本發(fā)明一種新型動(dòng)物模型，特別涉及基因高階動(dòng)物作為皮膚屏障功能障礙動(dòng)物模型的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

皮膚是機(jī)體最直接與外界接觸的器官，也是人體最大的器官，覆蓋于整個(gè)體表，起到了重要的屏障作用。作為機(jī)體重要的物理/機(jī)械屏障，一方面，它在一定程度上可以阻止外界不利因素(物理、化學(xué)、生物等)進(jìn)入人體，保護(hù)著體內(nèi)各種器官和組織免受外界物質(zhì)侵襲；另一方面，可以避免人體表皮及真皮內(nèi)水分及脂類等物質(zhì)的丟失，從而保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定。

研究表明，特異性皮炎(atopic dermatitis，AD)、魚鱗病、銀屑病、接觸性皮炎、玫瑰痤瘡、濕疹等多種皮膚病的發(fā)生都與皮膚屏障功能的穩(wěn)定有關(guān)。因此，皮膚屏障功能一直以來都是皮膚科臨床工作中十分關(guān)注的熱點(diǎn)。如：引起皮膚屏障功能破壞最常見的疾病--特異性皮炎，是一種慢性的、反復(fù)發(fā)作的炎癥性皮膚疾病，目前有10％-20％的兒童受此疾病困擾[Carroll CL,Balkrishnan R,Feldman SR,Fleischer AB Jr,Manuel JC.The burden of atopic dermatitis:impact on the patient,family,and society.Pediatr Dermatol.2005；22(3):192-199.]。

皮膚表皮最外層的角質(zhì)層(stratum corneum)，是皮膚的第一道屏護(hù)門，在皮膚屏障中起著至關(guān)重要的作用。機(jī)體90％的皮膚屏障功能依靠角質(zhì)層完成。角質(zhì)層由退化的角質(zhì)形成細(xì)胞層疊交錯(cuò)構(gòu)成，在皮膚不同位置，角質(zhì)層有不同的厚度，約5～20層細(xì)胞，厚度約10～15微米“磚墻模型”是現(xiàn)在公認(rèn)的表皮角質(zhì)層屏障結(jié)構(gòu)模型。角質(zhì)層屏障的主要成分是角質(zhì)套膜(磚)(Cornified envelop)和胞間的脂質(zhì)雙分子層(泥)(Intercellular lipid)；角質(zhì)套膜由占角質(zhì)層80％的兜甲蛋白(loricrin，LOR)、內(nèi)披蛋白(involucrin,IVL)和絲聚合蛋白(filaggrin，F(xiàn)LG)等相互交聯(lián)形成不溶性致密結(jié)構(gòu)[Kalinin,A.E.,Kajava,A.V.and Steinert,P.M.2002.Epithelial barrierfunction:assembly and structural features of the cornified cellenvelope.Bioessays 24:789.]。

FLG是表皮顆粒細(xì)胞角質(zhì)透明蛋白顆粒的主要成分，位于人類染色體1q2u1，即所謂的表皮分化復(fù)合體里面。越來越多的研究表明FLG基因表達(dá)異常(降低)會(huì)導(dǎo)致一些以皮膚干燥和皮膚屏障功能受損的疾病，如特異性皮炎(atopic dermatitis，AD)和尋常型魚鱗病。許多類型魚鱗病的研究發(fā)現(xiàn)表皮異常分化與染色體1q21有關(guān)，因此證明了魚鱗病的發(fā)生與FLG的基因表達(dá)缺失有關(guān)[Zhong W，Cui B，Zhang Y，et al.Linkage analysis suggests a locus of ichthyosis vulgaris on 1q22.J Hum Genet，2003，48:390-392.]。在對(duì)特異性皮炎(AD)患者皮膚的表達(dá)譜研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LG,LOR,IVL基因表達(dá)明顯降低，深入的研究認(rèn)為：尤其是FLG基因表達(dá)異常(下調(diào))成為AD患者皮膚屏障功能破壞的主要原因之一[Hitokazu Esaki,David A.Ewald,Benjamin Ungar，Krueger，Emma Guttman-Yassky.Identification of novel immune and barrier genes in atopic dermatitis by means of laser capture microdissection,J ALLERGY CLIN IMMUNOL,2015:135；153-163.][Katherine Grey,Sheilagh Maguiness.Atopic Dermatitis:Update for Pediatricians,PEDIATRIC ANNALS,2016:45；280-286.]。

目前，F(xiàn)LG基因表達(dá)異常(缺失)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已經(jīng)成為公認(rèn)的皮膚屏障功能障礙的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型[Gyohei Egawa,Kenji Kabashima,Altered stratum corneum barrier and enhanced percutaneous immune responses in filaggrin-null mice,J ALLERGY CLIN IMMUNOL,2012:129；1538-1546.]，但國(guó)內(nèi)未見此類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的報(bào)道。而國(guó)內(nèi)報(bào)道的，皮膚機(jī)械屏障功能障礙動(dòng)物模型制作方法僅見丙酮乙醚法和膠帶法。丙酮乙醚法既：將小鼠腿毛后，以脫脂棉蘸取丙酮－乙醚混合液(1：1)反復(fù)擦拭腿毛處皮膚，每天2次，連續(xù)5天處理皮膚。膠帶法既：用強(qiáng)力膠帶反復(fù)粘貼腿毛后皮膚，每天2次，連續(xù)造模5天處理皮膚。而丙酮乙醚法和膠帶法制作的皮膚機(jī)械屏障功能障礙動(dòng)物模型，操作過程繁瑣，不可控因素多，模型制備標(biāo)準(zhǔn)均一性較差，尤其是與臨床疾病模型相似性差。

Cre-loxp重組酶系統(tǒng)是條件性基因打靶、誘導(dǎo)性基因打靶、時(shí)空特異性基因打靶策略的技術(shù)核心。應(yīng)用Cre-loxp重組酶系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)條件性基因敲除技術(shù)，即實(shí)現(xiàn)目的基因在特定組織特定時(shí)間內(nèi)的敲除。目前，條件基因敲除動(dòng)物已經(jīng)成為用于研究某個(gè)特定基因在動(dòng)物體內(nèi)特定部位功能的較好的動(dòng)物模型。

角蛋白5(keratin5，K5)是皮膚表皮層的角質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的一種角蛋白。正常情況下，K5和K14二者成對(duì)表達(dá)，是角質(zhì)形成細(xì)胞分化的標(biāo)志物之一[Xunwei Wu,Fabio Quondamatteo,Tine Lefever,Aleksandra Czuchra,Hannelore Meyer,Anna Chrostek,Ralf Paus,Lutz Langbein,and Cord Brakebusch.Cdc42controls progenitor cell differentiation andβ-catenin turnover in skin.Genes Dev.2006 20:571-585.]。Cdc42全稱為細(xì)胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42)，大小為25×10³bp，基因定位于lp36.l，Cdc42是小G蛋白R(shí)ho家族蛋白中的重要成員，體內(nèi)的Cdc42有兩種形式，即GDP結(jié)合的無活性狀態(tài)與GTP結(jié)合的活性狀態(tài)。Cdc42在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中具有分子開關(guān)作用?；罨腃dc42通過作用于細(xì)胞內(nèi)一系列下游效應(yīng)底物來影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡和細(xì)胞周期等一系列重要生命現(xiàn)象[Jaime Melendez,Matthew Grogg and Yi Zheng.Signaling Role of Cdc42in Regulating Mammalian Physiology.J Biol Chem.2011；286(4):2375-2381.]。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于：獲得皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞Cdc42基因敲除小鼠作為皮膚屏障功能障礙的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。

發(fā)明人以K5-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠和Cdc42^loxp/loxp轉(zhuǎn)基因小鼠為基礎(chǔ)，利用Cre-Loxp條件性基因敲除技術(shù)，將2種小鼠雜交后獲得皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞Cdc42基因敲除小鼠，并進(jìn)一步證明在皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)Cdc42的表達(dá)明顯缺失。

在對(duì)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞Cdc42基因敲除(knockout，KO)小鼠的表型觀察中發(fā)現(xiàn)，KO小鼠脫屑增加，皮膚過度角化，皮膚薄弱部位點(diǎn)片狀潰瘍等皮炎表現(xiàn)。

在對(duì)小鼠進(jìn)行皮膚屏障功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)之一----通透性功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：KO組小鼠甲苯胺藍(lán)染料容易滲透，進(jìn)入皮膚深層。

進(jìn)一步對(duì)剛出生小鼠進(jìn)行皮膚屏障功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)之一：皮膚保水功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：KO組小鼠機(jī)體脫水速度明顯加快，皮膚保水功能破壞。

在對(duì)小鼠進(jìn)行皮膚組織學(xué)光鏡下觀察中發(fā)現(xiàn)：出生7周后，出現(xiàn)明顯脫毛表型的KO組小鼠皮膚組織，角質(zhì)層明顯增厚，松散，易脫落，皮膚過度角化。

在對(duì)小鼠進(jìn)行皮膚組織學(xué)掃描電子顯微鏡下觀察中發(fā)現(xiàn)：KO組小鼠皮膚組織表面更粗糙，角質(zhì)層細(xì)胞排列雜亂、松散。而野生型(wild type，WT)小鼠皮膚表面光滑，角質(zhì)層細(xì)胞排列整齊、有序、緊密。

在對(duì)小鼠進(jìn)行皮膚組織學(xué)透射電子顯微鏡下觀察中發(fā)現(xiàn)：KO組小鼠皮膚組織，角質(zhì)層細(xì)胞間脂質(zhì)層消失，基底細(xì)胞間間隙增加。

在對(duì)小鼠皮膚組織表皮內(nèi)3種皮膚屏障功能主要相關(guān)蛋白Filaggrin，Involucrin，Loricrin的表達(dá)情況研究中發(fā)現(xiàn)：KO組小鼠表皮內(nèi),構(gòu)成磚-墻結(jié)構(gòu)的Involucrine，Loricrine和Filaggrin三種蛋白表達(dá)明顯減少，尤其是Filaggrin的表達(dá)減少最明顯。

以上結(jié)果表明：獲得皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞Cdc42基因敲除小鼠，皮膚屏障功能明顯破壞。并且在基因的表達(dá)譜水平，與特異性皮炎(AD)等臨床皮膚屏障功能破壞類疾病相似，可作為皮膚屏障功能破壞類疾病的動(dòng)物模型用于基礎(chǔ)和臨床實(shí)驗(yàn)研究。

附圖說明

圖1轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建流程；

圖2轉(zhuǎn)基因小鼠組織PCR基因鑒定結(jié)果；

圖3轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚表皮細(xì)胞的Cdc42免疫組化染色結(jié)果；

圖4皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞Cdc42基因敲除小鼠皮膚的表型觀察；

圖5皮膚屏障功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)----甲苯胺藍(lán)染料對(duì)皮膚通透性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

圖6皮膚屏障功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)----皮膚保水功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

圖7小鼠皮膚組織學(xué)水平光鏡下觀察結(jié)果；

圖8小鼠皮膚組織學(xué)水平掃描電子顯微鏡下觀察結(jié)果；

圖9小鼠皮膚組織學(xué)水平透射電子顯微鏡下觀察結(jié)果；

圖10小鼠皮膚屏障功能主要相關(guān)蛋白filaggrin，involucrin，loricrin在小鼠皮膚組織的表達(dá)情況結(jié)果。

具體實(shí)施方式

一：轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建

發(fā)明人利用Cre/loxP重組酶系統(tǒng)，將Cdc42^loxp/loxp轉(zhuǎn)基因小鼠和K5-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行雜交，獲得的F1代小鼠基因型為Cdc42^loxp/+/-K5-Cre+。而后利用Cdc42^loxp/+/-K5-Cre+小鼠再與Cdc42^loxp/loxp轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，其后代獲取1/4比例Cdc42基因敲除(knockout)小鼠，簡(jiǎn)稱KO小鼠，基因型為Cdc42^loxp/loxp/-K5-Cre+；獲取1/2比例Cdc42基因未敲除(野生型)小鼠，簡(jiǎn)稱WT小鼠，基因型為Cdc42^loxp/+/K5-Cre-或Cdc42^loxp/loxp/-K5-Cre-。構(gòu)建流程如圖1所示。

通過PCR方法和Cdc42免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行基因水平和蛋白水平鑒定。

小鼠組織PCR基因鑒定：K5-Cre+為667bp特異條帶，Cdc42^loxP/loxP為700bp特異性條帶，WT為600bp特異性條帶；K5-Cre+且Cdc42^loxP/loxP的小鼠為KO小鼠，基因型為Cdc42^loxp/loxp-K5-Cre+(圖2)。皮膚表皮細(xì)胞的Cdc42免疫組化染色，可見KO小鼠皮膚角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Cdc42蛋白的表達(dá)明顯消失(圖3)，說明成功構(gòu)建皮膚角質(zhì)細(xì)胞Cdc42基因敲除小鼠。

(1)PCR反應(yīng)及免疫組織化學(xué)所用試劑：

異丙醇、75％乙醇、30％H2O2、瓊脂糖等為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑。

二抗試劑盒和DAB顯色試劑盒：生物素化羊抗小鼠IgG、生物素化羊抗兔IgG、鏈霉親和素‐生物素‐過氧化物酶復(fù)合物(SABC)、3，3‐二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)購(gòu)置武漢博士德公司，HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自Cell Signaling。

(2)溶液配制

Genotyping buffer配制：

配置后，將其放入4℃冰箱保存。

10×TAE buffer配制：

用HCl調(diào)節(jié)pH值至8.0，室溫保存。

1.5％瓊脂糖凝膠的配制：

瓊脂糖 3g

10×TAE buffer 20ml

dH₂O 180ml

微波(高火)加熱7min，待其冷卻至60℃，加入20ul的EB，輕搖混勻，倒入制膠槽，冷卻。

(3)基因組DNA的提取

A:從乳鼠的尾部或腳趾剪下少量組織置于1.5mlEP管，每管加入300ul genotyping buffer和7.5u1蛋白酶K(簡(jiǎn)稱PK，現(xiàn)用現(xiàn)加)，充分混勻。于50℃水浴消化過夜。

B:將消化好的組織充分搖勻，放入95℃恒溫器5min，滅火PK。

C:將EP管移至離心機(jī)，8000rpm，室溫離心5min。

D:小心轉(zhuǎn)移300u1上清液至新的標(biāo)記好編號(hào)的1.5mlEP管內(nèi)，加入等體積-20℃異丙醇，上下顛倒混勻，可見白色絮狀的DNA析出。

E:將EP管移至冰凍離心機(jī)，13000rpm，4℃離心10min。

F:棄去上清，加入300ul的-20℃75％乙醇洗滌沉淀。

G:將EP管移至冰凍離心機(jī)，13000rpm，4℃離心10min。

H:棄去上清，室溫風(fēng)干沉淀。

I:加入35ulddH2O溶解沉淀，紫外分光光度計(jì)下測(cè)定A260和A280吸光度，分析濃度和純度。

J:4℃保存DNA樣品備用。

(4)K5-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型鑒定

引物序列:

PCR反應(yīng)體系：

K5-Cre反應(yīng)條件：

94℃3min；95℃30sec，60℃1min，72℃1min；33cycles；72℃2min

Cdc42flox/flox反應(yīng)條件：

94℃5min；94℃30sec，60℃1min，72℃1min；33cycles；72℃8min

(5)免疫組織化學(xué)染色步驟

A:組織切片脫蠟、入水：二甲苯2×10min，梯度酒精(100％I、100％Ⅱ、95％、90％、80％、70％)各5min，下行入水；蒸餾水洗3min；

B:熱處理抗原修復(fù)：將組織切片置于一容器中并用10mM檸檬酸鈉緩沖液覆蓋，加熱至沸騰，煮沸3分鐘，斷電5分鐘，再次加熱沸騰，煮沸3分鐘，斷電，讓玻片在緩沖液中逐漸冷卻約20分鐘。蒸餾水清洗3×2min。

C:去除內(nèi)源性過氧化物酶：組織切片滴加3％H2O2，RT下孵育10min；

D:TBST清洗：3×5min；

E:血清封閉：1.5％山羊血清封閉液室溫封閉1h；

F:一抗孵育：一抗1:50(用血清封閉液稀釋一抗)，4℃過夜。

G:TBST清洗：3×5min；

H:二抗孵育：滴加1:200熒光素標(biāo)記羊抗小鼠IgG，RT孵育1h，避光。

注意：以下步驟均需要避光

I:TBST清洗：3×5min；

J:Hoechst孵育：滴加1:400熒光素標(biāo)記羊抗小鼠IgG，RT孵育10min。

K:TBS清洗：3×5min；

L:水溶性甘油封片、光鏡觀察。

二：轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚功能的改變

為觀察小鼠皮膚屏障功能變化，對(duì)小鼠進(jìn)行通透性功能檢測(cè)---甲苯胺藍(lán)染料滲透實(shí)驗(yàn)(圖5)：甲苯胺藍(lán)染料滲透實(shí)驗(yàn)步驟：

A:脫水：25％甲醇2min，50％甲醇2min，75％甲醇2min，100％甲醇2min；

B:再水化：100％甲醇2min，75％甲醇2min，50％甲醇2min，25％甲醇2min；

C:PBS洗2min；

D:0.1％甲苯胺藍(lán)染色(PBS溶解，質(zhì)量體積比)5min；

E:PBS洗2min；

F:觀察、拍照。

為進(jìn)一步觀察小鼠皮膚屏障功能變化，對(duì)出生第一天小鼠進(jìn)行皮膚保水功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)(圖6)。

實(shí)驗(yàn)方法：對(duì)出生第一天小鼠，在非哺乳的條件下，每隔2小時(shí)進(jìn)行體重稱量，既稱取0hour，2hour，4hour，6hour體重，然后用稱取的2hour，4hour，6hour體重減去0小時(shí)小鼠體重，即為小鼠脫水量，將KO,WT兩組小鼠脫水量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

為觀察小鼠皮膚組織學(xué)改變，對(duì)小鼠進(jìn)行皮膚組織光鏡，掃描電鏡和投射電鏡下觀察(見圖7，8,9)。

取出生后8周(P8weeks)和12周(P12weeks)的KO小鼠和WT小鼠皮膚，并將其放入4％多聚甲醛中固定、石蠟包埋、切片和染色。

光鏡觀察H.E.染色步驟：

A:脫蠟：二甲苯I、II各10min。

B:復(fù)水：梯度酒精(100％I、100％II、95％、90％、80％、70％)至水，各3min。

C:蘇木精染色：15min，自來水輕輕沖洗返藍(lán)。1％鹽酸酒精分色幾秒，自來水輕輕沖洗，觀察。

D:脫水以及伊紅染色：70％、80％、伊紅染液(1min)、90％I、90％II、95％、100％I、II酒精各5min。

E:透明：二甲苯I、II各10min。

F:中性樹脂封片，37℃烘干，長(zhǎng)期保存,光鏡觀察。

掃描電鏡和透射電鏡標(biāo)本處理過程：

脫毛后切取p8weeks小鼠背部皮膚(長(zhǎng)寬為：1cm×1mm)，置入2.5％電鏡級(jí)戊二醛中固定24h，PBS漂洗(4×30min)，鋨酸固定1h，PBS漂洗(3×5min)，丙酮梯度脫水：50％丙酮10min→70％丙酮15min→90％丙酮15min→100％丙酮15min(4次)，浸透組織用丙酮與樹脂按比例依次1：1(1h，RT)，1：2(2h，RT)，純樹脂(over night，RT)，樹脂包埋，修塊、掃描/透射電鏡染色，分別行掃描和透射電鏡觀察。

為觀察與皮膚屏障功能密切相關(guān)的角質(zhì)套膜結(jié)構(gòu)變化，對(duì)小鼠皮膚組織表皮內(nèi)構(gòu)成角質(zhì)套膜結(jié)構(gòu)的主要相關(guān)蛋白filaggrin，involucrin，loricrin的表達(dá)情況進(jìn)行免疫熒光化學(xué)染色研究(圖10)。

免疫熒光化學(xué)染色步驟：

A:組織切片脫蠟、入水：二甲苯2×10min，梯度酒精(100％I、100％Ⅱ、95％、90％、80％、70％)各5min，下行入水；蒸餾水洗3min；

B:熱處理抗原修復(fù)：將組織切片置于一容器中并用10mM檸檬酸鈉緩沖液覆蓋，加熱至沸騰，煮沸3分鐘，斷電5分鐘，再次加熱沸騰，煮沸3分鐘，斷電，讓玻片在緩沖液中逐漸冷卻約20分鐘。蒸餾水清洗3×2min。

C:去除內(nèi)源性過氧化物酶：組織切片滴加3％H2O2，RT下孵育10min；

D:TBST清洗：3×5min；

E:血清封閉：1.5％山羊血清封閉液室溫封閉1h；

F:一抗孵育：一抗1:50(用血清封閉液稀釋一抗)，4℃過夜。

G:TBST清洗：3×5min；

H:二抗孵育：滴加1:200熒光素標(biāo)記羊抗小鼠IgG，RT孵育1h，避光。

注意：以下步驟均需要避光

I:TBST清洗：3×5min；

J:Hoechst孵育：滴加1:400熒光素標(biāo)記羊抗小鼠IgG，RT孵育10min。

K:TBS清洗：3×5min；

L:水溶性甘油封片,正置熒光顯微鏡觀察。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方醫(yī)科大學(xué)

<120> 基因敲除動(dòng)物作為皮膚屏障功能障礙動(dòng)物模型的應(yīng)用

<130> K5-Cre

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

ctcttcaggg tcttcagtgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 2

catcttgtcc ctgaagtcgc 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

agacaaaaca acaaggtcca gaaac 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

tacagttggt acatattccg atggg 25