本發(fā)明涉及油菜種植領(lǐng)域，更特別地，涉及一種緩解油菜幼苗的銅脅迫的方法。

背景技術(shù)：

銅(Cu)是植物生長發(fā)育所必需的一種微量元素，但植物正常生長所需要的Cu量很少，當過量Cu被植物吸收后，會對植物產(chǎn)生毒害作用，抑制植物的生長發(fā)育甚至死亡。目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動中使用的大量高銅殺菌劑、污水灌溉等多種原因?qū)е峦寥乐蠧u污染日益加劇。

油菜是我國主要的油料作物，種植面積和產(chǎn)量均居世界首位。油菜種植不僅能收獲菜籽生產(chǎn)食用油，還可以采摘菜薹作蔬菜，而且其餅粕富含蛋白質(zhì)，可作為動物飼料，是一種備受青睞的作物。要菜籽和菜薹的產(chǎn)量高、質(zhì)量好，勢必關(guān)聯(lián)到油菜的生長環(huán)境諸多因素。目前，探討硒、銅對油菜生長的影響方面雖有報道，但多集中在單獨一種元素對油菜生長的影響上，王波等在恒溫箱培養(yǎng)條件下研究了銅脅迫對油菜種子萌發(fā)期生理生化指標的影響，結(jié)果表明低濃度的銅對油菜有促進作用，而高濃度產(chǎn)生了抑制作用；張馳等應用土培與水培相結(jié)合的盆栽方式，研究了硒對油菜苗期生長和生理生化指標的影響，結(jié)果表明硒能明顯地影響油菜的生長發(fā)育，適量的補硒處理都具有明顯的增產(chǎn)效果。然而，現(xiàn)有技術(shù)中尚未研究通過施用硒來緩解高濃度的銅對油菜的脅迫。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本研究擬采用不同濃度的Se、Cu溶液處理盆栽油菜幼苗，處理結(jié)束后測定幼苗葉綠素、丙二醛、硝態(tài)氮、可溶性糖、蛋白質(zhì)等指標的含量及過氧化物酶活性、淀粉酶活性，以揭示Se、Cu交互脅迫下油菜的生理響應規(guī)律，以期找出最佳的Se、Cu供應比例，為油菜的品質(zhì)的改善和產(chǎn)量的提高提供參考。

基于此，本發(fā)明提供了一種緩解油菜幼苗的銅脅迫的方法，包括向施用含銅溶液的油菜幼苗施用含硒溶液的步驟。

進一步地，所述含銅溶液中的銅以硫酸銅形式存在，所述含硒溶液中的硒以亞硒酸鈉形式存在。

進一步地，當施用硫酸銅濃度為0-75mg/L的含銅溶液時，所施用的含硒溶液中亞硒酸鈉的濃度為0-12mg/L。

進一步地，當施用硫酸銅濃度為75-200mg/L的含銅溶液時，所施用的含硒溶液中亞硒酸鈉的濃度為12-22mg/L。

通過使用本發(fā)明的方法，能夠在必要時給油菜幼苗施加一定濃度的銅的情況下(例如，使用使用含銅的殺蟲劑，或使用含銅的水進行灌溉)，通過使用相應濃度的硒來緩解銅的施用導致的對油菜幼苗的脅迫效應。

附圖說明

圖1為不同Se、Cu處理下油菜幼苗總?cè)~綠素含量柱狀統(tǒng)計圖；

圖2為不同Se、Cu處理下油菜幼苗丙二醛濃度柱狀統(tǒng)計圖；

圖3為不同Se、Cu處理下油菜幼苗蛋白質(zhì)含量柱狀統(tǒng)計圖；

圖4為不同Se、Cu處理下油菜幼苗油菜的POD活性柱狀統(tǒng)計圖；

圖5為不同Se、Cu處理下油菜幼苗硝態(tài)氮含量柱狀統(tǒng)計圖；

圖6為不同Se、Cu處理下油菜幼苗淀粉酶活性柱狀統(tǒng)計圖；

圖7為不同Se、Cu處理下油菜幼苗油菜可溶性糖含量柱狀統(tǒng)計圖。

具體實施方式

以下結(jié)合實例對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

1.油菜幼苗的培育以及銅和硒的施用

本實驗于2015年10月至2016年1月在湖北工程學院生科樓進行。油菜種子用1％的次氯酸鈉溶液給消毒15min，然后用無菌水沖洗5次，再用蒸餾水浸泡24h，讓其充分吸水后挑選沉于下方的籽粒飽滿的種子若干；將選好的種子均勻撒在鋪有兩層濾紙的白色托盤內(nèi)，用適量蒸餾水濕潤濾紙(水量保持濾紙濕潤，但不宜流動)。將托盤放入MJX-250B-Z型恒溫箱進行催芽，溫度設置為25℃，期間每天向托盤中添加適量的等量蒸餾水，3天后種子露白，再移入花盆中進行土培實驗。

取養(yǎng)分貧瘠的沙土，用篩子篩出沙土中較大的石礫等雜質(zhì)。將土均勻的分到45個盆中，澆適量等量蒸餾水保持土壤濕潤。

將發(fā)芽后的油菜種子移至花盆中，每盆十株，均勻分布。將花盆放在向陽通風處，每天澆兩次等量Hoagland’s營養(yǎng)液。待油菜幼苗長至4-5片葉之后，將45盆油菜隨機分成3組，每組三個重復，向油菜幼苗施用含銅溶液和含硒溶液。

實驗中含銅溶液的中的銅為CuSO₄，濃度分別為0、25mg/L、75mg/L、100mg/L、200mg/L，含硒溶液的中的硒為Na₂SeO₃，濃度分別為：0、12mg/L、22mg/L。

2.葉綠素含量的測定

葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，是反應植物葉片光合作用能力的一個很重要的指標。脅迫處理結(jié)束后，測定油菜葉片總?cè)~綠素含量。結(jié)果如圖1所示，1)單獨噴施Cu液時，油菜幼苗總?cè)~綠素含量隨著Cu濃度的增加先增加后降低。當Cu濃度達75mg/L時，總?cè)~綠素含量達最高值，而Cu濃度過高(200mg/L)時，則產(chǎn)生一定的抑制作用；同樣，單獨噴施Se，供Se 12mg/L時，總?cè)~綠素含量最高，而Se濃度為22mg/L時，總?cè)~綠素含量低于對照。由此可知低Se、低Cu對油菜合成葉綠素有促進作用，而高濃度Se、高濃度Cu則是產(chǎn)生抑制作用。(2)Se、Cu同時供應時，低Cu(小于等于75mg/L)、低Se(12mg/L)配施，油菜葉綠素含量均高于對照和高硒組。當Cu濃度超過100mg/L時，高Se(22mg/L)組總?cè)~綠素含量均高于對照和低Se組。說明適量的Se和Cu對葉綠素含量有促進作用，當環(huán)境中Cu濃度高于100mg/L時，噴施高濃度的Se對Cu脅迫有較好的緩解作用。

對葉綠素含量進一步進行雙因素方差分析，結(jié)果如表1所示，對葉綠素含量進行雙因素方差分析，結(jié)果見表3，由表3可知：(1)Se濃度為差異源時，F(xiàn)>F crit，說明Se對油菜中總?cè)~綠素含量影響的差異性達到顯著水平；(2)Cu濃度為差異源時，F(xiàn)>F crit，說明Cu對油菜總?cè)~綠素影響的差異性也達到顯著水平；(3)差異源是Se、Cu的交互作用時，F(xiàn)>F crit，說明Se和Cu的交互作用達到顯著水平，即Se和Cu在共同影響油菜總?cè)~綠素含量方面有明顯的交互作用。

表1總?cè)~綠素含量變化方差分析

注：α為0.05；SS為方差，df為自由度，MS為均方，F(xiàn)為檢驗統(tǒng)計量F值，F(xiàn)crit為F的臨界值。下同。

3.丙二醛含量的測定

丙二醛(MDA)是常用的膜脂過氧化指標，在植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一個常用指標，可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以此判斷植物的膜系統(tǒng)受損程度及其抗逆性。

脅迫處理結(jié)束后，測定油菜葉片中MDA的濃度。結(jié)果如圖2所示，無論噴Se濃度為多少時，MDA含量均隨Cu濃度的增加而呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，都在Cu濃度為100mg/L時達到最小值，說明低濃度的Cu可以減少MDA的產(chǎn)生，增強了植物的抗逆性。另外，當單獨供Se時，植物葉片中MDA含量在Se濃度為12mg/L時最低，說明低濃度的Se能增強植物抗逆性；隨著Cu濃度小于等于100mg/L，Se濃度22mg/L時葉片中MDA含量低于對照組和低Se組，說明當環(huán)境中Cu濃度較低時，高濃度的Se對油菜的Cu脅迫緩解效果較好；而當Cu濃度為200mg/L時，則表現(xiàn)為12mg/L的Se濃度緩解效果更佳，說明低Se對高濃度的Cu脅迫緩解效果更佳。

對丙二醛含量進一步進行雙因素方差分析，結(jié)果如表2所示，(1)Se濃度為差異源時，F(xiàn)>Fcrit，說明Se對油菜中MDA濃度影響的差異性達到顯著水平；(2)Cu濃度為差異源時，F(xiàn)>Fcrit，說明噴Cu對油菜MDA濃度影響的差異性也達到顯著水平；(3)差異源是Se、Cu交互作用時，F(xiàn)>F crit，說明Se和Cu的交互作用達到顯著水平，即Se和Cu對油菜MDA濃度影響方面有明顯的交互作用。

表2丙二醛濃度變化方差分析

4.蛋白質(zhì)含量的測定

脅迫處理結(jié)束后，測定油菜葉片中蛋白質(zhì)的含量。結(jié)果如圖3所示，(1)當單獨供Cu時，油菜中蛋白質(zhì)含量隨Cu濃度的升高而呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在Cu濃度為75mg/L時達到最大值。說明低濃度的Cu對油菜合成蛋白質(zhì)有一定促進作用，銅濃度為200mg/L時，蛋白質(zhì)含量明顯低于對照組，高濃度的Cu產(chǎn)生抑制作用。(2)無論是單獨供Se還是Se、Cu同時供應，都表現(xiàn)為低Se(12mg/L)供應下蛋白質(zhì)含量最高，說明低Se(12mg/L)對Cu脅迫油菜有一定的促進作用。這種促進作用在Cu濃度為25mg/L時達到最佳效果。銅濃度為200mg/L時，供Se都一定程度的緩解了高濃度銅的脅迫。

對丙二醛含量進一步進行雙因素方差分析，結(jié)果如表3所示，(1)Se濃度為差異源時，F(xiàn)<F crit，說明Se對油菜中蛋白質(zhì)影響的差異性沒有達到顯著水平；(2)Cu濃度為差異源時，F(xiàn)＝<F crit，說明Cu對油菜中蛋白質(zhì)含量影響的差異性也沒有達到顯著水平；(3)差異源是Se、Cu交互作用時，F(xiàn)<Fcrit，說明Se和Cu對油菜中蛋白質(zhì)含量影響的交互作用不明顯。

表3蛋白質(zhì)含量方差分析

5.過氧化物酶活性的測定

植物體中含有大量過氧化物酶(POD)，是活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關(guān)系。脅迫處理結(jié)束后，測定油菜葉片中POD的活性。結(jié)果如圖4所示，Se濃度為0和高Se(22mg/L)時，隨Cu濃度的增加，油菜中POD的活性逐漸降低；低Se(12mg/L)時，油菜中POD活性隨Cu濃度增加呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢。說明適量Se對Cu脅迫下油菜POD活性有一定緩解作用。

對蛋白質(zhì)含量進行雙因素方差分析，結(jié)果如表4所示，(1)Se濃度為差異源時，F(xiàn)<Fcrit，說明Se對油菜POD活性影響的差異性沒有達到顯著水平；(2)Cu濃度為差異源時，F(xiàn)>F crit，說明噴Cu對油菜POD活性影響的差異性達到了顯著水平；(3)差異源是Se、Cu交互作用時，F(xiàn)>Fcrit，說明Se和Cu在共同影響油菜POD活性的交互作用較為明顯。由此可見，Se對POD活性影響較小，而Cu對POD活性的影響較顯著。

表4油菜POD活性方差分析

6.硝態(tài)氮含量測定

測定植物體內(nèi)的硝態(tài)氮含量，能反映出植物的氮素營養(yǎng)狀況，還可為鑒定蔬菜及其加工品的品質(zhì)提供依據(jù)。脅迫處理結(jié)束后，測定油菜葉片中硝態(tài)氮的含量。結(jié)果如圖5所示，不供Se時，油菜中硝態(tài)氮含量隨Cu濃度的增加而逐漸升高，當Cu的濃度小于等于75mg/L時，硝態(tài)氮變化不明顯，在Cu濃度高于100mg/L時開始急劇增加。說明低濃度的Cu對油菜的硝態(tài)氮含量影響較小。高濃度Cu會促進油菜硝態(tài)氮的累積。Se、Cu同時供應，硝態(tài)氮含量均為先增加后降低，在Se 12mg/L、Cu 100mg/L組合時硝態(tài)氮含量最低。當Cu濃度為200mg/L時，低Se組和高Se組油菜的硝態(tài)氮含量都明顯低于對照，說明Se能明顯緩解高濃度Cu脅迫下硝態(tài)氮的含量。

對硝態(tài)氮含量進一步進行雙因素方差分析，結(jié)果如表5所示，(1)Se濃度為差異源時，F(xiàn)>Fcrit，說明Se對油菜中硝態(tài)氮含量影響的差異性沒有達到顯著水平；(2)Cu濃度為差異源時，F(xiàn)>Fcrit，說明Cu對油菜硝態(tài)氮含量影響的差異性達到了顯著水平；(3)差異源是Se、Cu交互作用時，F(xiàn)>F crit，說明Se和Cu的交互作用達到顯著水平，即Se和Cu在共同影響油菜硝態(tài)氮含量方面的交互作用非常明顯。

表5硝態(tài)氮含量方差分析

7.淀粉酶含量的測定

植物的能量來源主要是淀粉，所以需要淀粉酶來分解淀粉獲得能量，提供組織生長需要以及完成各種生理活動。淀粉酶活性高低常作為植物抗逆性的生化指標。脅迫處理結(jié)束后，測定油菜幼苗中淀粉酶的活性。結(jié)果如圖6所示，當單獨供Se時，油菜淀粉酶活性隨著Se濃度的增加而增加，說明Se對油菜淀粉酶活性有促進作用。單獨供Cu時，隨著Cu濃度的增加，淀粉酶活性先增加后降低，在Cu濃度為75mg/L時達到最高值，此后雖然有降低，但仍高于對照組，說明在此濃度范圍內(nèi)，Cu對油菜淀粉酶活性均有促進作用，且低濃度的Cu促進作用效果更明顯。Se、Cu同時供應時，表現(xiàn)為高Se(22mg/L)與低濃度的Cu(小于75mg/L)組合下淀粉酶活性最高。低Se對高濃度的Cu脅迫下淀粉酶活性有一定的緩解作用。

對淀粉酶活性進一步進行雙因素方差分析，結(jié)果如表6所示，(1)Se濃度為差異源時，F(xiàn)<Fcrit，說明Se對油菜中淀粉酶活性影響的差異性沒有達到顯著水平；(2)Cu濃度為差異源時，F(xiàn)>Fcrit，說明Cu對油菜淀粉酶活性影響的差異性達到了顯著水平；(3)差異源是Se、Cu交互作用時，F(xiàn)>F crit，說明Se和Cu的交互作用達到顯著水平，即Se和Cu在共同影響油菜淀粉酶的活性方面的交互作用比較明顯。

表6淀粉酶活性方差分析

8.可溶性糖含量的測定

糖類作為呼吸基質(zhì)，為作物的各種合成過程和各種生命活動提供了所需的能量。蔬菜作物中可溶性糖的測定，可以了解和鑒定作物品質(zhì)的高低。脅迫處理結(jié)束后，測定油菜葉片中可溶性糖的含量。結(jié)果如圖7所示，(1)單獨供Cu時，油菜可溶性糖含量隨Cu濃度增加呈現(xiàn)先降后升再降的變化趨勢。在Cu濃度為100mg/L時達到最大值，濃度為200mg/L時，可溶性糖含量明顯低于對照，說明低濃度的Cu對油菜有促進作用，高濃度則產(chǎn)生抑制。(2)單獨供Se時，油菜可溶性糖含量呈下降趨勢。Se、Cu同時供應時，低濃度的Se(12mg/L)與低濃度的Cu(75mg/L)會提高可溶性糖含量，隨著Cu濃度的增加，則表現(xiàn)為高Se(22mg/L)與高Cu組合會提高可溶性糖的含量。說明低濃度Se與低濃度的Cu對油菜可溶性糖含量有促進作用。而高Se能有效緩解高濃度的Cu脅迫。

對可溶性糖含量進一步進行雙因素方差分析，結(jié)果如表7所示，(1)Se濃度為差異源時，F(xiàn)<F crit，說明Se對油菜中可溶性糖含量影響的差異性沒有達到顯著水平；(2)Cu濃度為差異源時，F(xiàn)<Fcrit，說明Cu對油菜可溶性糖含量影響的差異性也沒有達到顯著水平；(3)差異源是Se、Cu交互作用時，F(xiàn)<F crit，說明Se和Cu的交互作用沒有達到顯著水平，即Se和Cu在共同影響油菜可溶性糖方面的交互作用不明顯。

表7可溶性糖含量方差分析

從以上數(shù)據(jù)可看出，單獨噴施Cu溶液，Cu濃度達75mg/L時，油菜生理指標的綜合影響較好；而Cu濃度達200mg/L時，所有指標均低于對照,說明低濃度的Cu對油菜生長有促進作用，高濃度則產(chǎn)生抑制。單獨噴施Se溶液時，與對照相比，供Se組各項指標都較好，說明適量的Se對油菜有促進作用。硒、銅同時供應時，低硒(12mg/L)與低銅(75mg/L)的組合，高硒(22mg/L)與高銅(100mg/L)的組合對油菜生理指標的綜合影響較好。說明低濃度的硒、銅配施，對油菜各項生理指標均有促進作用，而較高濃度的硒(22mg/L)能有效緩解高濃度銅對油菜的脅迫作用。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。