本發(fā)明涉及植物保護領域。

背景技術：

馬鈴薯干腐病是由鐮刀菌(Fusarium spp)引起的一種真菌病害，是馬鈴薯窖儲期間主要病害之一，損失率約15％-35％，嚴重時可達50％。目前主要通過化學藥劑進行防控，收到較好的效果，但化學藥劑長期使用后病原菌易產生抗藥性，致使大部分地區(qū)病害抗性頻率超過50％，防治效果逐年降低，最終導致化學藥劑完全失去防效。同時由于大量農藥的使用給土壤、水體等生態(tài)環(huán)境帶來嚴重污染，因此亟待研究和開發(fā)高效、低毒、低殘留，環(huán)境友好型植物源殺菌劑。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有殺菌劑長期使用導致病原菌易產生抗性及其對環(huán)境污染嚴重的缺點；而提供一種植物源殺菌劑及其制備方法。

本發(fā)明的一種防治馬鈴薯干腐病的植物源殺菌劑，它為濃度為0.1～2.0mg/mL綿馬貫眾素ABBA溶液。

本發(fā)明中植物源殺菌劑的制備方法的步驟如下：

一、于6～8月采集新鮮的粗莖鱗毛蕨植物材料，選擇根狀莖粗大的植株，整株采集，陰干后粉碎過40目篩備用；

二、稱取粗莖鱗毛蕨粉末，按質量體積比為1kg：10L的比例將其與體積百分含量為70％的乙醇混合，然后在50℃，45Hz條件下超聲浸提20min，再真空抽濾，收集濾液，然后向殘渣中加入1L的收集的濾液，在50℃，45Hz條件下超聲浸提20min，即得到粗莖鱗毛蕨植物源抑菌劑提取物粗品；

三、用體積百分含量為95％乙醇浸泡DM-130大孔吸附樹脂24h，然后裝柱；

四、以1～2mL/min的速度將粗莖鱗毛蕨植物源抑菌劑提取液進行上柱；

五、對步驟四DM-130大孔吸附樹脂先用蒸餾水洗至無色，然后用體積百分含量為70％乙醇進行洗脫，用管收集洗脫液，洗脫液經(jīng)濾膜過濾后，即得到植物源殺菌劑。

本發(fā)明包含以下有益效果：

本發(fā)明植物源抑菌劑具有無毒、低殘留、無污染、無抗藥性、抑菌活性較強、高選擇性。對馬鈴薯干腐病鐮刀菌生長有一定的抑制作用，可有效的控制菌絲徑向生長，能夠顯著降低菌絲的生長量。同時該植物源抑菌劑可以提高塊莖組織的抗性，可誘導馬鈴薯產生抗性，抑制鐮刀菌的侵染，減低由于鐮刀菌導致的病害發(fā)生程度。本發(fā)明與化學藥劑相比，植物源提取劑作用位點多，藥劑持續(xù)期長，降解速度快，對環(huán)境污染小等優(yōu)點。

附圖說明

圖1植物源抑菌劑對鐮刀菌菌絲生長量的抑制；

圖2為植物源抑菌劑對馬鈴薯“尤金”塊莖抗干腐病的誘導柱狀圖；其中，CK1為陰性對照，以無菌水接種的健康馬鈴薯“尤金”塊莖；CK2為陽性對照，以植物源抑菌劑接種的健康馬鈴薯“尤金”塊莖；處理1以鐮刀菌接種的健康馬鈴薯“尤金”塊莖；處理2以植物源抑菌劑處理接種鐮刀菌的健康馬鈴薯“尤金”塊莖；

圖3為植物源抑菌劑對馬鈴薯“克新13”塊莖抗干腐病的誘導圖；其中，CK1為陰性對照，以無菌水接種的健康馬鈴薯“克新13”塊莖；CK2為陽性對照，以植物源抑菌劑接種的健康馬鈴薯“克新13”塊莖；處理1以鐮刀菌接種的健康馬鈴薯“克新13”塊莖；處理2以植物源抑菌劑處理接種鐮刀菌的健康馬鈴薯“克新13”塊莖；

圖4為“克新13”切片病斑直徑圖；其中，CK1為陰性對照，以無菌水接種的健康馬鈴薯“克新13”塊莖；CK2為陽性對照，以植物源抑菌劑接種的健康馬鈴薯“克新13”塊莖；處理1以鐮刀菌接種的健康馬鈴薯“克新13”塊莖；處理2以植物源抑菌劑處理接種鐮刀菌的健康馬鈴薯“克新13”塊莖；

圖5為“尤金”切片病斑直徑圖；其中，CK1為陰性對照，以無菌水接種的健康馬鈴薯“克新13”塊莖；CK2為陽性對照，以植物源抑菌劑接種的健康馬鈴薯“克新13”塊莖；處理1以鐮刀菌接種的健康馬鈴薯“克新13”塊莖；處理2以植物源抑菌劑處理接種鐮刀菌的健康馬鈴薯“克新13”塊莖；

圖6為具體實施方式九中綿馬貫眾素ABBA的HPLC色譜圖。

具體實施方式

具體實施方式一：本實施方式的一種防治馬鈴薯干腐病的植物源殺菌劑，它為濃度為0.1～2.0mg/mL綿馬貫眾素ABBA溶液。

具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是：綿馬貫眾素ABBA是由鱗毛蕨科(Dryopteridaceae)鱗毛蕨屬(Dryopteris Adanson)粗莖鱗毛蕨(Dryopteris crassirhizoma)提取得到的。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一不同的是：它為濃度為0.5～2.0mg/mL綿馬貫眾素ABBA。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一不同的是：它為濃度為1.0～2.0mg/mL綿馬貫眾素ABBA。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一不同的是：它為濃度為1.5～2.0mg/mL綿馬貫眾素ABBA。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式六：本實施方式一種防治馬鈴薯干腐病的植物源殺菌劑的制備方法，其特征在于它是按照以下步驟進行的：

一、于6～8月采集新鮮的粗莖鱗毛蕨植物材料，選擇根狀莖粗大的植株，整株采集，陰干后粉碎過40目篩備用；

二、稱取粗莖鱗毛蕨粉末，按質量體積比為1kg：10L的比例將其與體積百分含量為70％的乙醇混合，然后在50℃，45Hz條件下超聲浸提20min，再真空抽濾，收集濾液，然后向殘渣中加入1L的收集的濾液，在50℃，45Hz條件下超聲浸提20min，即得到粗莖鱗毛蕨植物源抑菌劑提取物粗品；

三、用體積百分含量為95％乙醇浸泡DM-130大孔吸附樹脂24h，然后裝柱；

四、以1～2mL/min的速度將粗莖鱗毛蕨植物源抑菌劑提取液進行上柱；

五、對步驟四DM-130大孔吸附樹脂先用蒸餾水洗至無色，然后用體積百分含量為70％乙醇進行洗脫，用管收集洗脫液，洗脫液經(jīng)濾膜過濾后，此時綿馬貫眾素ABBA的純度11.52％，即得到植物源殺菌劑。

具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式六不同的是：DM-130大孔吸附樹脂裝柱前進行如下處理：

一、用乙醇洗DM-130大孔吸附樹脂，洗至流出液與蒸館水混合后不產生渾油后，改用蒸餾水以同樣流速通過DM-130大孔吸附樹脂，洗至無醇味；二、用酸堿處理，最后用蒸餾水以步驟一同樣的流速洗DM-130大孔吸附樹脂至為中性；然后裝柱。

其它與具體實施方式六相同。

具體實施方式八：本實施方式與具體實施方式六不同的是：步驟四中以1.5mL/min的速度將粗莖鱗毛蕨植物源抑菌劑提取液進行上柱。其它與具體實施方式六相同。

具體實施方式九：本實施方式與具體實施方式六不同的是：步驟五經(jīng)濾膜過濾后的洗脫液，需進行高效液相色譜分析后，得綿馬貫眾素ABBA，配成濃度為0.1～2.0mg/mL綿馬貫眾素ABBA溶液，即為植物源殺菌劑；其中，色譜條件柱為water600C18柱，流動相為體積百分含量為100％甲醇，柱溫20℃，進樣體積為10uL，保留時間為18min。其它與具體實施方式六相同。

本發(fā)明內容不僅限于上述各實施方式的內容，其中一個或幾個具體實施方式的組合同樣也可以實現(xiàn)發(fā)明的目的。

通過以下實施例驗證本發(fā)明的有益效果：

實施例一

體外條件下使用濃度為0.1mg/mL，0.5mg/mL和2.0mg/mL植物源抑菌劑對馬鈴薯干腐病主要致病菌黃色鐮刀菌(Fusarium culmarum)、燕麥鐮刀菌(Fusarium avenaceum)、接骨木鐮刀菌(Fusarium sambucinum)和茄病鐮刀菌藍色變種(Fusarium solani var.coeruleum)進行體外抑制。

參考鐘秋平和夏文水方法并修改，無菌操作條件下，待蒸汽滅菌冷卻至40～45℃時，加入一定量植物提取液加入，充分混勻，使PDA中植物提取液濃度為0.1mg/mL，0.5mg/mL和2.0mg/mL，待完全溶解后倒平板，以不添加提取液作為對照。平板冷卻后用打孔器接種培養(yǎng)7d的黃色鐮刀菌(F.culmarum)、燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)、接骨木鐮刀菌(F.sambucinum)和茄病鐮刀菌藍色變種(F.solani var.coeruleum)，將生長一致的供試菌餅(Ф＝6.0mm)置于含不同濃度提取物的培養(yǎng)皿中部，使菌餅帶菌絲的一面貼在培養(yǎng)基表面，25℃下培養(yǎng)，待對照組的菌落直徑達到培養(yǎng)皿的2/3時，十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復3次，計算菌絲生長抑制率。

結果如表1顯示：植物源抑菌劑對馬鈴薯鐮刀菌干腐病有良好的抑制效果，高濃度提取液對不同種鐮刀菌的抑菌作用顯著高于低濃度提取液的抑菌作用，在濃度2.0mg/mL時抑制率達90％以上。

表1不同濃度植物源提取物對馬鈴薯鐮刀菌干腐病的抑制率

由數(shù)據(jù)處理得粗莖鱗毛蕨綿馬貫眾素ABBA對4種鐮刀菌的毒力方程y＝a+bx，并有毒力方程計算要幾個濃度對馬鈴薯鐮刀菌干腐病的抑制終濃度(EC50)，結果如表2所示，其中對茄病鐮刀菌藍色變種的抑菌效果最好，EC50為0.161mg/mL，對其余3種鐮刀菌的EC50在0.215至0.2519mg/mL之間。

表2植物源提取物對馬鈴薯鐮刀菌干腐病的毒力測定

實施例二

參考于漢壽和陳永萱方法并作修改，配成濃度為0.1mg/mL和0.5mg/mL植物源抑菌劑的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)，以不含植物源抑菌劑作為對照。每瓶含50mL培養(yǎng)基，接種5片在PDA培養(yǎng)7d的茄病鐮刀菌藍色變種的菌餅(Ф＝6mm)，25℃100RPM振蕩培養(yǎng)14d，過濾菌絲，烘干后測定菌絲干重。

結果如圖1顯示，植物源抑菌劑處理能夠顯著降低菌絲的生長量，隨著處理濃度的增加，菌絲體干重逐漸降低，均顯著的低于對照(p＜0.05)，當植物源抑菌劑濃度達到時0.5mg/mL時，培養(yǎng)14d后，菌絲干重僅為對照的32.24％。

實施例三

植物源抑菌劑處理馬鈴薯“尤金”和“克新13”切片，分別取外觀整齊、無損傷，健康的“克新13”和“尤金”馬鈴薯塊莖，清水沖洗后，用5％的次氯酸鈉表面消毒2min，無菌水沖洗3次，放入無菌超凈工作臺中自然陰干。在無菌超凈臺中將塊莖分割成厚約0.5cm的薄片，用經(jīng)高壓滅菌的無菌打孔器(Ф＝5mm)在薄片中央打成圓形凹槽，切片用無菌水清洗后，經(jīng)75％的酒精擦洗并在酒精燈火焰上燒去殘余酒精，放于裝有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中。取100μL濃度為2mg/mL的植物源抑菌劑溶液加入到薯片中央圓形凹槽中。以分別單獨加入無菌水和植物源抑菌劑的健康馬鈴薯塊莖為對照。接種方法：取PDA上培養(yǎng)7d的茄病鐮刀菌藍色變種打成菌餅(Ф＝5mm)，倒置接種到處理后的馬鈴薯切片中央。25℃的溫度下培養(yǎng)，濕度為85～90％(保濕24h)，3d和6d分別用十字交叉法測量病斑擴展直徑。

結果如表3顯示：馬鈴薯“尤金”和“克新13”切片用2.0mg/mL的植物提取物處理后，進行接種，培養(yǎng)6d后發(fā)現(xiàn)，植物提取物處理后均能降低鐮刀菌的侵染。如圖4和圖5顯示，馬鈴薯“尤金”和“克新13”切片用2.0mg/mL的植物源抑菌劑處理后的病斑直徑(CK2)與陰性對照(CK1)無差異，說明植物源抑菌劑不會對塊莖造成傷害，不產生藥害。

表3植物源提取物對鐮刀菌侵染馬鈴薯塊莖組織能力的影響

實施例四

植物源抑菌劑處理損傷接種馬鈴薯塊莖，分別取外觀整齊、無損傷的，健康的“克新13”和“尤金”馬鈴薯塊莖，用清水沖洗后，用5％的次氯酸鈉表面消毒1min，無菌水沖洗3次，自然干燥后放入無菌超凈工作臺中，在塊莖表明等距離用打孔器(Ф＝5mm)在每個塊莖上打孔，孔深為3mm。取100μL濃度為2mg/ml的植物源抑菌劑加入馬鈴薯小孔內，以分別單獨加入無菌水和植物源抑菌劑健康馬鈴薯塊莖為對照。接種方法：取PDA上培養(yǎng)7天的黃色鐮刀菌(F.culmarum)、燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)、接骨木鐮刀菌(F.sambucinum)和茄病鐮刀菌藍色變種(F.solani var.coeruleum)打成菌餅(Ф＝5mm)，正置于馬鈴薯小孔內，最后將原馬鈴薯塊莖組織塞回并用透明膠布封口。25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，濕度85～90％(保濕24h)，分別在第16d時用十字交叉法測量病斑擴展直徑。

結果如圖2和圖3顯示，植物源抑菌劑對馬鈴薯“尤金”和“克新13”健康塊莖損傷接種鐮刀菌后的產生明顯的抗性誘導效果，濃度為2mg/mL的植物源抑菌劑處理損傷接種塊莖的病斑直徑(處理2)極顯著低于鐮刀菌接種處理塊莖的病斑直徑(處理1)(P≤0.01)，說明植物源抑菌劑的誘導效果顯著，能顯著降低鐮刀菌對塊莖的侵染。植物源抑菌劑處理損傷接種塊莖的病斑直徑(處理2)與陰性對照(CK1)差異不顯著，說明植物源抑菌劑對馬鈴薯“尤金”和“克新13”誘導處理后對鐮刀菌侵染的抑制效果明顯。植物源抑菌劑處理馬鈴薯“尤金”健康塊莖的病斑直徑(CK2)與陰性對照(CK1)差異顯著，說明植物源抑菌劑對健康馬鈴薯“尤金”和“克新13”塊莖在沒有受到病原菌侵入的時候也產生一定誘導抗性，可以提高塊莖的抗性。

實施例五

植物源抑菌劑處理接種處理馬鈴薯塊莖，分別取外觀整齊、無損傷的，健康的“尤金”馬鈴薯塊莖，用清水沖洗后，用質量百分含量為5％的次氯酸鈉表面消毒1min，無菌水沖洗3次，自然干燥后放入無菌超凈工作臺中備用。

使用鐮刀菌接種馬鈴薯塊莖，取滅菌的釘子，在塊莖表面打孔深為3mm，寬度為3mm的小洞，向小洞中加入20μL茄病鐮刀菌藍色變種(F.solani var.coeruleum)分生孢子懸浮(1×10⁵個孢子/mL)，25℃，在黑暗培養(yǎng)，以此作為陽性對照。

培養(yǎng)24h后將植物源抑菌劑均勻的噴在馬鈴薯塊莖上，濃度分別為1.0，0.1和0.01mg/mL，保持塊莖濕潤10min，然后在空氣中干燥5min，直到塊莖上無水分為止。25℃，黑暗中培養(yǎng)，以噴施無菌水的塊莖作為陰性對照。

培養(yǎng)中的濕度為85～90％(保濕24h)，在第7d時測量塊莖病斑擴展直徑和深度，計算病斑面積比率。

結果如表4顯示，植物源抑菌劑對隨機選取的馬鈴薯健康塊莖損傷接種鐮刀菌后的產生治療效果，馬鈴薯塊莖接種馬鈴薯干腐病病原菌之后再施用植物源抑菌劑，塊莖上的病斑面積減小，說明植物源抑菌劑可以對馬鈴薯干腐病有一定的治療效果。

表4不同濃度植物源提取物對馬鈴薯干腐病的治療效果

實施例六

分別取外觀整齊、無損傷的，健康的馬鈴薯塊莖，用清水沖洗后，用5％的次氯酸鈉表面消毒1min，無菌水沖洗3次，自然干燥后放入無菌超凈工作臺中備用。將0、0.01，0.1和1.0mg/mL的植物源抑菌劑分別噴在馬鈴薯塊莖上，使塊莖浸濕為止，保持塊莖濕潤10min，然后在空氣中干燥5min，直到塊莖上無水分為止，25℃，在黑暗培養(yǎng)。24h后用滅菌的釘子，在塊莖表面打孔深為3mm寬度為3mm的小洞，向小孔中加入20μL的茄病鐮刀菌藍色變種(F.solani var.coeruleum)分生孢子懸浮(1×10⁵個孢子/mL)，25℃，黑暗中培養(yǎng)。以單獨浸泡在無菌水中的塊莖作為陰性對照。在第7d時測量塊莖病斑擴展直徑和深度，計算病斑面積和比率。

結果如表5顯示，植物源抑菌劑對隨機選取的馬鈴薯健康塊莖有很好的保護作用，先施用植物源抑菌劑后再接種病原菌，發(fā)病率明顯降低，說明該植物源藥劑對馬鈴薯塊莖有很好的保護作用，能夠對干腐病有一定的預防作用。

表5不同濃度植物源提取物對馬鈴薯塊莖的保護作用