本發(fā)明屬于無性繁殖技術領域，具體涉及天山云杉胚性愈傷組織高效增殖培養(yǎng)基。

背景技術：

植物體細胞胚（體胚）發(fā)生是雙倍體或者單倍體的體細胞在特定條件下，未經(jīng)性細胞融合而是通過合子胚胎發(fā)生類似的途徑發(fā)育出新個體的過程。植物組織培養(yǎng)中體細胞胚的發(fā)生不僅具有普遍性，而且具有數(shù)量多，速度快，結(jié)構(gòu)完整的特點，在應用上是一種有效大規(guī)模的無性繁殖方法。

目前天山云杉主要通過有性繁殖產(chǎn)生后代。因為，種子成熟率低、生長較慢、繁殖和品種選育困難，所以無性繁殖一直受到各國林業(yè)決策部門的重視與林木育種工作者以及森林經(jīng)營者的特別關注，尤其是現(xiàn)代生物技術的蓬勃發(fā)展，如植物組織培養(yǎng)及體細胞胚胎發(fā)生技術，具有繁殖效率高、周期短、不受自然條件制約、穩(wěn)定、選育優(yōu)良品種，對造林工程具有重大意義等特點。天山云杉體細胞胚愈傷組織的誘導培養(yǎng)已取得了一定的進展，愈傷組織的增殖是體細胞胚胎培養(yǎng)的關鍵，而在天山云杉體細胞胚愈傷組織的專用增殖培養(yǎng)基鮮見報道。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供了一種天山云杉胚性愈傷組織高效增殖培養(yǎng)基。

本發(fā)明報道了天山云杉體細胞胚增殖階段的技術研究，為實現(xiàn)天山云杉體細胞胚培養(yǎng)的更廣泛應用提供堅實的理論基礎，同時建立了天山云杉胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)的技術平臺，為天山云杉遺傳改良種質(zhì)創(chuàng)新、縮短育種周期奠定了研究基礎。

本發(fā)明提供天山云杉胚性愈傷組織高效增殖培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基為改良SH增殖培養(yǎng)基或改良BM2增殖培養(yǎng)基；

其中，（1）所述改良SH增殖培養(yǎng)基的配方為：

大量元素

硝酸鉀(KNO₃) 2500mg/L

硫酸鎂(MgSO₄·7H₂O) 400mg/L

磷酸二氫銨（NH4）H₂PO₄ 300mg/L

氯化鈣(CaCl₂·2H₂O) 200mg/L

微量元素

五水硫酸銅(CuSO₄·5H₂O) 0.2mg/L

硼酸(H₃BO₃) 5mg/L

一水硫酸錳(MnSO₄·H₂O) 10mg/L

二水鉬酸鈉(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.1mg/L

七水硫酸鋅(ZnSO₄·7H₂O) 1mg/L

碘化鉀(KI) 1mg/L

六水氯化鈷(CoCl₂·6H₂O) 0.1mg/L

鐵鹽

乙二胺四乙酸鐵鈉(FeNaEDTA) 35mg/L

有機物

煙酸(Nicotinie Acid) 5mg/L

鹽酸硫胺素(Thiamine-HCl) 5mg/L

鹽酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.5 mg/L

肌醇(Myo-Inositol) 1000mg/L

水解酪蛋白(Caseinhydrolysat) 1000mg/L

蔗糖（Saccharose） 20g/L

卡拉膠(Gelrite) 3000mg/L

L-谷氨酰胺 500mg/L

外源生長調(diào)節(jié)劑

2,4-D 1.10mg/L

6-BA 0.44mg/L；

（2）所述改良BM2增殖培養(yǎng)基的配方為：

大量元素

氯化鈣(CaCl₂·2H₂O) 134.5mg/L

硫酸鎂(MgSO₄·7H₂O) 400mg/L

磷酸二氫鉀KH₂PO₄ 340mg/L

微量元素

四水硫酸錳(MnSO₄·4H₂O) 11.15mg/L

一水硫酸錳(MnSO₄·H₂O) 20.8mg/L

七水硫酸鋅(ZnSO₄·7H₂O) 8mg/L

硼酸(H₃BO₃) 5mg/L

碘化鉀(KI) 1mg/L

六水氯化鈷(CoCl₂·6H₂O) 0.025mg/L

五水硫酸銅(CuSO₄·5H₂O) 0.24mg/L

二水鉬酸鈉(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.2mg/L

鐵鹽

乙二胺四乙酸鐵鈉(FeNaEDTA) 65.1mg/L

有機物

肌醇(Myo-Inositol) 1000mg/L

煙酸(Nicotinie Acid) 0.25mg/L

鹽酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.25mg/L

鹽酸硫胺素(Thiamine-HCl) 0.5mg/L

L-甘氨酸（Glycine） 1mg/L

水解酪蛋白(Caseinhydrolysat) 500mg/L

蔗糖（Saccharose） 20g/L

卡拉膠(Gelrite) 3000mg/L

L-谷氨酰胺 450mg/L

外源生長調(diào)節(jié)劑

2,4-D 1.10mg/L

6-BA 0.44mg/L。

作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)基為改良SH增殖培養(yǎng)基。

本發(fā)明還提供上述增殖培養(yǎng)基的制備方法，制備時，首先，每升添加除L-谷氨酰胺外的配方量的各組分后，純凈水作為溶劑，攪拌均勻后調(diào)pH值至5.8±0.02，然后添加Gelrite（卡拉膠）作為固化劑，封口準備消毒；在121℃，2×10⁷ Pa的壓力下進行15min高壓滅菌后，將培養(yǎng)基自然冷卻至60℃時加入配方量（用孔徑為0.22μm的濾器過濾滅菌）的L-谷氨酰胺。然后將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中自然冷卻凝固，放置1d后再使用。

本發(fā)明還提供上述天山云杉胚性愈傷組織高效增殖的接種方法，其特征在于：是將天山云杉胚性愈傷組織接種于權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基中，將尺寸為70.3×28mm的培養(yǎng)器皿接種0.65g胚性愈傷組織后（分成4塊接種于增殖培養(yǎng)基上），蓋上蓋子，在黑暗中，溫度為23±2℃條件下培養(yǎng)，每周稱一次新鮮增殖量并觀察增殖的生長狀態(tài)，直至愈傷組織生長進入停止，各處理均重復5次。首先，將愈傷組織與培養(yǎng)基分離，然后轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿（稱量前去皮）進行新鮮增殖的稱量。記錄數(shù)據(jù)后再將胚性愈傷組織接回原處繼續(xù)培養(yǎng)。為了避免污染，上述操作均在超凈臺內(nèi)進行。繪制生產(chǎn)曲線，確定最佳繼代周期。

本發(fā)明建立了天山云杉胚性愈傷組織增殖的的技術平臺，確定天山云杉胚性愈傷組織增殖的培養(yǎng)基：改良SH，DCR，1/2DCR，BM和MSG培養(yǎng)基；其中最佳天山云杉胚性愈傷組織增殖的培養(yǎng)基為改良SH，并提出天山云杉胚性愈傷組織增殖的培養(yǎng)條件。本發(fā)明為實現(xiàn)天山云杉胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)的更廣泛應用提供堅實的理論基礎，同時建立了天山云杉胚性愈傷組織培養(yǎng)的技術平臺，為天山云杉遺傳改良種質(zhì)創(chuàng)新、縮短育種周期奠定了研究基礎。

附圖說明

附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1為天山云杉胚性愈傷組織在5種不同增殖培養(yǎng)基上的增殖量與增殖率表現(xiàn)；

（SHT表示SH培養(yǎng)基，其中的T表示為天山云杉）。

圖2為不同的天山云杉胚性愈傷組織在改良SH培養(yǎng)基中的增殖情況。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

一、最適培養(yǎng)基的選擇

培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)，沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項新的培養(yǎng)系統(tǒng)時，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)才有可能成功。

本實驗采用DCR、1/2DCR、SH、BM2和MSG為5種增殖培養(yǎng)基，再分別添加外源生長調(diào)節(jié)劑：1.10mg/L 2,4-D+0.44mg/L 6-BA，作為本實驗的5種增殖培養(yǎng)基，并將其分別命名為改良DCR增殖培養(yǎng)基、改良1/2DCR增殖培養(yǎng)基、改良SH增殖培養(yǎng)基、改良BM2增殖培養(yǎng)基和改良MSG增殖培養(yǎng)基。

五種增殖培養(yǎng)基的配方及制備方法如下：

（1）改良SH增殖培養(yǎng)基的配方如下：

大量元素

硝酸鉀(KNO₃) 2500mg/L

硫酸鎂(MgSO₄·7H₂O) 400mg/L

磷酸二氫銨（NH4）H₂PO₄ 300mg/L

氯化鈣(CaCl₂·2H₂O) 200mg/L

微量元素

五水硫酸銅(CuSO₄·5H₂O) 0.2mg/L

硼酸(H₃BO₃) 5mg/L

一水硫酸錳(MnSO₄·H₂O) 10mg/L

二水鉬酸鈉(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.1mg/L

七水硫酸鋅(ZnSO₄·7H₂O) 1mg/L

碘化鉀(KI) 1mg/L

六水氯化鈷(CoCl₂·6H₂O) 0.1mg/L

鐵鹽

乙二胺四乙酸鐵鈉(FeNaEDTA) 35mg/L

有機物

煙酸(Nicotinie Acid) 5mg/L

鹽酸硫胺素(Thiamine-HCl) 5mg/L

鹽酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.5 mg/L

肌醇(Myo-Inositol) 1000mg/L

水解酪蛋白(Caseinhydrolysat) 1000mg/L

蔗糖（Saccharose） 20g/L

卡拉膠(Gelrite) 3000mg/L

L-谷氨酰胺 500mg/L

外源生長調(diào)節(jié)劑

2,4-D 1.10mg/L

6-BA 0.44mg/L。

（2）改良DCR增殖培養(yǎng)基的配方如下：

大量元素

硝酸鉀(KNO₃) 340mg/L

硝酸銨（NH₄NO₃） 400mg/L

硝酸鈣Ca(NO₃)₂·4H₂O 556mg/L

氯化鈣(CaCl₂·2H₂O) 85mg/L

硫酸鎂(MgSO₄·7H₂O) 370mg/L

磷酸二氫鉀KH₂PO₄ 170mg/L

微量元素

四水硫酸錳(MnSO₄·4H₂O) 16.9mg/L

七水硫酸鋅(ZnSO₄·7H₂O) 8.6mg/L

硼酸(H₃BO₃) 6.2mg/L

碘化鉀(KI) 0.83mg/L

六水氯化鈷(CoCl₂·6H₂O) 0.025mg/L

五水硫酸銅(CuSO₄·5H₂O) 0.25mg/L

二水鉬酸鈉(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.25mg/L

氯化鎳（NiCl₂） 0.025mg/L

鐵鹽

乙二胺四乙酸鐵鈉(FeNaEDTA) 65.1mg/L

有機物

肌醇(Myo-Inositol) 200mg/L

煙酸(Nicotinie Acid) 0.5mg/L

鹽酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.5mg/L

鹽酸硫胺素(Thiamine-HCl) 1.0mg/L

L-甘氨酸（Glycine） 2mg/L

蔗糖（Saccharose） 20g/L

卡拉膠(Gelrite) 3000mg/L

L-谷氨酰胺 730mg/L

外源生長調(diào)節(jié)劑

2,4-D 1.10mg/L

6-BA 0.44mg/L。

（3）改良BM2增殖培養(yǎng)基的配方如下：

大量元素

氯化鈣(CaCl₂·2H₂O) 134.5mg/L

硫酸鎂(MgSO₄·7H₂O) 400mg/L

磷酸二氫鉀KH₂PO₄ 340mg/L

微量元素

四水硫酸錳(MnSO₄·4H₂O) 11.15mg/L

一水硫酸錳(MnSO₄·H₂O) 20.8mg/L

七水硫酸鋅(ZnSO₄·7H₂O) 8mg/L

硼酸(H₃BO₃) 5mg/L

碘化鉀(KI) 1mg/L

六水氯化鈷(CoCl₂·6H₂O) 0.025mg/L

五水硫酸銅(CuSO₄·5H₂O) 0.24mg/L

二水鉬酸鈉(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.2mg/L

鐵鹽

乙二胺四乙酸鐵鈉(FeNaEDTA) 65.1mg/L

有機物

肌醇(Myo-Inositol) 1000mg/L

煙酸(Nicotinie Acid) 0.25mg/L

鹽酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.25mg/L

鹽酸硫胺素(Thiamine-HCl) 0.5mg/L

L-甘氨酸（Glycine） 1mg/L

水解酪蛋白(Caseinhydrolysat) 500mg/L

蔗糖（Saccharose） 20g/L

卡拉膠(Gelrite) 3000mg/L

L-谷氨酰胺 450mg/L

外源生長調(diào)節(jié)劑

2,4-D 1.10mg/L

6-BA 0.44mg/L。

（4）改良MSG增殖培養(yǎng)基的配方如下：

大量元素

硝酸鉀(KNO₃) 100mg/L

氯化鈣(CaCl₂·2H₂O) 440mg/L

硫酸鎂(MgSO₄·7H₂O) 320mg/L

氯化鉀（KCl） 475mg/L

磷酸二氫鉀KH₂PO₄ 170mg/L

微量元素

四水硫酸錳(MnSO₄·4H₂O) 22.3mg/L

七水硫酸鋅(ZnSO₄·7H₂O) 8.6mg/L

硼酸(H₃BO₃) 6.2mg/L

碘化鉀(KI) 0.83mg/L

六水氯化鈷(CoCl₂·6H₂O) 0.025mg/L

五水硫酸銅(CuSO₄·5H₂O) 0.25mg/L

二水鉬酸鈉(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.25mg/L

鐵鹽乙二胺四乙酸鐵鈉(FeNaEDTA) 65.1mg/L

有機物

肌醇(Myo-Inositol) 100mg/L

煙酸(Nicotinie Acid) 0.5mg/L

鹽酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.5mg/L

鹽酸硫胺素(Thiamine-HCl) 1.0mg/L

蔗糖（Saccharose） 20g/L

卡拉膠(Gelrite) 3000mg/L

L-谷氨酰胺 1460mg/L

外源生長調(diào)節(jié)劑

2,4-D 1.10mg/L

6-BA 0.44mg/L。

上述五種增殖培養(yǎng)基的配制方法均為：

制備時，首先，每升添加除L-谷氨酰胺外的配方量的各組分后，純凈水作為溶劑，攪拌均勻后調(diào)pH值至5.8±0.02，然后添加Gelrite（卡拉膠）作為固化劑，封口準備消毒；在121℃，2×10⁷ Pa的壓力下進行15min高壓滅菌后，將培養(yǎng)基自然冷卻至60℃時加入配方量（用孔徑為0.22μm的濾器過濾滅菌）的L-谷氨酰胺。然后將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中自然冷卻凝固，放置1d后再使用。

應用上述培養(yǎng)基對天山云杉胚性愈傷組織進行增殖的方法如下：

將胚性愈傷組織（T6，T7，T36，T43，T48）分別接種于上述五種增殖培養(yǎng)基（培養(yǎng)器皿尺寸為70.3×28mm）上進行培養(yǎng)。每培養(yǎng)器皿中接種0.65g的愈傷組織（分成4塊接種于增殖培養(yǎng)基）。蓋上蓋子，在黑暗中，溫度為23±2℃條件下培養(yǎng)。每周稱一次新鮮增殖量并觀察增殖的生長狀態(tài)，直至愈傷組織生長進入停止，各處理均重復5次。稱重時，首先，將愈傷組織與培養(yǎng)基分離，然后轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿（稱量前去皮）進行新鮮增殖的稱量。記錄數(shù)據(jù)后再將胚性愈傷組織接回原處繼續(xù)培養(yǎng)。為了避免污染，上述操作均在超凈臺內(nèi)進行。繪制生產(chǎn)曲線，確定最佳繼代周期。

二、結(jié)果與分析

影響胚性愈傷組織增殖的因素之一是培養(yǎng)基，本發(fā)明將胚性愈傷組織接種于5種不同培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)，結(jié)果顯示5種培養(yǎng)基其增殖量與增殖率表現(xiàn)出不一樣的變化（見圖1），試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果表示，使用改良BM2和SH培養(yǎng)基的增殖量和增殖率高于其他培養(yǎng)基，分別為5.74g和為4.55g，增殖率達到782.7%和600%。其他3種培養(yǎng)基（MSG、DCR、1/2DCR）的增殖率低，分別為3.41g、2.69g、2.61g，增殖率達到424.4%、313.2%、301.5%。通過原始統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行方差分析、顯著性檢驗，結(jié)果表示，BM2和SH培養(yǎng)基的增殖量顯著差異（P<0.05）。其他3種培養(yǎng)基之間無顯著差異（P>0.05）。增殖量的高低排序為BM>SH>MSG>DCR>1/2DCR。結(jié)果表明，BM2和SH培養(yǎng)基的增殖效果明顯優(yōu)于其他3個培養(yǎng)基。雖然BM2培養(yǎng)基的增殖效果最好，但其繼代一次后褐化現(xiàn)象嚴重。SH培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)后能夠保持較好的胚性，褐化現(xiàn)象較少。

基于此，為了研究個體之間的增殖是否存在差異性，分別選取了5種天山云杉個體胚性愈傷組織(T6，T7，T36，T43，T48)，接種在SH培養(yǎng)基上的增殖情況。試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果表明，5種不同個體胚性愈傷組織增殖量變化不明顯(圖2)。5種個體的增殖量分別為4.63g、4.56g、4.50g、4.11g、4.09g。高低排序為T6>T36>T48>T43>T7。通過方差分析結(jié)果表示，各個體之間增殖量無顯著性差異(P>0.05)。

圖2中，a、b：增殖培養(yǎng)基的胚性愈傷組織；c：胚性胚柄團的顯微鏡觀察；d：胚性愈傷組織的顯微鏡下觀察尺寸：10mm(a，b)；100μm(c，d)。

實施例1

本發(fā)明的天山云杉胚性愈傷組織高效增殖培養(yǎng)基為改良SH增殖培養(yǎng)基，具體配方如下：

大量元素

氯化鈣(CaCl₂·2H₂O) 134.5mg/L

硫酸鎂(MgSO₄·7H₂O) 400mg/L

磷酸二氫鉀KH₂PO₄ 340mg/L

微量元素

四水硫酸錳(MnSO₄·4H₂O) 11.15mg/L

一水硫酸錳(MnSO₄·H₂O) 20.8mg/L

七水硫酸鋅(ZnSO₄·7H₂O) 8mg/L

硼酸(H₃BO₃) 5mg/L

碘化鉀(KI) 1mg/L

六水氯化鈷(CoCl₂·6H₂O) 0.025mg/L

五水硫酸銅(CuSO₄·5H₂O) 0.24mg/L

二水鉬酸鈉(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.2mg/L

鐵鹽

乙二胺四乙酸鐵鈉(FeNaEDTA) 65.1mg/L

有機物

肌醇(Myo-Inositol) 1000mg/L

煙酸(Nicotinie Acid) 0.25mg/L

鹽酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.25mg/L

鹽酸硫胺素(Thiamine-HCl) 0.5mg/L

L-甘氨酸（Glycine） 1mg/L

水解酪蛋白(Caseinhydrolysat) 500mg/L

蔗糖（Saccharose） 20g/L

卡拉膠(Gelrite) 3000mg/L

L-谷氨酰胺 450mg/L

外源生長調(diào)節(jié)劑

2,4-D 1.10mg/L

6-BA 0.44mg/L。

本發(fā)明的培養(yǎng)基的制備方法為：

制備時，首先，每升添加除L-谷氨酰胺外的配方量的各組分后，純凈水作為溶劑，攪拌均勻后調(diào)pH值至5.8±0.02，然后添加Gelrite（卡拉膠）作為固化劑，封口準備消毒；在121℃，2×10⁷ Pa的壓力下進行15 min高壓滅菌后,將培養(yǎng)基自然冷卻至60℃時加入配方量（用孔徑為0.22μm的濾器過濾滅菌）的L-谷氨酰胺。然后將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中自然冷卻凝固，放置1d后再使用。

本發(fā)明的天山云杉胚性愈傷組織高效增殖的接種方法為：

將胚性愈傷組織接種于上述增殖培養(yǎng)基（培養(yǎng)器皿尺寸為70.3×28mm）上進行培養(yǎng)，每個培養(yǎng)器皿中接種0.65g的胚性愈傷組織（分成4塊接種于增殖培養(yǎng)基上）后，蓋上培養(yǎng)器皿蓋子，在黑暗中，溫度為23±2℃條件下培養(yǎng)。稱量時，首先，將愈傷組織與培養(yǎng)基分離，然后轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿（稱量前去皮）進行新鮮增殖的稱量。記錄數(shù)據(jù)后再將胚性愈傷組織接回原處繼續(xù)培養(yǎng)。每周稱一次新鮮增殖量并觀察增殖的生長狀態(tài)，直至愈傷組織生長進入停止。為了避免污染，上述操作均在超凈臺內(nèi)進行。繪制生產(chǎn)曲線，確定最佳繼代周期。各處理均重復5次。

實施例2

本發(fā)明的天山云杉胚性愈傷組織高效增殖培養(yǎng)基為改良BM2增殖培養(yǎng)基，具體配方如下：

大量元素

氯化鈣(CaCl₂·2H₂O) 134.5mg/L

硫酸鎂(MgSO₄·7H₂O) 400mg/L

磷酸二氫鉀KH₂PO₄ 340mg/L

微量元素

四水硫酸錳(MnSO₄·4H₂O) 11.15mg/L

一水硫酸錳(MnSO₄·H₂O) 20.8mg/L

七水硫酸鋅(ZnSO₄·7H₂O) 8mg/L

硼酸(H₃BO₃) 5mg/L

碘化鉀(KI) 1mg/L

六水氯化鈷(CoCl₂·6H₂O) 0.025mg/L

五水硫酸銅(CuSO₄·5H₂O) 0.24mg/L

二水鉬酸鈉(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.2mg/L

鐵鹽

乙二胺四乙酸鐵鈉(FeNaEDTA) 65.1mg/L

有機物

肌醇(Myo-Inositol) 1000mg/L

煙酸(Nicotinie Acid) 0.25mg/L

鹽酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.25mg/L

鹽酸硫胺素(Thiamine-HCl) 0.5mg/L

L-甘氨酸（Glycine） 1mg/L

水解酪蛋白(Caseinhydrolysat) 500mg/L

蔗糖（Saccharose） 20g/L

卡拉膠(Gelrite) 3000mg/L

L-谷氨酰胺 450mg/L

外源生長調(diào)節(jié)劑

2,4-D 1.10mg/L

6-BA 0.44mg/L。

本實施例的培養(yǎng)基的制備方法和應用其增殖天山云杉胚性愈傷組織的方法與實施例1相同。

最后應說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。