng)度為40±5μmol·m^-2·s^-1、光照時(shí)間10-12h/d。

本申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，在上述培育方法的步驟3)中，通過(guò)采用高濃度植物激素繼代培養(yǎng)基和低濃度植物激素繼代培養(yǎng)基交替培養(yǎng)的繼代培養(yǎng)方法，在可以保證材料增殖效率的同時(shí)，還能將玻璃化率降低至5％以下。所述高濃度植物激素繼代培養(yǎng)基和低濃度植物激素繼代培養(yǎng)基交替培養(yǎng)的繼代培養(yǎng)方法，是指將脫毒材料先接入高濃度植物激素繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)一個(gè)繼代周期，然后取出材料再接入低濃度植物激素繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)一個(gè)繼代周期；……；如此循環(huán)往復(fù)交替培養(yǎng)，直至得到足夠的材料進(jìn)行生根培養(yǎng)。在此過(guò)程中，不論材料是長(zhǎng)在高濃度植物激素繼代培養(yǎng)基中，或是長(zhǎng)于低濃度植物激素繼代培養(yǎng)基中，只要不出現(xiàn)玻璃化、植株高度在4cm以上的芽苗，均可用于生根培養(yǎng)；其它達(dá)不到生根要求的材料(如比較細(xì)弱或矮小的植株)，可作為繼代材料進(jìn)入下一個(gè)繼代培養(yǎng)周期，為下一輪生根培養(yǎng)進(jìn)行材料儲(chǔ)備。該步驟中，所述的高濃度植物激素繼代培養(yǎng)基配方優(yōu)選為：MS+6-BA4.0mg·L^-1+IBA0.4mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1，pH 5.8；所述的低濃度植物激素繼代培養(yǎng)基配方優(yōu)選為：MS+6-BA0.5mg·L^-1+IBA0.05mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1，pH 5.8。該步驟中，在高濃度植物激素繼代培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)和在低濃度植物激素繼代培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)條件相同，均為：溫度為27±5℃，光照時(shí)間為10-15h/d，光照強(qiáng)度為40±5μmol·m^-2·s^-1；進(jìn)一步優(yōu)選為：溫度為28±2℃，光照時(shí)間為10-12h/d，光照強(qiáng)度為40μmol·m^-2·s^-1。

上述培育方法的步驟4)中，所述的生根培養(yǎng)基配方優(yōu)選為：1/2MS+NAA0.2mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1+卡拉膠3.4g·L^-1，pH 5.8。申請(qǐng)人在具體的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)生根培養(yǎng)中采用卡拉膠作為生根培養(yǎng)基的固體支撐物時(shí)，不僅生根時(shí)間短、生根率高、根系發(fā)達(dá)潔白，并且能夠抑制以瓊脂作為固體支撐物時(shí)所得生根苗根系上細(xì)絨毛的生長(zhǎng)，控制細(xì)絨毛的長(zhǎng)度小于1mm，從而使生根苗更易于洗滌，大大提高了洗苗效率和移栽成活率。該步驟中，所述的光照培養(yǎng)條件為：溫度為27±5℃，光照時(shí)間為10-15h/d，光照強(qiáng)度為40±5μmol·m^-2·s^-1；進(jìn)一步優(yōu)選為：溫度為28±2℃，光照時(shí)間為10-12h/d，光照強(qiáng)度為40μmol·m^-2·s^-1。該步驟中，在將叢生苗分株時(shí)，優(yōu)選是選擇株高4.0cm以上的健壯叢生苗進(jìn)行分株。

在上訴限定的培養(yǎng)條件下，外植體在初代培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到初代幼苗(2-3cm)所需時(shí)間通常為25-35d；脫毒培養(yǎng)的時(shí)間通常10-15d；帶腋芽的莖段在高濃度植物激素繼代培養(yǎng)基中的一個(gè)繼代周期和在低濃度植物激素繼代培養(yǎng)基中的一個(gè)繼代周期相同，通常為25-30d；叢生苗在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到生根苗所需時(shí)間通常為10-15d，此時(shí)每株長(zhǎng)根3-10條，根長(zhǎng)3-5cm，且所得生根苗的根系為白色，根系上的細(xì)絨毛短(<1mm)，便于洗滌，符合煉苗移栽要求。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的特點(diǎn)在于：

1、在叢生芽大量擴(kuò)增之前，采用波長(zhǎng)465±10nm的藍(lán)光照射結(jié)合36-39℃的高溫培養(yǎng)10-15d，對(duì)芽苗進(jìn)行脫毒處理，提高了脫毒效率，使脫毒率達(dá)到100％；

2、采用高濃度植物激素繼代培養(yǎng)基和低濃度植物激素繼代培養(yǎng)基交替培養(yǎng)的繼代培養(yǎng)方法，既保證材料的增殖效率，又能將材料的玻璃化率降低至5％以下；

3、在生根培養(yǎng)階段，以卡拉膠代替瓊脂作為培養(yǎng)基固體支撐物，并結(jié)合特定的激素濃度，不僅使生根時(shí)間短、生根率高、根系發(fā)達(dá)潔白，而且抑制了生根苗根系上細(xì)絨毛的生長(zhǎng)(絨毛長(zhǎng)度<1mm)，使生根苗更易于洗滌，從而減小了在洗苗時(shí)對(duì)生根苗的損傷，大大提高了洗苗效率和移栽成活率；

4、本發(fā)明所述方法簡(jiǎn)單易操作，脫毒、增殖和生根效率高，可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化批量生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1培育得到的初代幼苗的圖片；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1培育得到的叢生苗的圖片；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1培育得到的生根苗的圖片，其中根系潔白、細(xì)絨毛短(<1mm)；

圖4為對(duì)比例3培育得到的生根苗的圖片，其中根系淺黃，周圍長(zhǎng)滿了淺白色霧狀、長(zhǎng)約5mm的細(xì)絨毛；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1和對(duì)比例3培育得到的生根苗洗滌后的圖片，其中左邊的生根苗(實(shí)施例1培育得到)根系細(xì)絨毛短(<1mm)，洗滌后基本無(wú)培養(yǎng)基附著；右邊的生根苗(對(duì)比例3培育得到)根系細(xì)絨毛較長(zhǎng)(約5mm)，洗滌后仍附著較多培養(yǎng)基，且很難洗凈；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例1培育得到的移栽苗的圖片。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳述，以更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1

1)以白花泡桐(該白花泡桐是從桂北地區(qū)廣西植物研究所內(nèi)的白花泡桐中按現(xiàn)有常規(guī)篩選方法進(jìn)行篩選得到的白花泡桐優(yōu)良無(wú)性系)帶腋芽的莖段作為外植體，置于質(zhì)量濃度為1％的洗潔精溶液中浸泡10min，取出后在流動(dòng)的自來(lái)水下沖洗干凈，再置于超凈工作臺(tái)上用體積濃度為70％的乙醇浸泡60s，取出后再置于質(zhì)量濃度為0.1％的HgCl₂中浸泡7min，取出，用無(wú)菌水清洗5次；

2)將消毒后的外植體接種于初代培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)30d，外植體腋芽發(fā)育生長(zhǎng)，形成2-3cm高的芽苗(如圖1所示)，即為初代幼苗；其中，所述的初代培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA 2.0mg·L^-1+IBA 0.2mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1，pH 5.8；所述的光照培養(yǎng)條件為：溫度為28±3℃，光照時(shí)間為10h/d，光照強(qiáng)度為40μmol·m^-2·s^-1；用上述方法所得初代幼苗健壯，葉片鮮綠色，生長(zhǎng)良好，誘導(dǎo)率70％；

3)將所得的幼苗分剪成帶有1或2個(gè)腋芽的莖段，接入脫毒培養(yǎng)基中，在37-39℃結(jié)合藍(lán)光(波長(zhǎng)465±10nm)照射條件下進(jìn)行脫毒培養(yǎng)15d，對(duì)芽苗進(jìn)行脫毒處理，得到脫毒材料；其中，所述的脫毒培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA4.0mg·L^-1+IBA0.4mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1，pH 5.8；脫毒培養(yǎng)時(shí)藍(lán)光的光照強(qiáng)度為40±5μmol·m^-2·s^-1，光照時(shí)間為10h/d；用上述方法脫毒效率可達(dá)100％；

4)將所得脫毒材料分剪成帶有1或2個(gè)腋芽的莖段，先接入高濃度植物激素繼代培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)一個(gè)繼代周期(25d)，繁殖系數(shù)為6.0/25d；然后取出材料分剪成帶有1或2個(gè)腋芽的莖段，再接入低濃度植物激素繼代培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)一個(gè)繼代周期(25d)，繁殖系數(shù)5.0/25d；……；如此循環(huán)往復(fù)交替培養(yǎng)，直至得到足夠的材料用于生根培養(yǎng)；其中，所述的高濃度植物激素繼代培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA4.0mg·L^-1+IBA 0.4mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1，pH 5.8；低濃度植物激素繼代培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA 0.5mg·L^-1+IBA 0.05mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1，pH 5.8；在兩種培養(yǎng)基中的光照培養(yǎng)條件相同，均為：溫度為28±3℃，光照時(shí)間為10h/d，光照強(qiáng)度為40μmol·m^-2·s^-1；通過(guò)上述交替培養(yǎng)所得的叢生苗數(shù)量多、平均繁殖系數(shù)5.0/25d以上，植株較壯、長(zhǎng)勢(shì)良好，玻璃化率低于5％，培養(yǎng)一個(gè)周期(25d)所得的叢生苗高度為3-6cm(如圖2所示)；

5)選取高度在4cm以上的健壯叢生苗分株后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)12d，得到白花泡桐生根苗；其中，所述的生根培養(yǎng)基配方為：1/2MS+NAA 0.2mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1+卡拉膠3.4g·L^-1，pH 5.8；所述光照培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：溫度為28±3℃，光照時(shí)間為10h/d，光照強(qiáng)度為40μmol·m^-2·s^-1；用上述方法所得的生根苗植株生長(zhǎng)良好，根系發(fā)達(dá)、潔白、細(xì)絨毛短(<1mm)、易于洗滌，每株長(zhǎng)根5-10條，根長(zhǎng)3-5cm，生根率100％(如圖3以及圖5中左邊的生根苗所示)；

6)將所得生根苗按常規(guī)方法進(jìn)行煉苗，即得到白花泡桐無(wú)毒種苗(如圖6所示)。

對(duì)比例1

重復(fù)實(shí)施例1，不同的是：

將步驟2)中初代培養(yǎng)基配方改為：MS+6-BA 0.5mg·L^-1+IBA 0.05mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1，pH 5.8；初代芽苗誘導(dǎo)速度慢，誘導(dǎo)率低，僅為25％；

將步驟3)中的脫毒方法改為：采用白光(光照強(qiáng)度為40±5μmol·m^-2·s^-1、光照時(shí)間10h/d)結(jié)合33-35℃的溫度培養(yǎng)25d，脫毒效率15％；

將步驟4)中的高濃度植物激素培養(yǎng)基配方改為：MS+6-BA 2.0mg·L^-1+IBA 0.02mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1(pH 5.8)，叢生芽生長(zhǎng)一般，部分新芽長(zhǎng)出后頂枯死亡；另外10％的材料不能誘導(dǎo)出叢生芽、且部分直接枯萎死亡，死因不明；平均繁殖系數(shù)4.0/25d；將低濃度植物激素培養(yǎng)基配方改為：MS+6-BA 0.1mg·L^-1+IBA 0.01mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1(pH 5.8)，叢生苗誘導(dǎo)慢、誘導(dǎo)率低，無(wú)效外植體較多，繁殖系數(shù)2.0；交替繼代的平均增殖系數(shù)為3.0/30d；

將步驟5)中的生根培養(yǎng)基配方改為：1/2MS+NAA 0.05mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1+卡拉膠3.4g·L^-1，pH 5.8；苗生長(zhǎng)良好，但生根率低，僅53％，且根較細(xì)。

對(duì)比例2

重復(fù)實(shí)施例1，不同的是：

將步驟2)中初代培養(yǎng)基配方改為：MS+6-BA 5.0mg·L^-1+IBA 0.5mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1，pH 5.8；有大量愈傷組織產(chǎn)生，初代芽苗無(wú)法形成，大半外植體壞死；

將步驟3)中的脫毒方法改為：采用白光(光照強(qiáng)度為40±5μmol·m^-2·s^-1、光照時(shí)間10h/d)結(jié)合40-42℃的溫度培養(yǎng)，由于溫度過(guò)高，培養(yǎng)幾天后材料大部分死亡，達(dá)不到育苗效果；

將步驟4)中的高濃度植物激素培養(yǎng)基配方改為：MS+6-BA 6.0mg·L^-1+IBA 0.6mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1(pH 5.8)；叢生苗底部產(chǎn)生大量愈傷組織，大部分叢生苗生長(zhǎng)慢，后期慢慢枯死，繁殖系數(shù)1.6；將低濃度植物激素培養(yǎng)基配方改為：MS+6-BA 0.1mg·L^-1+IBA 0.01mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1(pH 5.8)，材料能誘導(dǎo)出新芽，芽苗一部分生長(zhǎng)正常、植株粗壯，一部分頂枯死亡，繁殖系數(shù)2.6/30d；交替繼代的平均增殖系數(shù)為2.1/30d；

將步驟5)中的生根培養(yǎng)基配方修改為：1/2MS+NAA 0.8mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1+卡拉膠3.4g·L^-1，pH 5.8；叢生苗生根少，且生根時(shí)間不齊，生根率為67％。

對(duì)比例3

重復(fù)實(shí)施例1，不同的是：

在步驟5)中，將生根培養(yǎng)基的固體支撐物由卡拉膠改為瓊脂，即生根培養(yǎng)基配方修改為：1/2MS+NAA 0.2mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1，pH5.8；所得生根苗生長(zhǎng)良好，每株長(zhǎng)根3-7條，根長(zhǎng)3-6cm，生根率100％，根顏色淺黃，但根系上長(zhǎng)滿大量長(zhǎng)約5mm的細(xì)絨毛(如圖4及圖5中右邊的生根苗所示)，粘附著大量的培養(yǎng)基，不易清洗干凈，洗苗費(fèi)工費(fèi)時(shí)。

對(duì)比例4

重復(fù)實(shí)施例1，不同的是：

將步驟4)中的繼代培養(yǎng)方法改為：只用單一低濃度植物激素繼代培養(yǎng)基進(jìn)行循環(huán)繼代，其中，繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5mg·L^-1+IBA 0.05mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1(pH 5.8)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)5次以上連續(xù)繼代后，只有70％的培養(yǎng)材料能誘導(dǎo)出叢生芽，且叢生芽數(shù)量偏少，形成的植株粗壯高大，葉寬大、鮮綠；30％的材料不能誘導(dǎo)出叢生芽、部分直接枯萎死亡；雖然無(wú)玻璃化材料，但平均繁殖系數(shù)過(guò)低，僅為2.5/25d。

對(duì)比例5

重復(fù)實(shí)施例1，不同的是：

將步驟4)中的繼代培養(yǎng)方法改為：只用單一中等濃度植物激素培養(yǎng)基進(jìn)行循環(huán)繼代，其中，繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0mg·L^-1+IBA 0.2mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1(pH 5.8)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)5次以上連續(xù)繼代后，75％的材料能誘導(dǎo)出叢生芽，叢生芽生長(zhǎng)一般，葉綠、大小中等，部分新芽長(zhǎng)出后頂枯死亡；25％的材料不能誘導(dǎo)出叢生芽、且部分直接枯萎死亡；平均繁殖系數(shù)3.2/25d，玻璃化率大于10％。

對(duì)比例6

重復(fù)實(shí)施例1，不同的是：

將步驟4)中的繼代培養(yǎng)方法改為：只用單一高濃度植物激素繼代培養(yǎng)基進(jìn)行循環(huán)繼代，其中，繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA4.0mg·L^-1+IBA 0.4mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1(pH 5.8)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前5代所得的叢生苗生長(zhǎng)良好，葉鮮綠、大小中等，繁殖系數(shù)6.0/25d；但到第5代之后，開(kāi)始出現(xiàn)玻璃化材料，玻璃化產(chǎn)率大于20％，繁殖系數(shù)下降至3.0/25d。

實(shí)施例2

1)以白花泡桐(該白花泡桐是從桂北地區(qū)廣西植物研究所內(nèi)的白花泡桐中按現(xiàn)有常規(guī)篩選方法進(jìn)行篩選得到的白花泡桐優(yōu)良無(wú)性系)帶腋芽的莖段作為外植體，置于質(zhì)量濃度為1％的洗潔精溶液中浸泡10min，取出后在流動(dòng)的自來(lái)水下沖洗干凈，再置于超凈工作臺(tái)上用體積濃度為70％的乙醇浸泡50s，取出后再置于質(zhì)量濃度為0.1％的HgCl₂中浸泡6min，取出，用無(wú)菌水清洗4次；

2)將消毒后的外植體接種于初代培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)25d，外植體腋芽發(fā)育生長(zhǎng)，形成2-3cm高的芽苗，即為初代幼苗，所得幼苗健壯，葉片鮮綠色，生長(zhǎng)良好，誘導(dǎo)率65％；其中，所述的初代培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA 1.0mg·L^-1+IBA 0.4mg·L^-1+蔗糖25g·L^-1+瓊脂3.0g·L^-1，pH 5.8；所述的光照培養(yǎng)條件為：溫度為28±3℃，光照時(shí)間為12h/d，光照強(qiáng)度為45μmol·m^-2·s^-1；

3)將所得的幼苗分剪成帶有1或2個(gè)腋芽的莖段，接入脫毒培養(yǎng)基中，在37-39℃結(jié)合藍(lán)光(波長(zhǎng)465±10nm)照射條件下進(jìn)行脫毒培養(yǎng)10d，對(duì)芽苗進(jìn)行脫毒處理，脫毒效率100％，得到脫毒材料；其中，所述的脫毒培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA 4.0mg·L^-1+IBA 0.4mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂3.5g·L^-1，pH 5.8；脫毒培養(yǎng)時(shí)藍(lán)光的光照強(qiáng)度為35μmol·m^-2·s^-1，光照時(shí)間為12h/d；

4)將所得脫毒材料分剪成帶有1或2個(gè)腋芽的莖段，先接入高濃度植物激素繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)中，光照培養(yǎng)一個(gè)繼代周期(25d)，繁殖系數(shù)為5.0/25d；然后取出材料分剪成帶有1或2個(gè)腋芽的莖段，再接入低濃度植物激素繼代培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)一個(gè)繼代周期(25d)，繁殖系數(shù)4.0/25d；……；如此循環(huán)往復(fù)交替培養(yǎng)，直至得到足夠的材料用于生根培養(yǎng)；其中，所述的高濃度植物激素繼代培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA 3.5mg·L^-1+IBA 0.45mg·L^-1+蔗糖25g·L^-1+瓊脂3.0g·L^-1，pH 5.8；低濃度植物激素繼代培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA0.6mg·L^-1+IBA 0.02mg·L^-1+蔗糖25g·L^-1+瓊脂3.0g·L^-1，pH 5.8；在兩種培養(yǎng)基中的光照培養(yǎng)條件相同，均為：溫度為28±3℃，光照時(shí)間為12h/d，光照強(qiáng)度為40μmol·m^-2·s^-1；通過(guò)上述交替培養(yǎng)所得的叢生苗數(shù)量較多、平均繁殖系數(shù)4.5/25d，植株長(zhǎng)勢(shì)良好，葉鮮綠、大小中等，玻璃化率低于5％，培養(yǎng)一個(gè)周期(25d)所得的叢生苗高度為2-6cm；

5)選取高度在4cm以上的健壯叢生苗分株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)12d，得到白花泡桐生根苗；其中，所述的生根培養(yǎng)基配方為：1/2MS+NAA0.15mg·L^-1+蔗糖15g·L^-1+卡拉膠3.3g·L^-1，pH 5.8；所述光照培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：溫度為28±3℃，光照時(shí)間為10h/d，光照強(qiáng)度為40μmol·m^-2·s^-1；用上述方法所得的生根苗植株生長(zhǎng)良好，根系發(fā)達(dá)、潔白、細(xì)絨毛短(<1mm)、易于洗滌，每株長(zhǎng)根4-7條，根長(zhǎng)3-5cm，生根率95％；

6)將所得生根苗按常規(guī)方法進(jìn)行煉苗，即得到白花泡桐無(wú)毒種苗。

實(shí)施例3

1)以白花泡桐(該白花泡桐為白花泡桐優(yōu)良無(wú)性系C001)帶腋芽的莖段作為外植體，置于質(zhì)量濃度為1％的洗潔精溶液中浸泡10min，取出后在流動(dòng)的自來(lái)水下沖洗干凈，再置于超凈工作臺(tái)上用體積濃度為75％的乙醇浸泡70s，取出后再置于質(zhì)量濃度為0.2％的HgCl₂中浸泡8min，取出，用無(wú)菌水清洗5次；

2)將消毒后的外植體接種于初代培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)25d，外植體腋芽發(fā)育生長(zhǎng)，形成2-3cm高的芽苗，即為初代幼苗，所得幼苗健壯，葉片鮮綠色，生長(zhǎng)良好，誘導(dǎo)率60％；其中，所述的初代培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA 4.0mg·L^-1+IBA 0.1mg·L^-1+蔗糖35g·L^-1+瓊脂4.0g·L^-1，pH 5.8；所述的光照培養(yǎng)條件為：溫度為27±5℃，光照時(shí)間為15h/d，光照強(qiáng)度為35μmol·m^-2·s^-1；

3)將所得的幼苗分剪成帶有1或2個(gè)腋芽的莖段，接入脫毒培養(yǎng)基中，在36-38℃結(jié)合藍(lán)光(波長(zhǎng)465±10nm)照射條件下進(jìn)行脫毒培養(yǎng)13d，對(duì)芽苗進(jìn)行脫毒處理，脫毒效率100％，得到脫毒材料；其中，所述的脫毒培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA 4.0mg·L^-1+IBA 0.4mg·L^-1+蔗糖35g·L^-1+瓊脂4.0g·L^-1，pH 5.8；脫毒培養(yǎng)時(shí)藍(lán)光的光照強(qiáng)度為45μmol·m^-2·s^-1，光照時(shí)間為10h/d；

4)將所得脫毒材料分剪成帶有1或2個(gè)腋芽的莖段，先接入高濃度植物激素繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)中，光照培養(yǎng)一個(gè)繼代周期(25d)，繁殖系數(shù)為5.6/25d；然后取出材料分剪成帶有1或2個(gè)腋芽的莖段，再接入低濃度植物激素繼代培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)一個(gè)繼代周期(25d)，繁殖系數(shù)4.0/25d；……；如此循環(huán)往復(fù)交替培養(yǎng)，直至得到足夠的材料用于生根培養(yǎng)；其中，所述的高濃度植物激素繼代培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA 4.5mg·L^-1+IBA 0.35mg·L^-1+蔗糖35g·L^-1+瓊脂4.0g·L^-1，pH 5.8；低濃度植物激素繼代培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA0.2mg·L^-1+IBA0.06mg·L^-1+蔗糖35g·L^-1+瓊脂4.0g·L^-1，pH 5.8；在兩種培養(yǎng)基中的光照培養(yǎng)條件相同，均為：溫度為27±3℃，光照時(shí)間為15h/d，光照強(qiáng)度為40μmol·m^-2·s^-1；通過(guò)上述交替培養(yǎng)所得的叢生苗數(shù)量較多、平均繁殖系數(shù)4.8/25d，植株長(zhǎng)勢(shì)良好，葉鮮綠、大小中等，玻璃化率低于5％，培養(yǎng)一個(gè)周期(25d)所得的叢生苗高度為2-6cm；

5)選取高度在4cm以上的健壯叢生苗分株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)12d，得到白花泡桐生根苗；其中，所述的生根培養(yǎng)基配方為：1/2MS+NAA0.35mg·L^-1+蔗糖25g·L^-1+卡拉膠3.5g·L^-1，pH 5.8；所述光照培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：溫度為28±3℃，光照時(shí)間為15h/d，光照強(qiáng)度為35μmol·m^-2·s^-1；用上述方法所得的生根苗植株生長(zhǎng)良好，根系發(fā)達(dá)、潔白、細(xì)絨毛短(<1mm)、易于洗滌，每株長(zhǎng)根4-8條，根長(zhǎng)3-7cm，生根率98％；

6)將所得生根苗按常規(guī)方法進(jìn)行煉苗，即得到白花泡桐無(wú)毒種苗。