本發(fā)明涉及生物工程領域，且特別涉及一種馬尿泡苗及其育苗方法。
背景技術：
：馬尿泡(PrzewalskiatanguticaMaxim.)又名矮莨菪，是茄科馬尿泡屬植物，為我國青藏高原特有植物；生長于海拔3200-5000米的高山礫石地及干旱草原。據《晶珠本草》及《藏藥志》記載，它是藏藥中的常用藥，其根和種子及全草均可做藥用，具有鎮(zhèn)痛、解痙、殺蟲、消炎等藥效，用于胃腸痙攣疼痛、白喉、炭疽；外用瘡瘍，皮膚瘙癢。由于馬尿泡中托烷類生物堿含量高，可以直接作為工業(yè)生產該類藥物的原料，市場上對馬尿泡的需求量正在不斷的增加，而僅靠采摘野生馬尿泡滿足市場的需求目前，而現代人工種植的馬尿泡繁殖主要通過馬尿泡種子有性繁殖，由于自然育種條件下，種子繁殖后代變異較多，個體植株差異較大，性狀不穩(wěn)定，因此，優(yōu)良品種的擴繁成為迫切需求。技術實現要素：本發(fā)明的目的在于提供一種馬尿泡育苗方法，其采用人工選取優(yōu)良野生植株，通過脫毒根尖組織培養(yǎng)快繁技術結合仿野生環(huán)境培育，使種苗后代不僅繼承了原植株的優(yōu)良性狀，不帶病毒，產量穩(wěn)定，而且抗性佳，適應性強。本發(fā)明的另一目的在于提供一種馬尿泡苗，其繼承了原植株的優(yōu)良性狀，不帶病毒，產量穩(wěn)定，抗性佳，適應性強。本發(fā)明解決其技術問題是采用以下技術方案來實現的。本發(fā)明提出一種馬尿泡育苗方法，其包括：選取長勢旺盛的野生馬尿泡，取其根尖，消毒，得到待接種根尖。切取待接種根尖0.3-0.5mm，接入誘導分化培養(yǎng)基中，在溫度為20℃，每日光照時間12h，光照強度為2000lx的條件下，分化培養(yǎng)兩個月。將分化后的根尖置于增殖培養(yǎng)基，在溫度20℃，光照強度2000lx，光照時間12h的條件下，增殖培養(yǎng)一個月。將增殖培養(yǎng)后的根尖置于生根培養(yǎng)基中，于日溫17-27℃，夜溫5-7℃，光照強度為1800-2700lx，光照時間為10-11h的條件下，培養(yǎng)30-35d，得生根苗，再將生根苗經煉苗后移栽。本發(fā)明提出一種馬尿泡苗，其由上述馬尿泡育苗方法制得。本發(fā)明實施例提供的馬尿泡苗及其育苗方法的有益效果是：該方法采用人工選取具有優(yōu)良性狀的野生植株，通過脫毒種苗組織培養(yǎng)快繁技術結合仿野生環(huán)境培育，使得到的馬尿泡苗不僅繼承了原植株的優(yōu)良性狀，不帶病毒，產量穩(wěn)定，而且抗性佳，適應性強。具體實施方式為使本發(fā)明實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產品。下面對本發(fā)明實施例的馬尿泡苗及其育苗方法進行具體說明。一種馬尿泡育苗方法，其包括：選取長勢旺盛的野生馬尿泡，取其根尖，消毒，得到待接種根尖。其中，長勢旺盛的野生馬尿泡，其具有良好的環(huán)境耐受性以及抗性。優(yōu)選地，野生馬尿泡的草齡為0.5-1年，草齡過高，不易進行組織培養(yǎng)，草齡過小，抗性不佳。優(yōu)選地，根尖消毒按以下方式進行：取1-1.5cm的根尖先用流水沖洗5-7min，然后用75％的乙醇溶液消毒40-55s，用無菌水沖洗去除殘余乙醇溶液，然后再于質量分數為0.1％-0.15％的升汞溶液中浸泡5分鐘，用無菌水沖洗去除殘余升汞溶液。該范圍內，可有效去除根尖表面的細菌，且不會影響待接種根尖的分化，濃度以及時間的控制合理，防止?jié)舛冗^低、時間過短造成的殺菌效果不佳，或濃度過高、時間過長造成的待接種根尖的活性不佳。切取待接種根尖0.3-0.5mm，接入誘導分化培養(yǎng)基中進行分化。優(yōu)選地，在溫度為20℃，每日光照時間12h，光照強度為2000lx的條件下進行。在該條件下，細胞分化速度快，分化培養(yǎng)兩個月，得到足夠多的分化后的根尖。優(yōu)選地，誘導分化培養(yǎng)基的原料按重量份數計包括：MS培養(yǎng)基100份，0.4mg/L的NAA5-7份，質量分數為10％的椰乳3-10份，6g/L的瓊脂0.5-5份，30g/L的蔗糖15-18份。其誘導分化效果佳。具體地，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，萘乙酸(NAA)為植物生長調節(jié)劑，能促進細胞分裂與擴大，誘導形成不定根增加，5-7重量份的萘乙酸(NAA)促進根尖細胞的繼續(xù)分化以及促進分化的速度以及分化的方向。3-10重量份的質量分數為10％的椰乳一方面提供營養(yǎng)物質，另一方面用于促進根尖的分化。蔗糖作為碳源，并且維持滲透壓。瓊脂作固化劑使培養(yǎng)膠化，6g/L的瓊脂0.5-5份的凝固效果使得誘導分化培養(yǎng)基更有利于根尖的分化。更優(yōu)選地，誘導分化培養(yǎng)基的原料還包括5-10重量份的硅藻粉。硅藻粉具有殺菌消毒，防止霉變的作用。將分化后的根尖置于增殖培養(yǎng)基，優(yōu)選地，在溫度20℃，光照強度2000lx，光照時間12h的條件下，增殖培養(yǎng)一個月。優(yōu)選地，增殖培養(yǎng)基的原料按重量份數計包括：MS培養(yǎng)基100份，1.0mg/L的NAA3-5份，0.5mg/L的IBA0.5-0.8份，0.2的mg/L6-BA1-2份，質量分數為10％的馬鈴薯汁5-7份，5.7g/L的瓊脂2-4份，30g/L的蔗糖10-20份，硫脲的4-8份。其中，3-5份重量份的萘乙酸(NAA)促進已分化的根尖細胞的迅速增殖。吲哚丁酸(IBA)促進分裂，促進細胞的增殖。6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)，又名細胞分裂素，1-2重量份的0.2mg/L的6-BA促進細胞的分裂增殖。將增殖培養(yǎng)后的根尖置于生根培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，于仿野生環(huán)境的情況下，具體地，于日溫17-27℃，夜溫5-7℃，光照強度為1800-2700lx，光照時間為10-11h的條件下，培養(yǎng)30-35d，得生根苗。于仿野生環(huán)境的情況下，刺激馬尿泡的生長，提高其抗性。優(yōu)選地，生根培養(yǎng)基的原料按重量份數計包括：MS培養(yǎng)基100份，0.2mg/L的NAA1-5份，0.2mg/L的6-BA1-2份，質量分數為10％的椰乳5-8份，5.7g/L的瓊脂1-3份，硅藻粉0.5-1.5份，氯化鎂0.1-0.3份。其中，1-2重量份的0.2mg/L的6-BA促進芽的形成，吲哚丁酸(IBA)進一步誘導根原體的形成，促進細胞分化和分裂，促進新根生成和維管束系統(tǒng)的分化，促進不定根的形成。馬尿泡離體培養(yǎng)過程中易受細菌感染，而糖會刺激細菌，且細菌增殖速度大于馬尿泡生長速度，從而使生長環(huán)境中的細菌迅速增長，導致馬尿泡長勢弱，抗性低。發(fā)明人發(fā)現，利用椰乳來替代糖，同時增加硅藻粉以及氯化鎂，三者比例合理，不僅能夠保證馬尿泡自身生長所需養(yǎng)分能得到充分供應，還能降低細菌滋生，提高其存活率，并且最后得到的仿野生環(huán)境培養(yǎng)的生根苗生長良好，與添加蔗糖的生根培養(yǎng)基相比，其經煉苗移栽至相同的實驗田時，其適應性更強，對惡劣環(huán)境的耐受性以及抗性更佳。優(yōu)選地，生根培養(yǎng)基的原料還包括7-15重量份的茶樹根粉，用于促進新根呼吸。優(yōu)選地，生根培養(yǎng)基的原料還包括0.1-1重量份的活性炭，防止新根褐變，不利于觀察。再將生根苗經煉苗后移栽。優(yōu)選地，生根苗的煉苗過程包括瓶內煉苗與瓶外基質煉苗2個環(huán)節(jié)，具體地，瓶內煉苗是將生根培養(yǎng)基內的生根苗置于溫度日溫17-27℃，夜溫4-7℃，光強1700-3000lx，光照10-11h/d，空氣相對濕度50-60％左右的密閉環(huán)境中，打開瓶蓋，使之適應環(huán)境3-5d，即可完成；而瓶外基質煉苗：將完成瓶內煉苗的生根苗取出后，栽植于煉苗室備好的基質苗床中，基質配方為1∶1∶1的草碳∶蛭石∶粘土，煉苗室晝夜溫度于日溫17-28℃，夜溫3-7℃，午間光強2500-3000lx，空氣相對濕度40-50％，經15-20d即可完成瓶外基質煉苗，即移栽大田或野外。實施例1一種馬尿泡的育苗方法，首先，選取健壯的野生馬尿泡，取1cm的根尖先用流水沖洗5min，然后用75％的乙醇溶液消毒55s，用無菌水沖洗去除殘余乙醇溶液，然后再于質量分數為0.15％的升汞溶液中浸泡5分鐘，用無菌水沖洗去除殘余升汞溶液，得到待接種根尖。然后，將待接種根尖切取0.3mm，接入誘導分化培養(yǎng)基中，在溫度為20℃，光照強度2000lx，每日光照時間12h的條件下，分化培養(yǎng)兩個月；其中，誘導分化培養(yǎng)基的原料按重量份數計包括：MS培養(yǎng)基100份，0.4mg/L的NAA7份，質量分數為10％的椰乳8份，6g/L的瓊脂3份，30g/L的蔗糖16份，硅藻粉6份。其次，將分化后的根尖置于增殖培養(yǎng)基，在溫度20℃，光照強度2000lx，光照時間12h的條件下，增殖培養(yǎng)一個月；其中，增殖培養(yǎng)基的原料按重量份數計包括：MS培養(yǎng)基100份，1.0mg/L的NAA5份，0.5mg/L的IBA0.6份，0.2mg/L的6-BA1份，質量分數為10％的馬鈴薯汁6份，5.7g/L的瓊脂3份，30g/L的蔗糖16份，硫脲5份。接著，將增殖培養(yǎng)后的根尖置于生根培養(yǎng)基中，于日溫17-27℃，夜溫5-7℃，光照強度為1800-2700lx，光照時間為10h的條件下，培養(yǎng)30-35d，得生根苗，其中，生根培養(yǎng)基的原料按重量份數計包括：MS培養(yǎng)基100份，0.2mg/L的NAA3份，0.5mg/LIBA的2份，質量分數為10％的椰乳7份，5.7g/L的瓊脂2份，硅藻粉1.5份，氯化鎂0.3份，-茶樹根粉9份，活性炭0.4份。最后將生根苗經煉苗后移栽，得到馬尿泡幼苗。實施例2一種馬尿泡的育苗方法，首先，選取健壯的野生馬尿泡，取1.5cm的根尖先用流水沖洗7min，然后用75％的乙醇溶液消毒40s，用無菌水沖洗去除殘余乙醇溶液，然后再于質量分數為0.1％的升汞溶液中浸泡5分鐘，用無菌水沖洗去除殘余升汞溶液，得到待接種根尖。然后，將待接種根尖切取0.3mm，接入誘導分化培養(yǎng)基中，在溫度為20℃，光照強度2000lx，每日光照時間12h的條件下，分化培養(yǎng)兩個月；其中，誘導分化培養(yǎng)基的原料按重量份數計包括：MS培養(yǎng)基100份，0.4mg/L的NAA5份，質量分數為10％的椰乳10份，6g/L的瓊脂5份，30g/L的蔗糖18份，硅藻粉10份。其次，將分化后的根尖置于增殖培養(yǎng)基，在溫度20℃，光照強度2000lx，光照時間12h的條件下，增殖培養(yǎng)一個月；其中，增殖培養(yǎng)基的原料按重量份數計包括：MS培養(yǎng)基100份，1.0mg/L的NAA3份，0.5mg/L的IBA0.5份，0.2mg/L的6-BA2份，質量分數為10％的馬鈴薯汁7份，5.7g/L的瓊脂4份，30g/L的蔗糖10份，硫脲4份。接著，將增殖培養(yǎng)后的根尖置于生根培養(yǎng)基中，于日溫17-27℃，夜溫5-7℃，光照強度為1800-2700lx，光照時間為10-11h的條件下，培養(yǎng)30-35d，得生根苗，其中，生根培養(yǎng)基的原料按重量份數計包括：MS培養(yǎng)基100份，0.2mg/L的NAA5份，0.5mg/L的IBA1.5份，質量分數為10％的椰乳5份，5.7g/L的瓊脂3份，硅藻粉1.2份，氯化鎂0.15份，茶樹根粉15份，活性炭1份。最后將生根苗經煉苗后移栽，得到馬尿泡幼苗。實施例3一種馬尿泡的育苗方法，首先，選取健壯的野生馬尿泡，取1.2cm的根尖先用流水沖洗6min，然后用75％的乙醇溶液消毒45s，用無菌水沖洗去除殘余乙醇溶液，然后再于質量分數為0.12％的升汞溶液中浸泡5分鐘，用無菌水沖洗去除殘余升汞溶液，得到待接種根尖。然后，將待接種根尖切取0.3mm，接入誘導分化培養(yǎng)基中，在溫度為20℃，光照強度2000lx，每日光照時間12h的條件下，分化培養(yǎng)兩個月；其中，誘導分化培養(yǎng)基的原料按重量份數計包括：MS培養(yǎng)基100份，0.4mg/L的NAA6份，質量分數為10％的椰乳5份，6g/L的瓊脂0.5份，30g/L的蔗糖17份，硅藻粉5份。其次，將分化后的根尖置于增殖培養(yǎng)基，在溫度20℃，光照強度2000lx，光照時間12h的條件下，增殖培養(yǎng)一個月；其中，增殖培養(yǎng)基的原料按重量份數計包括：MS培養(yǎng)基100份，1.0mg/L的NAA4份，0.5mg/L的IBA0.8份，0.2mg/L的6-BA1.5份，質量分數為10％的馬鈴薯汁5份，5.7g/L的瓊脂2.5份，30g/L的蔗糖20份，硫脲6份。接著，將增殖培養(yǎng)后的根尖置于生根培養(yǎng)基中，于日溫17-27℃，夜溫5-7℃，光照強度為1800-2700lx，光照時間為10-11h的條件下，培養(yǎng)30-35d，得生根苗，其中，生根培養(yǎng)基的原料按重量份數計包括：MS培養(yǎng)基100份，0.2mg/L的NAA4份，0.5mg/L的IBA1.7份，質量分數為10％椰乳8份，5.7g/L的瓊脂2.5份，硅藻粉0.8份，氯化鎂0.2份，茶樹根粉7份，活性炭0.1份。最后將生根苗經煉苗后移栽，得到馬尿泡幼苗。實施例4一種馬尿泡的育苗方法，首先，選取健壯的野生馬尿泡，取1.3cm的根尖先用流水沖洗5.5min，然后用75％的乙醇溶液消毒50s，用無菌水沖洗去除殘余乙醇溶液，然后再于質量分數為0.14％的升汞溶液中浸泡5分鐘，用無菌水沖洗去除殘余升汞溶液，得到待接種根尖。然后，將待接種根尖切取0.3mm，接入誘導分化培養(yǎng)基中，在溫度為20℃，光照強度2000lx，每日光照時間12h的條件下，分化培養(yǎng)兩個月；其中，誘導分化培養(yǎng)基的原料按重量份數計包括：MS培養(yǎng)基100份，0.4mg/L的NAA5.5份，質量分數為10％的椰乳7份，6g/L的瓊脂2份，30g/L的蔗糖15份，硅藻粉8份。其次，將分化后的根尖置于增殖培養(yǎng)基，在溫度20℃，光照強度2000lx，光照時間12h的條件下，增殖培養(yǎng)一個月；其中，增殖培養(yǎng)基的原料按重量份數計包括：MS培養(yǎng)基100份，1.0mg/L的NAA3.5份，0.5mg/L的IBA0.65份，0.2mg/L6-BA的1.6份，質量分數為10％馬鈴薯汁5.5份，5.7g/L瓊脂2份，30g/L的蔗糖18份，硫脲8份。接著，將增殖培養(yǎng)后的根尖置于生根培養(yǎng)基中，于日溫17-27℃，夜溫5-7℃，光照強度為1800-2700lx，光照時間為10-11h的條件下，培養(yǎng)30-35d，得生根苗，其中，生根培養(yǎng)基的原料按重量份數計包括：MS培養(yǎng)基100份，0.2mg/L的NAA2份，0.5mg/L的IBA1.8份，質量分數為10％的椰乳6份，5.7g/L的瓊脂1份，硅藻粉1份，氯化鎂0.2份，茶樹根粉10份。最后將生根苗經煉苗后移栽，得到馬尿泡幼苗。實施例5一種馬尿泡的育苗方法，首先，選取健壯的野生馬尿泡，取1.4cm的根尖先用流水沖洗6min，然后用75％的乙醇溶液消毒54s，用無菌水沖洗去除殘余乙醇溶液，然后再于質量分數為0.11％的升汞溶液中浸泡5分鐘，用無菌水沖洗去除殘余升汞溶液，得到待接種根尖。然后，將待接種根尖切取0.3mm，接入誘導分化培養(yǎng)基中，在溫度為20℃，光照強度2000lx，每日光照時間12h的條件下，分化培養(yǎng)兩個月；其中，誘導分化培養(yǎng)基的原料按重量份數計包括：MS培養(yǎng)基100份，0.4mg/L的NAA6.5份，質量分數為10％的椰乳4份，6g/L的瓊脂4份，30g/L的蔗糖16.5份。其次，將分化后的根尖置于增殖培養(yǎng)基，在溫度20℃，光照強度2000lx，光照時間12h的條件下，增殖培養(yǎng)一個月；其中，增殖培養(yǎng)基的原料按重量份數計包括：MS培養(yǎng)基100份，1.0mg/L的NAA4.5份，0.5mg/L的IBA0.55份，0.2mg/L的6-BA1.4份，質量分數為10％的馬鈴薯汁6.5份，5.7g/L的瓊脂3.5份，30g/L的蔗糖14份，硫脲7份。接著，將增殖培養(yǎng)后的根尖置于生根培養(yǎng)基中，于日溫17-27℃，夜溫5-7℃，光照強度為1800-2700lx，光照時間為10-11h的條件下，培養(yǎng)30-35d，得生根苗，其中，生根培養(yǎng)基的原料按重量份數計包括：MS培養(yǎng)基100份，0.2mg/L的NAA1份，0.5mg/L的IBA2份，質量分數為10％的椰乳6.5份，5.7g/L的瓊脂1.5份，硅藻粉0.5份，氯化鎂0.1份。最后將生根苗經煉苗后移栽，得到馬尿泡幼苗。試驗例將實施例1增殖培養(yǎng)后的根尖平均分為3組，即實施例1，對比例1與對比例2。將三組分別置于生根培養(yǎng)基。其中，對比例1中僅生根培養(yǎng)基原料與實施例1的生根培養(yǎng)基的原料相比，多了蔗糖，其生根培養(yǎng)基原料按重量份數計包括：MS培養(yǎng)基100份，0.2mg/L的NAA3份，0.5mg/L的IBA2份，質量分數為10％的椰乳7份，5.7g/L的瓊脂2份，茶樹根粉9份，活性炭0.4份，蔗糖12份。其中對比例2，生根培養(yǎng)基的原料與實施例1相同，但是其是于恒定溫度20℃，光照強度為2000lx，光照時間為12h的條件下，培養(yǎng)30-35d。將實施例1，對比例1以及對比例2制得的馬尿泡幼苗經同樣的煉苗方式后移栽至同一塊實驗田中。合格生根苗率是指生根培養(yǎng)基得到的合格的生根苗與總的生根苗的百分比，合格的生根苗是指長勢茂盛以及葉綠不發(fā)黃，未受細菌感染的健康植株。移栽至實驗田成活率是指100枝對比例生根苗與100枝實施例生根苗在同樣的環(huán)境中，經同樣的培育方法培育1個月后，存活的生根苗的數量與100的質量百分比。對比得表1數據。表1對比結果合格生根苗率移栽至實驗田成活率對比例166％89％對比例272％67％實施例168％96％由表1可得，在仿野外環(huán)境中，添加蔗糖的生根培養(yǎng)基合格的生根苗率大于未添加蔗糖的生根培養(yǎng)基培養(yǎng)，且這些生根苗移至大田時，實施例1提供的生根苗的存活率大于對比例1提供的生根苗。而實施例1的生根苗其綜合性狀優(yōu)于對比例2，因此實施例1提供的生根苗的適應力更為優(yōu)異。本發(fā)明實施例的提供的馬尿泡苗及其育苗方法，其采用人工選取優(yōu)良野生植株，通過脫毒種苗組織培養(yǎng)快繁技術結合仿野生環(huán)境培育，使種苗后代不僅繼承了原植株的優(yōu)良性狀，不帶病毒，產量穩(wěn)定，而且抗性佳，適應性強。以上所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發(fā)明的實施例的詳細描述并非旨在限制要求保護的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。當前第1頁1 2 3