本發(fā)明涉及植物小分子核糖核蛋白RNA(srRNA-348-25)在害蟲防治中的應(yīng)用，具體涉及植物來源srRNA-348-25影響昆蟲生長的這一功能，從而圍繞srRNA-348-25開展轉(zhuǎn)基因或抑制劑研發(fā)，達(dá)到害蟲防治的目的。

背景技術(shù)：

自從1993年發(fā)現(xiàn)小分子干擾RNA以來，大量各類小分子RNA被發(fā)現(xiàn)，包括了miRNAs、siRNAs、piRNAs和snRNAs等。miRNA是一類長度約21～24核苷酸非編碼的小分子RNA，廣泛存在于動、植物體中。一系列實驗表明miRNA可能是一類在進(jìn)化上保守的、在生物體中具有重要調(diào)控作用的分子。miRNA源自細(xì)胞核內(nèi)編碼miRNA的基因轉(zhuǎn)錄成pri-microRNA，接著被Drosha酶剪切為長度約70bp呈發(fā)夾狀的pre-miRNA，隨后被核質(zhì)/細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中，之后被Dicer酶剪切成長為18-26bp的miRNA雙螺旋復(fù)合體。其中一條解螺旋，并與AGO蛋白結(jié)合，并形成非對稱的RISC復(fù)合物。這個復(fù)合物通過其中的miRNA與靶mRNA的3’UTR互補(bǔ)配對結(jié)合，從而降解靶目標(biāo)mRNA或阻斷其翻譯，實現(xiàn)對靶標(biāo)基因的負(fù)調(diào)控。已有大量文獻(xiàn)報道，miRNA在基因表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物發(fā)育、抵抗脅迫、預(yù)防疾病等方面起著至關(guān)重要的作用。近年來一類來源于核糖核蛋白DNA的小分子RNA(srRNAs)被發(fā)現(xiàn)具有類似miRNA的功能。例如從人類和老鼠的小分子RNA高通量測序結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)大量的srRNAs是可以和核糖核蛋白DNA配對的，同時免疫共沉淀實驗表明這些srRNA可以和AGO結(jié)合；實驗還表明一些srRNA可能參與了調(diào)控糖尿病的相關(guān)代謝途徑(Haibin Wei,Ben Zhou,Fang Zhang,Yanyang Tu,Yanan Hu,Baoguo Zhang,Qiwei Zhai.Profiling and Identification of Small rDNA-Derived RNAs and Their Potential Biological Functions.PLOS ONE.2013.8(2):e56842)。但是srRNA的研究報道極少，更沒有在昆蟲與植物關(guān)系方面的研究報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明在對害蟲斜紋夜蛾進(jìn)食芥菜的差異小分子RNA進(jìn)行測序分析時，發(fā)現(xiàn)了表達(dá)量顯著下調(diào)的srRNA-348-25：5’-GUCGGGAGGGAAGCGGAUGGGGGCC-3’(SEQ ID NO:1)并鑒定為植物中普遍存在的保守序列。注射srRNA-348-25片段進(jìn)入蟲體，進(jìn)食植物葉片的斜紋夜蛾死亡率顯著增加。由于srRNA-348-25為植物小分子核糖核蛋白RNA，較多的存在于富含蛋白的植物中，如大豆，特別在加熱的大豆中，因此，該片段對人是安全的。可用作為安全有效的防治植食性害蟲的新型殺蟲劑，可直接使用及轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明的目的在于提供植物srRNA-348-25在制備殺蟲劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種植物小分子核糖核蛋白RNA在制備殺蟲劑中的應(yīng)用，所述小分子核糖核蛋白RNA為srRNA-348-25，其堿基序列如SEQ ID NO：1所示。

進(jìn)一步的，所述殺蟲劑能夠殺滅植食性蟲體，或抑制植食性蟲體的生長。

進(jìn)一步的，所述植食性蟲體為鱗翅目植食性昆蟲、同翅目植食性昆蟲。

進(jìn)一步的，所述鱗翅目和同翅目昆蟲為斜紋夜蛾、蠶、稻飛虱。

一種殺蟲劑，該殺蟲劑中含有srRNA-348-25，其堿基序列如SEQ ID NO：1所示。

一種植物蟲害防治的方法，其特征在于：使植物體過表達(dá)小分子核糖核蛋白RNA srRNA-348-25，srRNA-348-25堿基序列如SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一種植物小分子核糖核蛋白RNA(srRNA-348-25)對植食性害蟲生長具有抑制作用，甚至能夠促進(jìn)植食性害蟲的死亡，由于srRNA-348-25是人類食用植物中的成分，對人類安全，可用作安全有效的防治植食性害蟲的新型殺蟲劑，可直接使用及轉(zhuǎn)基因植物；因此srRNA-348-25轉(zhuǎn)基因植物(即植物體過表達(dá)srRNA-348-25)進(jìn)行害蟲防治將有著實際的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為注射srRNA-348-25后斜紋夜蛾幼蟲進(jìn)食芥菜后的死亡情況；圖中NC mimic即為NC(無義片斷)對照組，sr-348-25為srRNA-348-25的簡稱；

圖2為注射srRNA-348-25 72h后斜紋夜蛾幼蟲的生長情況；圖中sr-348-25為srRNA-348-25的簡稱；

圖3為srRNA-348-25在不同植物中的表達(dá)水平；圖中食物為斜紋夜蛾蟲體人工培養(yǎng)基，經(jīng)加熱而成；圖中豆粉、麥麩為未加熱的材料；芥菜為其葉片；

圖4不同原料中srRNA-348-25的相對含量檢測；

圖5為斜紋夜蛾進(jìn)食芥菜(B.juncea)和培養(yǎng)基(CK)后中腸srRNA-348-25含量的檢測；

圖6為注射srRNA-348-25進(jìn)入斜紋夜蛾幼蟲后解毒酶SlGSTe1表達(dá)下調(diào)，圖中NC為注射無義序列的對照組；

圖7為分別喂食含srRNA-348-25的培養(yǎng)基和芥菜的斜紋夜蛾生長的比較；

圖8為多種植物基因組中srRNA-348-25序列的比較分析；

圖9為分別注射2μg srRNA-348-25和無義序列(NC)的家蠶表型；

圖10為srRNA-348-25增加稻飛虱的死亡率。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。

本發(fā)明的研究過程如下所述：

為了研究雜食性農(nóng)業(yè)害蟲斜紋夜蛾適應(yīng)植物的機(jī)制，我們分別對進(jìn)食含大豆和麥麩的人工培養(yǎng)基以及芥菜葉片的斜紋夜蛾中腸，進(jìn)行了高通量小分子RNA測序與分析，發(fā)現(xiàn)了斜紋夜蛾中腸差異表達(dá)最大的小分子RNA，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該小分子RNA不與斜紋夜蛾基因組序列配對，而是存在植物基因組中，是26S rRNA的一段序列，屬于小分子核糖核蛋白RNA，命名為srRNA-348-25。

srRNA-348-25在蛋白含量高的培養(yǎng)基中含量高，而在芥菜葉中含量很低；并且它在加熱培養(yǎng)基中的含量高于不加熱培養(yǎng)基，說明了它可能是蛋白復(fù)合體的降解產(chǎn)物。因此在進(jìn)食芥菜后的斜紋夜蛾中腸中srRNA-348-25含量極低，但如果增加它在斜紋夜蛾體內(nèi)的含量，斜紋夜蛾進(jìn)食芥菜葉會導(dǎo)致死亡。

分析斜紋夜蛾進(jìn)食培養(yǎng)基和芥菜后的中腸中的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)斜紋夜蛾以蛋白水解酶應(yīng)對大豆的高蛋白、以解毒酶應(yīng)對毒性的植物次生物質(zhì)。分析srRNA-348-25的靶基因，發(fā)現(xiàn)它可能抑制解毒酶基因，而不作用蛋白水解酶。因此，斜紋夜蛾進(jìn)食高含量srRNA-348-25的培養(yǎng)基并不死亡，但體內(nèi)含高劑量srRNA-348-25的斜紋夜蛾進(jìn)食芥菜后死亡率大增。所以可利用srRNA-348-25防治斜紋夜蛾。

由于srRNA-348-25在植物葉中含量極低，那么srRNA-348-25是否也可以用于防治進(jìn)食其他植食性昆蟲？我們分別注射srRNA-348-25進(jìn)入鱗翅目的家蠶和同翅目的稻飛虱，它們進(jìn)食植物后死亡率增加。由于srRNA-348-25是人類食用植物中的成分，對人類安全，因此srRNA-348-25轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行害蟲防治將有著實際的應(yīng)用價值。

實施例1srRNA-348-25抑制斜紋夜蛾進(jìn)食芥菜后的生長和存活

實驗方法：

選取大小一致、健康狀況一致的五齡第一天斜紋夜蛾幼蟲，稱量每頭蟲子的重量，隨機(jī)分為srRNA-348-25處理組和NC對照組(無義片段)，每組40頭，重復(fù)實驗3次。順血液循環(huán)流動方向，用微量注射器從斜紋夜蛾幼蟲的側(cè)腹部第一和第二腹足之間，分別注射srRNA-348-25和NC(無義片段)，注射量為每頭蟲4μg，注射后喂食芥菜。注射后第1、2、3天觀察蟲子的形態(tài)變化并拍照取證，每天統(tǒng)計蟲子的死亡率。

上述srRNA-348-25序列為：5’-GUCGGGAGGGAAGCGGAUGGGGGCC-3’(SEQ ID NO：1)。

實驗結(jié)果：

實驗檢測結(jié)果如圖1和圖2所示，圖1為注射srRNA-348-25后斜紋夜蛾幼蟲進(jìn)食芥菜后的死亡情況；從中可以看出注射srRNA-348-25的斜紋夜蛾幼蟲在進(jìn)食芥菜24h、48h和72h后的死亡率分別達(dá)77.50％、92.45％和92.45％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組(NC)的6.91％、8.69％和8.69％。圖2為注射srRNA-348-25或無義片段(NC)的斜紋夜蛾幼蟲在進(jìn)食芥菜72h后的生長情況，從中可以看出在srRNA-348-25處理組中存活的幼蟲瘦小，而NC對照組的幼蟲明顯肥大許多。

上述結(jié)果說明srRNA-348-25抑制斜紋夜蛾進(jìn)食芥菜后的生長和存活。

實施例2srRNA-348-25的來源及其對斜紋夜蛾蟲體的影響

為了研究小分子RNA調(diào)控雜食性農(nóng)業(yè)害蟲斜紋夜蛾適應(yīng)植物的機(jī)制，分別對進(jìn)食含大豆和麥麩的人工培養(yǎng)基以及芥菜葉片的斜紋夜蛾中腸，進(jìn)行了高通量小分子RNA測序與分析，發(fā)現(xiàn)了斜紋夜蛾中腸差異表達(dá)最大的一個小分子RNA，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該小分子RNA不與斜紋夜蛾基因組序列配對，而是存在植物基因組中，是26S rRNA的一段序列，屬于小分子核糖核蛋白RNA，命名為srRNA-348-25。

一、srRNA-348-25在不同植物中的表達(dá)情況

實驗方法：

分別將斜紋夜蛾蟲體人工培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基中含黃豆粉100g、麥麩80g、酵母粉26g、干酪素8g、維生素C 8g、氯化膽堿1g、山梨酸2g、膽固醇0.2g、肌醇0.2g和瓊脂粉26g)、豆粉、麥麩、芥菜葉片按Trizol法抽提總RNA，測定濃度后取2μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(參考TAKARA的One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行)，得到的cDNA產(chǎn)物稀釋后用于qRT-PCR的模板，進(jìn)一步qRT-PCR檢測srRNA-348-25在各個樣本中的表達(dá)水平。結(jié)果分析采用相對定量的方法來確定目標(biāo)基因相對內(nèi)標(biāo)基因(GAPDH，HQ012003)的相對表達(dá)倍數(shù)。應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件，采用ANOVA(多個處理間的兩兩比較)或獨(dú)立樣本T檢驗(兩個樣品間比較)來進(jìn)行處理間的差異比較分析。

實驗結(jié)果：

檢測結(jié)果如圖3所示，從中可以看出，人工培養(yǎng)基(食物)中的srRNA-348-25含量最高，豆粉中的srRNA-348-25含量也明顯高于麥麩，表明培養(yǎng)基中的高含量srRNA-348-25可能主要是由豆粉所致；然而芥菜葉片中的srRNA-348-25含量非常低。

實驗方法：

為了進(jìn)一步明確豆粉加熱后srRNA-348-25含量可能會增加，分別取0.1g豆粉、0.1g麥麩、0.1g按1:1混合的豆粉和麥麩的混合物(其中分別設(shè)置了未加熱的及按培養(yǎng)基加熱方式處理后的豆粉和麥麩混合物、0.1g水稻葉片、0.1g花生葉片、0.1g酵母，進(jìn)行與上述完全相同的RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR等操作，分別各取1μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和相同體積的PCR。

實驗結(jié)果：

檢測結(jié)果如圖4所示，從中可以看出，豆粉中的srRNA-348-25的表達(dá)量遠(yuǎn)高于在麥麩、花生和水稻葉片中的；加熱后的豆粉和麥麩混合物中srRNA-348-25表達(dá)量相對未加熱的明顯增加，表明豆粉中的蛋白加熱后，較多核糖核蛋白體RNA生成小分子RNA。

上述結(jié)果提示srRNA-348-25在植物葉片中含量很低；在蛋白含量高的培養(yǎng)基中的含量高，并且在加熱后的培養(yǎng)基中的含量高于不加熱培養(yǎng)基，進(jìn)一步說明srRNA-348-25可能是蛋白復(fù)合體的降解產(chǎn)物。

二、斜紋夜蛾進(jìn)食芥菜后srRNA-348-25的相對含量檢測

將五齡第二天的斜紋夜蛾分為2組，每組分別喂食芥菜葉片(B.juncea)和人工培養(yǎng)基(CK)，分別于喂食后12h和48h，檢測斜紋夜蛾中腸中srRNA-348-25的含量情況。

檢測結(jié)果如圖5所示，從中可以看出，無論是進(jìn)食后12h或48h，斜紋夜蛾進(jìn)食芥菜后其體內(nèi)的srRNA-348-25的含量較進(jìn)食培養(yǎng)基的少。由于培養(yǎng)基中srRNA-348-25含量遠(yuǎn)高于芥菜葉中的含量(圖3)，因此本結(jié)果表明斜紋夜蛾進(jìn)食后中腸中srRNA-348-25的含量與其在食物中srRNA-348-25的含量成正比。由于昆蟲在長期的進(jìn)化中對不同的食物形成了不同的適應(yīng)機(jī)制，斜紋夜蛾分別進(jìn)食含有不同含量srRNA-348-25的培養(yǎng)基和或芥菜片時均不會死亡。然而我們的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)增加斜紋夜蛾體內(nèi)srRNA-348-25含量(體外注射srRNA-348-25)后再進(jìn)食芥菜時，斜紋夜蛾生長受抑制且死亡率增加(見圖1和圖2)。

實施例3srRNA-348-25抑制進(jìn)食芥菜后斜紋夜蛾生長且促進(jìn)其死亡的機(jī)制

一、srRNA-348-25的作用靶標(biāo)

為了進(jìn)一步研究srRNA-348-25抑制斜紋夜蛾生長且促進(jìn)其死亡的可能機(jī)制，我們將斜紋夜蛾進(jìn)食培養(yǎng)基后再轉(zhuǎn)進(jìn)食芥菜，然后分別在轉(zhuǎn)進(jìn)食芥菜后的0、6、48h采集樣品進(jìn)行高通量測序，分析差異表達(dá)基因，如表1和表2所示。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)進(jìn)食芥菜后，斜紋夜蛾中腸的許多蛋白水解酶表達(dá)下調(diào)(表1)，而許多應(yīng)對芥菜次生物質(zhì)的解毒酶的表達(dá)量上調(diào)(表2)。進(jìn)而將srRNA-348-25與表1和表2中具有表達(dá)差異的靶基因序列進(jìn)行配對分析，檢測srRNA-348-25可能作用的靶標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)srRNA-348-25與檢測到的具有表達(dá)差異的蛋白水解酶基因不具有結(jié)合有可能性(完全不配對)；但與表2中檢測到的一些解毒酶等基因具體有結(jié)合的可能性；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，srRNA-348-25可能與解毒酶基因Slgste1(這是一個保障斜紋夜蛾應(yīng)對芥菜次生物質(zhì)的重要基因，它在斜紋夜蛾進(jìn)食培養(yǎng)基時幾乎不表達(dá)，可參見Xiaopeng Zou,Zhibin Xu,Haiwang Zou,Jisheng Liu,Qili Feng,Sichun Zheng.Glutathione S-transferase SlGSTE1in Spodoptera litura may be involved in feeding preference of host plants.Insect Biochemistry and Molecular Biology,2016，70:32-43)的3’非編碼區(qū)具有結(jié)合作用。

表1.斜紋夜蛾從進(jìn)食培養(yǎng)基轉(zhuǎn)進(jìn)食芥菜后表達(dá)差異顯著的蛋白水解酶基因數(shù)統(tǒng)計

表2.斜紋夜蛾從進(jìn)食培養(yǎng)基轉(zhuǎn)進(jìn)食芥菜后表達(dá)差異顯著的解毒酶基因數(shù)統(tǒng)計

為了進(jìn)一步研究srRNA-348-25是否作用于解毒酶基因Slgste1，我們將srRNA-348-25注射進(jìn)入五齡的斜紋夜蛾幼蟲，檢測Slgste1基因的在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況；檢測結(jié)果如圖6所示，從中可以看出，注射srRNA-348-25后，斜紋夜蛾幼蟲體內(nèi)Slgste1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平明顯降低，說明srRNA-348-25抑制Slgste1基因表達(dá)。

二、表型分析

實驗方法：

一共設(shè)置5組實驗，各組處理情況如下：

對照組(單純水)：給斜紋夜蛾單純喂食水，如圖7A；

實驗組(單純水srRNA)：給斜紋夜蛾單純喂食srRNA-348-25，與水比較，證明srRNA-348-25是否無毒性，如圖7A；

對照組(培養(yǎng)基)：使斜紋夜蛾進(jìn)食人工培養(yǎng)基，如圖7B；

實驗組(2μg srRNA+培養(yǎng)基)：使斜紋夜蛾進(jìn)食含2μg srRNA-348-25的人工培養(yǎng)基，如圖7B和圖7C；

實驗組(2μg srRNA+芥菜)：使斜紋夜蛾進(jìn)食含2μg srRNA-348-25的芥菜，如圖7C；

按照上述處理，分別觀察各組斜紋夜蛾幼蟲的生長和死亡情況。

觀察結(jié)果如圖7所示，從圖7A中可以看出，單純的2μg srRNA-348-25不影響斜紋夜蛾的生長發(fā)育，說明srRNA-348-25可能不作用任何與生長相關(guān)的基因；從圖7B中可以看出，進(jìn)食含2μg srRNA-348-25的培養(yǎng)基的斜紋夜蛾與進(jìn)食單純培養(yǎng)基的斜紋夜蛾相比，生長并沒有受到抑制，表明srRNA-348-25也不調(diào)控與培養(yǎng)基成分相關(guān)的基因如蛋白水解酶的表達(dá)；從圖7C中可以看出，進(jìn)食含2μg srRNA-348-25的培養(yǎng)基和芥菜的斜紋夜蛾，后者的生長明顯小于前者，說明當(dāng)蟲體富集2μg srRNA-348-25時再食用芥菜會抑制斜紋夜蛾的生長，促進(jìn)蟲體的死亡，其中的作用機(jī)制很可能是由于srRNA-348-25抑制了Slgste1等解毒酶基因(蟲體分解有毒的植物次生物質(zhì)所必需的酶)的表達(dá)，使芥菜的毒性增加，最終導(dǎo)致蟲體的進(jìn)食與生長受阻，從而促進(jìn)蟲體的死亡。

實施例4不同植物基因組中srRNA-348-25序列的比較分析

由于srRNA-348-25序列無法在斜紋夜蛾基因組中找到配對的序列，因此我們分別選取了幾個植物基因組進(jìn)行了比較分析，包括了大豆(基因庫序列號：dbj|LB172039.1)、上羊草(基因庫序列號：gb|AOCO010307372.1)；擬南芥(基因組編號：TAIRIO)。比對結(jié)果如圖8所示，srRNA-348-25在植物中非常保守，是26s rRNA的一段序列，這解釋了為什么它在高蛋白的大豆中含量較高，而在各類植物的葉片中含量皆低。因此，理論上轉(zhuǎn)基因srRNA-348-25，增加各類植物的葉片它的含量，都有可能會到導(dǎo)致進(jìn)食該類植物的害蟲產(chǎn)生不良的反應(yīng)。

實施例5srRNA-348-25抑制家蠶的生長

由于srRNA-348-25在植物葉中含量極低，那么srRNA-348-25是否也可以用于防治進(jìn)食其他植食性昆蟲？本實施例對鱗翅目的家蠶進(jìn)行了相應(yīng)的研究。

分別取5齡3天的家蠶，注射2μg srRNA-348-25和無義對照序列，注射完后是否還要對家蠶進(jìn)食桑葉，觀察家蠶的生長情況。

觀察結(jié)果如圖9所示，從中可以看出，注射srRNA-348-25后72天，家蠶的生長情況明顯受到抑制，生長抑制率為100％。

實施例6srRNA-348-25促進(jìn)稻飛虱的死亡

由于srRNA-348-25在植物葉中含量極低，那么srRNA-348-25是否也可以用于防治進(jìn)食其他植食性昆蟲？本實施例對水稻的主要害蟲同翅目的稻飛虱分別注射0.2μg srRNA-348-25和無義序列(對照組)，注射體積為0.2μl，注射完后是否還要對稻飛虱進(jìn)食水稻葉(即注射完后將稻飛虱放到水稻中)，觀察稻飛虱的生長情況。

觀察結(jié)果如圖10所示，從中可以看出，注射srRNA-348-25后2天，srRNA-348-25的死亡率為86％，而對照組的死亡率僅為33％。

上述結(jié)果說明增加稻飛虱體內(nèi)srRNA-348-25的含量，也會促使稻飛虱進(jìn)食水稻葉后的死亡率，進(jìn)一步證明srRNA-348-25能夠促進(jìn)植食性的昆蟲的死亡率。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南師范大學(xué)

<120> 一種植物小分子核糖核蛋白RNA在害蟲防治中的應(yīng)用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gucgggaggg aagcggaugg gggcc 25