本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種滇黃精的組培快繁方法。
背景技術(shù)：
黃精為百合科多年生草本植物黃精、滇黃精或多花黃精的根莖，具有潤肺滋陰、補(bǔ)中益氣、益腎增精的作用。近代研究表明，黃精含有煙酸、醒類、豁液質(zhì)、淀粉、二氨基丁酸、黃精多糖及低聚糖等成分，有麻醉及降低動(dòng)物血壓的作用，對(duì)腎上腺素引起的血糖過高有抑制作用，對(duì)改善腎功能也有較好功效。黃精還是一味抗菌良藥，對(duì)傷寒桿菌、結(jié)核桿菌、金黃色葡萄球菌及皮膚癬菌等均有一定抑制作用。近年來，黃精已廣泛用于冠心病、高血壓、糖尿病、肺結(jié)核、再生障礙貧血、以及預(yù)防放療、化療引起的副作用等。由此可見，黃精的市場應(yīng)用前景廣闊，然而隨著市場需求量的不斷增加和野生資源的不斷減少，黃精的人工栽培已成為市場供求的主體。目前，黃精的繁殖方式主要有性（種子）繁殖和無性（根莖）繁殖兩種方式。由于黃精種子難收集，種子發(fā)芽率低，而且種子繁殖時(shí)間長。不利于黃精的人工大面積種植，所以在當(dāng)前黃精的人工栽培中，繁殖主要依靠根莖的無性繁殖，該方法繁殖系數(shù)低、根莖的用量大，既不經(jīng)濟(jì)，又限制了黃精的產(chǎn)量潛力，不便于栽培管理推廣。因此，研制開發(fā)一種成本低、繁殖系數(shù)高、繁殖速度快、技術(shù)穩(wěn)定、可在短時(shí)間內(nèi)提供大量優(yōu)質(zhì)黃精種苗的滇黃精的組培快繁方法是客觀需要的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決背景技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種成本低、繁殖系數(shù)高、繁殖速度快、技術(shù)穩(wěn)定、可在短時(shí)間內(nèi)提供大量優(yōu)質(zhì)黃精種苗的滇黃精的組培快繁方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種滇黃精的組培快繁方法，包括以下幾個(gè)步驟：
①外殖體的選擇與處理:選取成熟、新鮮、無病蟲害的滇黃精根莖，用刀切取帶芽的根莖置于洗潔精水溶液中浸泡，浸泡1～3min后將其用流水清洗干凈，然后用體積分?jǐn)?shù)為70～75%的酒精浸泡1～2min，用無菌水反復(fù)沖洗2～3次，最后放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1～0.3%的氯化汞中反復(fù)浸泡滅菌3～5次，每次浸泡的時(shí)間為3～5min，每次浸泡后須用無菌水沖洗2～3次,沖洗干凈后再用無菌濾紙將無菌水吸干，用刀切去傷口壞死的部分即可進(jìn)行接種；
②誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟①中消毒處理后的根莖接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，在培養(yǎng)溫度為23～28℃，光照強(qiáng)度為2000～2500Lux，光照時(shí)間為12～16h/天的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)20～30天后根莖部分膨大，根莖的切口處誘導(dǎo)出淡黃色致密的愈傷組織，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基+1.0～3.0mg/L6-BA+0.5～1.0mg/L2,4-D+1.0～2.0mg/L赤霉素+5.0～10.0g/L瓊脂+20.0～30.0g/L蔗糖；
③繼代培養(yǎng)：先將步驟②中誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，在培養(yǎng)溫度為23～28℃，光照強(qiáng)度為2000～2500Lux，光照時(shí)間為12～16h/天的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)20～30天分化出新的幼芽；所述繼代培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+3.0～4.5mg/L6-BA+2.0～3.0mg/L62BA +3.0～5.0mg/L玉米素+0.2～1.0mg/LNAA+1.0～3.0g/L瓊脂+5.0～10.0g/L蔗糖；
④增殖培養(yǎng)：將步驟③中繼代培養(yǎng)成功的帶有幼芽的根莖切成0.4～0.8cm3的小塊，然后接種于增殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23～28℃，光照強(qiáng)度為2000～2500Lux，光照時(shí)間為12～16h/天的條件下培養(yǎng)20～30天后獲得分化苗；所述增殖培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+2.0～4.0mg/L6-BA+0.5～1.5mg/L2,4D+0.5～1.0 mg/L GA3 +6.0～8.0g/L瓊脂+20.0～25.0g/L蔗糖；
⑤生根培養(yǎng)：待步驟④中增殖培養(yǎng)得到的分化苗長至2～4cm時(shí)，先將分化苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，在培養(yǎng)溫度為23～28℃，光照強(qiáng)度為2000～2500Lux，光照時(shí)間為12～16h/天的條件下培養(yǎng)20～30天后可觀察到分化苗長出3～6條根須，根須長度為2～4cm，然后將分化苗移至自然光下培養(yǎng)，培養(yǎng)10天后即可進(jìn)行組培苗的移栽，所生根培養(yǎng)基為：1/2MS培養(yǎng)基 +0.2～1.0mg/LNAA +0.2～0.6mg/LIBA+0.2～0.5%活性炭+5～20%香蕉 +6.0～8.0g/L瓊脂+20.0～25.0g/L蔗糖；
⑥煉苗移栽：將步驟⑤中培養(yǎng)得到的組培苗從生根培養(yǎng)基中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基后，將組培苗移栽至苗床的育苗基質(zhì)中，移栽初期需搭建小拱棚，覆蓋透明塑料布，適當(dāng)遮蔭，保持環(huán)境溫度20～25℃，空氣濕度70～80%，每隔7天噴施1次營養(yǎng)液，15天后除去塑料布，逐漸通風(fēng)，增加光照，轉(zhuǎn)入常規(guī)管理，30～40天即可進(jìn)行大田移栽。
本發(fā)明利用植物組培方法建立了滇黃精的快速繁殖體系，通過將黃精的根莖反復(fù)多次短時(shí)滅菌清洗，減少了污染，降低了滅菌劑對(duì)外殖體的損傷，經(jīng)消毒處理后的外殖體經(jīng)過組培培育，及可產(chǎn)生大量的種苗，從塊莖到生根苗只需要6～8個(gè)月的時(shí)間。本發(fā)明在繁殖的過程中通過對(duì)各種的培養(yǎng)基、用量和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，不僅不僅有效的縮短了種苗培育的時(shí)間和成本，提高快繁的速度，而且有效的提高了黃精的繁殖系數(shù)，能較好的保持黃精的遺傳穩(wěn)定性，利用本方法的繁殖體系，其黃精幼芽的發(fā)芽率可達(dá)到99%以上，增殖培養(yǎng)后的成苗率達(dá)到96%以上，生根培養(yǎng)后生根率為99%以上，移栽后的成活率可達(dá)到98%以上，一個(gè)不定芽的根莖一次就可以繁殖出百萬株的無性后代，該方法既可以為黃精的商品化生提供一套可行的生產(chǎn)技術(shù)路線，能為植物轉(zhuǎn)基因的研究提供了理想的材料，又能創(chuàng)造較好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1：
本實(shí)施例的具體步驟如下：
①外殖體的選擇與處理:選取成熟、新鮮、無病蟲害的滇黃精根莖，用刀切取帶芽的根莖置于洗潔精水溶液中浸泡，浸泡1min后將其用流水清洗干凈，然后用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精浸泡1～2min，用無菌水反復(fù)沖洗2次，最后放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞中反復(fù)浸泡滅菌3次，每次浸泡的時(shí)間為5min，每次浸泡后須用無菌水沖洗2～3次, 所述氯化汞中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的土溫20，沖洗干凈后再用無菌濾紙將無菌水吸干，用刀切去傷口壞死的部分即可進(jìn)行接種；
②誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟①中消毒處理后的根莖接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，在培養(yǎng)溫度為23℃，光照強(qiáng)度為2500Lux，光照時(shí)間為12h/天的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)25天后根莖部分膨大，根莖的切口處誘導(dǎo)出淡黃色致密的愈傷組織，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基+3.0mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D+1.0mg/LKT+0.1mg/LNAA +1mg/L赤霉素+5g/L瓊脂+20g/L蔗糖；
③繼代培養(yǎng)：先將步驟②中誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，在培養(yǎng)溫度為28℃，光照強(qiáng)度為2000ux，光照時(shí)間為16h/天的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)30天分化出新的幼芽；所述繼代培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+4.5mg/L6-BA+2mg/L62BA +3mg/L玉米素+0.2mg/LNAA+1.0g/L瓊脂+10g/L蔗糖；
④增殖培養(yǎng)：將步驟③中繼代培養(yǎng)成功的帶有幼芽的根莖切成0.4cm3的小塊，然后接種于增殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23℃，光照強(qiáng)度為2000Lux，光照時(shí)間為12h/天的條件下培養(yǎng)20天后獲得分化苗；所述增殖培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L2,4D+1.0 mg/L GA3 +6.0g/L瓊脂+20g/L蔗糖；
⑤生根培養(yǎng)：待步驟④中增殖培養(yǎng)得到的分化苗長至2～4cm時(shí)，先將分化苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，在培養(yǎng)溫度為23℃，光照強(qiáng)度為2000Lux，光照時(shí)間為16h/天的條件下培養(yǎng)30天后可觀察到分化苗長出3～6條根須，根須長度為2～4cm，然后將分化苗移至自然光下培養(yǎng)，培養(yǎng)10天后即可進(jìn)行組培苗的移栽，所生根培養(yǎng)基為：1/2MS培養(yǎng)基 +0.2mg/LNAA +0.2mg/LIBA+0.3mg/LCA+0.2%活性炭+5%香蕉 +6.0g/L瓊脂+20g/L蔗糖；
⑥煉苗移栽：將步驟⑤中培養(yǎng)得到的組培苗從生根培養(yǎng)基中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基后，將組培苗移栽至苗床的育苗基質(zhì)中，所述育苗基質(zhì)為：樹皮20份、鋸末10份、蛭石30份、黑土10份、珍珠巖5份、草木灰0.2份，移栽初期需搭建小拱棚，覆蓋透明塑料布，適當(dāng)遮蔭，保持環(huán)境溫度20～25℃，空氣濕度70～80%，每隔7天噴施1次營養(yǎng)液，15天后除去塑料布，逐漸通風(fēng)，增加光照，轉(zhuǎn)入常規(guī)管理， 40天即可進(jìn)行大田移栽。
本實(shí)施例1的繁殖系數(shù)高、繁殖速度快、繁殖的周期短，培育得到種苗質(zhì)量好、長勢強(qiáng)，利用本實(shí)施例1的培育方法，其幼芽的發(fā)芽率可達(dá)到99.35%，增殖培養(yǎng)后的成苗率達(dá)到97.4%，生根培養(yǎng)后生根率為99.8%，生根苗移栽后的成活率達(dá)到97.8%，一個(gè)地下根莖經(jīng)滅均誘導(dǎo)成功后，55天后能切成5塊帶芽的組織塊，經(jīng)過20天的增殖培養(yǎng)可得到30塊以上的帶芽塊，在經(jīng)過4～5代的增殖培養(yǎng)即可得到百萬株種苗。
實(shí)施例2
本實(shí)施例的具體步驟如下：
①外殖體的選擇與處理:選取成熟、新鮮、無病蟲害的滇黃精根莖，用刀切取帶芽的根莖置于洗潔精水溶液中浸泡，浸泡2min后將其用流水清洗干凈，然后用體積分?jǐn)?shù)為72.5%的酒精浸泡2min，用無菌水反復(fù)沖洗3次，最后放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的氯化汞中反復(fù)浸泡滅菌4次，每次浸泡的時(shí)間為4min，每次浸泡后須用無菌水沖洗2～3次,沖洗干凈后再用無菌濾紙將無菌水吸干，用刀切去傷口壞死的部分即可進(jìn)行接種，所述氯化汞中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%的土溫20；
②誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟①中消毒處理后的根莖接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，在培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2200Lux，光照時(shí)間為14h/天的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)25天后根莖部分膨大，根莖的切口處誘導(dǎo)出淡黃色致密的愈傷組織，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基+2mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D+1.5mg/L赤霉素+8g/L瓊脂+25g/L蔗糖；
③繼代培養(yǎng)：先將步驟②中誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，在培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2200Lux，光照時(shí)間為14h/天的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)25天分化出新的幼芽；所述繼代培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+4.0mg/L6-BA+2.5mg/L62BA +3.0mg/L玉米素+0.2mg/LNAA+3.0g/L瓊脂+8.0g/L蔗糖；
④增殖培養(yǎng)：將步驟③中繼代培養(yǎng)成功的帶有幼芽的根莖切成0.6cm3的小塊，然后接種于增殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為28℃，光照強(qiáng)度為2500Lux，光照時(shí)間為16h/天的條件下培養(yǎng)25天后獲得分化苗；所述增殖培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+3.0mg/L6-BA+1.0mg/L2,4D+0.8 mg/L GA3 +8.0g/L瓊脂+22.0g/L蔗糖；
⑤生根培養(yǎng)：待步驟④中增殖培養(yǎng)得到的分化苗長至2～4cm時(shí)，先將分化苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，在培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2200Lux，光照時(shí)間為16h/天的條件下培養(yǎng)25天后可觀察到分化苗長出3～6條根須，根須長度為2～4cm，然后將分化苗移至自然光下培養(yǎng)，培養(yǎng)10天后即可進(jìn)行組培苗的移栽，所生根培養(yǎng)基為：1/2MS培養(yǎng)基 +0.8mg/LNAA +0.4mg/LIBA+0.3%活性炭+10%香蕉 +0.5mg/LCA +7.0g/L瓊脂+22.0g/L蔗糖；
⑥煉苗移栽：將步驟⑤中培養(yǎng)得到的組培苗從生根培養(yǎng)基中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基后，將組培苗移栽至苗床的育苗基質(zhì)中，所述育苗基質(zhì)為：樹皮30份、鋸末25份、蛭石35份、黑土20份、珍珠巖3份、草木灰0.2份，移栽初期需搭建小拱棚，覆蓋透明塑料布，適當(dāng)遮蔭，保持環(huán)境溫度20～25℃，空氣濕度70～80%，每隔7天噴施1次營養(yǎng)液，15天后除去塑料布，逐漸通風(fēng)，增加光照，轉(zhuǎn)入常規(guī)管理，30～40天即可進(jìn)行大田移栽。
本實(shí)施例2的繁殖系數(shù)高、繁殖速度快、繁殖的周期短，培育得到種苗質(zhì)量好、長勢強(qiáng)，利用本實(shí)施例2的培育方法，其幼芽的發(fā)芽率可達(dá)到99.56%，增殖培養(yǎng)后的成苗率達(dá)到98.67%，生根培養(yǎng)后生根率為99.45%，生根苗移栽后的成活率達(dá)到99.2%，一個(gè)地下根莖經(jīng)滅均誘導(dǎo)成功后，50天后能切成5塊帶芽的組織塊，經(jīng)過25天的增殖培養(yǎng)可得到30塊以上的帶芽塊，在經(jīng)過4～5代的增殖培養(yǎng)即可得到百萬株種苗。
實(shí)施例3：
本實(shí)施例的具體步驟如下：
①外殖體的選擇與處理:選取成熟、新鮮、無病蟲害的滇黃精根莖，用刀切取帶芽的根莖置于洗潔精水溶液中浸泡，浸泡3min后將其用流水清洗干凈，然后用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精浸泡2min，用無菌水反復(fù)沖洗3次，最后放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的氯化汞中反復(fù)浸泡滅菌5次，每次浸泡的時(shí)間為3min，每次浸泡后須用無菌水沖洗2～3次,沖洗干凈后再用無菌濾紙將無菌水吸干，用刀切去傷口壞死的部分即可進(jìn)行接種，所述氯化汞中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的土溫20；
②誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟①中消毒處理后的根莖接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，在培養(yǎng)溫度為28℃，光照強(qiáng)度為2500Lux，光照時(shí)間為16h/天的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)30天后根莖部分膨大，根莖的切口處誘導(dǎo)出淡黃色致密的愈傷組織，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基+3.0mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D+2.0mg/LKT+0.2mg/LNAA +2.0mg/L赤霉素+5.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖；
③繼代培養(yǎng)：先將步驟②中誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，在培養(yǎng)溫度為28℃，光照強(qiáng)度為2000Lux，光照時(shí)間為12h/天的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)30天分化出新的幼芽；所述繼代培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+4.5mg/L6-BA+3.0mg/L62BA +5.0mg/L玉米素+0.2mg/LNAA+3.0g/L瓊脂+10.0g/L蔗糖；
④增殖培養(yǎng)：將步驟③中繼代培養(yǎng)成功的帶有幼芽的根莖切成0.8cm3的小塊，然后接種于增殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為28℃，光照強(qiáng)度為2500Lux，光照時(shí)間為12h/天的條件下培養(yǎng)30天后獲得分化苗；所述增殖培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+4.0mg/L6-BA+1.5mg/L2,4D+1.0 mg/L GA3 +6.0g/L瓊脂+25.0g/L蔗糖；
⑤生根培養(yǎng)：待步驟④中增殖培養(yǎng)得到的分化苗長至2～4cm時(shí)，先將分化苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，在培養(yǎng)溫度為28℃，光照強(qiáng)度為2500Lux，光照時(shí)間為12h/天的條件下培養(yǎng)30天后可觀察到分化苗長出3～6條根須，根須長度為2～4cm，然后將分化苗移至自然光下培養(yǎng)，培養(yǎng)10天后即可進(jìn)行組培苗的移栽，所生根培養(yǎng)基為：1/2MS培養(yǎng)基 +1.0mg/LNAA +0.6mg/LIBA+0.5%活性炭+20%香蕉 +8.0g/L瓊脂+25.0g/L蔗糖；
⑥煉苗移栽：將步驟⑤中培養(yǎng)得到的組培苗從生根培養(yǎng)基中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基后，將組培苗移栽至苗床的育苗基質(zhì)中，所述育苗基質(zhì)為：樹皮40份、鋸末30份、蛭石40份、黑土20份、珍珠巖5份、草木灰0.3份，移栽初期需搭建小拱棚，覆蓋透明塑料布，適當(dāng)遮蔭，保持環(huán)境溫度20～25℃，空氣濕度70～80%，每隔7天噴施1次營養(yǎng)液，15天后除去塑料布，逐漸通風(fēng)，增加光照，轉(zhuǎn)入常規(guī)管理，30～40天即可進(jìn)行大田移栽。
本實(shí)施例3的繁殖系數(shù)高、繁殖速度快、繁殖的周期短，培育得到種苗質(zhì)量好、長勢強(qiáng)，利用本實(shí)施例3的培育方法，其幼芽的發(fā)芽率可達(dá)到99.21%，增殖培養(yǎng)后的成苗率達(dá)到99.45%，生根培養(yǎng)后生根率為99.95%，生根苗移栽后的成活率達(dá)到98.2%，一個(gè)地下根莖經(jīng)滅均誘導(dǎo)成功后，60天后能切成5塊帶芽的組織塊，經(jīng)過30天的增殖培養(yǎng)可得到30塊以上的帶芽塊，在經(jīng)過4～5代的增殖培養(yǎng)即可得到百萬株種苗。