本發(fā)明屬于植物栽培領(lǐng)域，具體的講，涉及西伯利亞杏體細胞胚胎發(fā)生的一種方法。

背景技術(shù)：

西伯利亞杏（Armeniaca sibirica (L.) Lam）主要分布于我國北方地區(qū)，是我國北方地區(qū)的主要經(jīng)濟樹種和生態(tài)綠化樹種，具有廣泛應(yīng)用和實際價值。西伯利亞杏繁殖常用方法主要是播種繁殖和嫁接方法,嫁接方法繁殖能夠保持品種的優(yōu)良特性,遺傳性狀穩(wěn)定,但通過嫁接繁殖速度慢,嚴重阻礙了優(yōu)良品種在大批量生產(chǎn)的推廣應(yīng)用。播種繁殖需要通過層積等技術(shù)，種子處理時間長，要求高，且由于種子產(chǎn)量往往受到氣候影響，限制了西伯利亞杏播種苗培養(yǎng)。利用植物體細胞胚胎發(fā)生方式能用較少的材料,在較短時間內(nèi)大量繁殖出統(tǒng)一優(yōu)良性狀的西伯利亞杏苗木。應(yīng)用體胚發(fā)生技術(shù)繁殖苗木,其不受地區(qū)、氣候等影響,擴繁速度比常規(guī)方法快數(shù)萬倍，廣泛應(yīng)用到多種植物上。但迄今為止,西伯利亞杏組培苗在生產(chǎn)尚未應(yīng)用，對西伯利亞杏體胚發(fā)生的研究未見報道。王鴻、馬鋒旺以西伯利亞杏下胚軸、子葉、莖尖和無性系葉片作為外植體,研究培養(yǎng)試管苗不同外植體、外源植物生長調(diào)節(jié)劑、培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、接種方式等因素對增殖效率、愈傷組織誘導(dǎo)率、再生頻率和試管苗生根的影響。劉小蕾、劉艷萌、張學(xué)英等通過對西伯利亞杏的莖尖、葉片和下胚軸組織培養(yǎng)初步建立了西伯利亞杏再生體系。本文以西伯利亞杏成熟胚為外植體，經(jīng)愈傷組織途徑誘導(dǎo)胚性愈傷、胚性愈傷組織繼代增殖、體細胞胚胎的分化與同步化，以及體細胞胚的成熟與萌發(fā)，從而建立西伯利亞杏體胚發(fā)生體系，為西伯利亞杏快速繁殖、種質(zhì)資源保護等提供參考，為西伯利亞杏人工種子的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的為了解決運用體細胞胚胎發(fā)生技術(shù)實現(xiàn)西伯利亞杏快繁問題，以西伯利亞杏成熟胚為外植體，以B5、WPM等基本培養(yǎng)基附加不同濃度的6-BA、2,4-D、KT、NAA、ABA以及有機附加物等來誘導(dǎo)胚性愈傷組織、胚性愈傷組織增殖、體細胞胚胎分化與同步化、以及體胚成熟與植株再生，并提供一種誘導(dǎo)、繼代及成苗時的方法及培養(yǎng)條件，以實現(xiàn)植株再生與快繁。

本發(fā)明目的實現(xiàn)由以下技術(shù)方案完成：

本發(fā)明包括以下生產(chǎn)步驟：

（1）將成熟的西伯利亞杏種子用刷子刷去表面殘渣，以3%高錳酸鉀溶液浸泡12小時后，自來水沖洗3遍，在干凈的環(huán)境下破殼，取出西伯利亞杏種仁。在超凈工作臺中，先用無菌水將種仁沖洗三遍，用75%酒精浸泡30s后用無菌水清洗3-5次,再用 2%次氯酸鈉溶液消毒3 min,然后用無菌水沖洗3-5次；

（2）將經(jīng)步驟（1）處理過的種子以手術(shù)刀剝?nèi)⊥暾姆N胚后，接種于下列培養(yǎng)基中：B5培養(yǎng)基+6-BA（0.3mg/L）+2,4-D（0.9mg/L）+KT（0.25mg/L）+蔗糖（30g/L）+瓊脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、溫度為23±2℃、暗條件下進行誘導(dǎo)培養(yǎng)35天生成愈傷組織；

（3）將步驟（2）所述的愈傷組織接種于以下培養(yǎng)基中：B5培養(yǎng)基+NAA（0.5mg/L）+ KT（0.2mg/L）+蔗糖（20g/L）+ 還原型谷胱甘肽（100mg/L）+瓊脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、溫度為23±2℃、暗條件下進行繼代培養(yǎng)30天誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織；

（4）將步驟（3）所述的胚性愈傷組織接種于下列培養(yǎng)基中：B5培養(yǎng)基+NAA（0.2mg/L） +蔗糖（20g/L）+水解乳蛋白（500mg/L）+瓊脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、溫度為23±2℃、暗條件下進行增殖培養(yǎng)，每隔30天以相同配方繼代培養(yǎng)進行增殖；

（5）將步驟（4）所述的胚性愈傷組織接種于下列培養(yǎng)基中：B5培養(yǎng)基+6-BA（0.5mg/L）+NAA（1.0mg/L） +蔗糖（20g/L）+水解酪蛋白（800mg/L）+谷氨酰胺（200mg/L）+瓊脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、溫度為23±2℃、暗條件下進行分化培養(yǎng)30天；

（6）將步驟（5）所述的分化而來的上期原胚接種于下列培養(yǎng)基中：B5培養(yǎng)基+ABA（1.5mg/L）+蔗糖（55g/L）+水解酪蛋白（800mg/L）+谷氨酰胺（200mg/L）+肌醇（500mg/L）+瓊脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、溫度為23±2℃、暗條件下同步化培養(yǎng)15天，使上期胚胎發(fā)生發(fā)育達到同步化；

（7）將步驟（6）所述的同步化體細胞胚接種于B5培養(yǎng)基+蔗糖（30g/L）+瓊脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、溫度為23±2℃、暗條件下培養(yǎng)20天后，體胚發(fā)育成熟，達到萌發(fā)的指標。

（8）將步驟（7）所述的分化成熟體細胞胚接種于1/2WPM培養(yǎng)基+蔗糖（20g/L）+瓊脂（6g/L）, pH控制在5.8～6.0、溫度為23±2℃、3000Lx光照條件下培養(yǎng)30天后即可長成根莖葉健全的健壯西伯利亞杏幼苗。

本發(fā)明的優(yōu)點是以西伯利亞杏成熟胚為外植體，不受季節(jié)與環(huán)境條件的影響，繁殖方式低耗高效，能很好地保留西伯利亞杏的優(yōu)良杏狀不發(fā)生改變，對西伯利亞杏種苗的生產(chǎn)繁育提供了強有利的保證。

具體實施方案：

實施例1

（1）將成熟的西伯利亞杏種子用刷子刷去表面殘渣，以3%高錳酸鉀溶液浸泡12小時后，自來水沖洗3遍，在干凈的環(huán)境下破殼，取出西伯利亞杏種仁。在超凈工作臺中，先用無菌水將種仁沖洗三遍，用75%酒精浸泡30s后用無菌水清洗3-5次,再用 2%次氯酸鈉溶液消毒3 min,然后用無菌水沖洗3-5次；

（2）將經(jīng)步驟（1）處理過的種子以手術(shù)刀剝?nèi)⊥暾姆N胚后，接種于下列培養(yǎng)基中：B5培養(yǎng)基+6-BA（0.3mg/L）+2,4-D（0.9mg/L）+KT（0.25mg/L）+蔗糖（30g/L）+瓊脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、溫度為23±2℃、暗條件下進行誘導(dǎo)培養(yǎng)35天生成愈傷組織；

（3）將步驟（2）所述的愈傷組織接種于以下培養(yǎng)基中：B5培養(yǎng)基+NAA（0.5mg/L）+ KT（0.2mg/L）+蔗糖（20g/L）+ 還原型谷胱甘肽（100mg/L）+瓊脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、溫度為23±2℃、暗條件下進行繼代培養(yǎng)30天誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織；

（4）將步驟（3）所述的胚性愈傷組織接種于下列培養(yǎng)基中：B5培養(yǎng)基+NAA（0.2mg/L） +蔗糖（20g/L）+水解乳蛋白（500mg/L）+瓊脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、溫度為23±2℃、暗條件下進行增殖培養(yǎng)，每隔30天以相同配方繼代培養(yǎng)進行增殖；

（5）將步驟（4）所述的胚性愈傷組織接種于下列培養(yǎng)基中：B5培養(yǎng)基+6-BA（0.5mg/L）+NAA（1.0mg/L） +蔗糖（20g/L）+水解酪蛋白（800mg/L）+谷氨酰胺（200mg/L）+瓊脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、溫度為23±2℃、暗條件下進行分化培養(yǎng)30天；

（6）將步驟（5）所述的分化而來的上期原胚接種于下列培養(yǎng)基中：B5培養(yǎng)基+ABA（1.5mg/L）+蔗糖（55g/L）+水解酪蛋白（800mg/L）+谷氨酰胺（200mg/L）+肌醇（500mg/L）+瓊脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、溫度為23±2℃、暗條件下同步化培養(yǎng)15天，使上期胚胎發(fā)生發(fā)育達到同步化；

（7）將步驟（6）所述的同步化體細胞胚接種于B5培養(yǎng)基+蔗糖（30g/L）+瓊脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、溫度為23±2℃、暗條件下培養(yǎng)20天后，體胚發(fā)育成熟，達到萌發(fā)的指標。

（8）將步驟（7）所述的分化成熟體細胞胚接種于1/2WPM培養(yǎng)基+蔗糖（20g/L）+瓊脂（6g/L）, pH控制在5.8～6.0、溫度為23±2℃、3000Lx光照條件下培養(yǎng)30天后即可長成根莖葉健全的健壯西伯利亞杏幼苗。

本發(fā)明方法胚性愈傷誘導(dǎo)率為68.5%，增殖期以3.8倍速率增殖，分化期胚性愈傷平均分化產(chǎn)生體細胞胚165個/g，成熟體細胞胚萌發(fā)率為86.5%。

雖然以上對本發(fā)明目的的構(gòu)思和實施例作了詳盡說明，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以認識到，在沒有脫離權(quán)利要求限定范圍的前提條件下，仍然可以對本發(fā)明作出各種改進和變換，而這種改進和變換仍然應(yīng)當屬于本發(fā)明的保護范圍。