本發(fā)明涉及一種抗菌肽制劑、制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，在臨床上的病菌感染相當(dāng)嚴(yán)重，近20年來它己經(jīng)成為威脅人類健康的一大殺手。而且，越來越多的細(xì)菌可以抵御抗生素的治療，從而對(duì)公眾健康造成了嚴(yán)重的威脅。在美國，1998年因?yàn)槟退幮约?xì)菌感染而失去的生命比在越南戰(zhàn)場(chǎng)上還要多。一度輕而易舉就可以被抗生素殺死的病菌如：金黃色葡萄球菌、肺炎球菌、綠膿桿菌、白色念珠菌、大腸桿菌等，現(xiàn)在因?yàn)楫a(chǎn)生了耐藥性而變得越來越兇悍，讓人越來越束手無策。而其中的耐藥性金黃色葡萄球菌是其中最為活躍的分子，由它引起的感染，不僅在常規(guī)治療下療效欠佳或完全無效，同時(shí)還可以改變病人的正常菌群的生態(tài)狀況，從而給病人造成額外的痛苦，增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和不幸。
目前市面上常用抗菌劑有含氯類、醛類、醇類、碘類、酚類以及季銨鹽類等，存在對(duì)皮膚粘膜有刺激作用，或者抗菌譜窄，或者長期會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌耐藥等問題。特別是應(yīng)用于敏感部位的抗菌劑對(duì)制劑配方要求更高，如女性私密部位專用抗菌劑。女性私密部位常發(fā)生細(xì)菌性、霉菌性、滴蟲性及非特異性陰道炎、宮頸炎、外陰炎、陰部瘙癢等癥。而由于這些部位的敏感性，對(duì)治療藥物要求更高，常見現(xiàn)有消毒劑會(huì)對(duì)皮膚粘膜產(chǎn)生刺激，抑菌譜不夠廣或者由于抗菌機(jī)制本身原因容易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性不適用長期使用和預(yù)防使用，現(xiàn)有消毒劑存在諸多缺點(diǎn)無法滿足上述要求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是公開一種生物抗菌多肽制劑、制備方法及其應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。
所述的生物抗菌多肽制劑，以水為載體，含有如下重量百分比的組分：
生物抗菌肽BQ 0.1％-10％；
聚六亞甲基雙胍(PHMB) 0.01-1％
優(yōu)選的，以水為載體，含有如下重量百分比的組分：
生物抗菌肽BQ 0.1％-2％；
聚六亞甲基雙胍(PHMB) 0.01-0.5％
所述生物抗菌肽BQ是氨基酸序列為Lys Trp Lys Ser Phe Ile Lys Lys Leu Thr Ser Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe的多肽，所述生物抗菌肽BQ的制備、純化及性質(zhì)已經(jīng)在授權(quán)公告號(hào)CN101570569B發(fā)明專利中，有具體的記載；
所述生物抗菌肽BQ是一種生物蛋白，在液體制劑中，要保持其蛋白活性非常重要，而一般化學(xué)試劑，尤其是高分子材料，表面活性劑成份對(duì)蛋白活性均會(huì)造成影響；
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，聚六亞甲基雙胍為一種對(duì)該抗菌肽BQ活性不具有影響的化合物，兩者可以聯(lián)合使用。聚六亞甲基雙胍本身是一種良好的廣譜殺菌劑，其與抗菌肽BQ聯(lián)合使用，可以極大的發(fā)揮制劑的抗菌效果。聚六亞甲基雙胍濃度極低(重量含量萬分之一)的情況下就可以維持好抗菌肽BQ的蛋白活性，使得抗菌肽BQ的效應(yīng)發(fā)揮最大；
進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的生物抗菌多肽制劑，以水為載體，還包括醫(yī)藥學(xué)上可接受的輔料，磷酸鹽，如磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀；保護(hù)劑，如甘氨酸；穩(wěn)定劑，如殼聚糖；潤膚劑，如甘油；無機(jī)鹽，如氯化鈉、氯化鉀；
進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的生物抗菌多肽制劑，以水為載體，含有如下重量百分比的組分：
最優(yōu)選的，以水為載體，含有如下重量百分比的組分：
本發(fā)明的制備方法，包括如下步驟：
(1)將所述的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀溶解于水中，獲得溶液A；
(2)將生物抗菌肽BQ、聚六亞甲基雙胍和甘氨酸，溶于溶液A，然后將殼聚糖、氯化鈉溶于水中，得到溶液B；
(3)將上述溶液A和溶液B混合后，加入甘油，即可獲得所述的生物抗菌多肽制劑；
動(dòng)物試驗(yàn)證明，所述的生物抗菌多肽制劑，具有十分好的滅菌效果，尤其對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、大腸桿菌和病毒，更具有明顯的殺滅作用，可廣泛、安全、實(shí)用地用于手、皮膚、粘膜的消毒，以及家庭、餐館、賓館酒店、公共交通工具、幼兒園、醫(yī)院等場(chǎng)合中包括食飲具在內(nèi)的一般物品表面的消毒，和空氣消毒、動(dòng)物消毒、寵物消毒等。
所述的生物抗菌多肽制劑，可通過浸漬、涂抹、噴灑途徑施加于需要消毒的部位，劑量一般為一日1-3次，每次使用量為能均勻覆蓋消毒表面部位。
本發(fā)明所述的生物抗菌多肽制劑，抗菌肽BQ與聚六亞甲基雙胍復(fù)配物并不是兩種物質(zhì)功能簡單疊加，而是具有協(xié)同增強(qiáng)作用，復(fù)配物的殺菌效果2-20倍于兩者殺菌效果的簡單疊加。復(fù)配物的殺菌譜也明顯擴(kuò)大，對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和常見病毒，尤其是對(duì)一般殺菌劑都較難處理的耐藥性革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均可達(dá)到很好的殺滅效果。
本發(fā)明生物抗菌多肽制劑的有益效果是：
1、殺菌效果好。該制劑核心殺菌成份為新型抗菌肽，其對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌均具有很強(qiáng)的殺菌作用。體外實(shí)驗(yàn)作用2分鐘即可達(dá)到99.9％的殺菌率，如果作用5分鐘～10分鐘，可使殺菌率達(dá)到100％。
2、安全性高：制劑核心殺菌成份為生物蛋白，即使經(jīng)組織吸收后很快就會(huì)降解為氨基酸，對(duì)人體不會(huì)產(chǎn)生毒性或者殘留問題。
3、穩(wěn)定性強(qiáng)。本品在25℃常溫保存六個(gè)月，生物活性基本沒有改變。本品在4～8℃可以保存2年。
4、可做預(yù)防用藥：本發(fā)明主要作用組分為生物制劑，克服了傳統(tǒng)化學(xué)類制劑對(duì)粘膜具有刺激性，細(xì)菌容易產(chǎn)生耐藥性的缺點(diǎn)。易被機(jī)體所接受，且沒有任何毒副作用。適用于長期使用或者預(yù)防用藥。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
1、組成和配比：(重量百分比)
生物抗菌肽BQ 0.1％；聚六亞甲基雙胍(PHMB)1％；甘氨酸1％；殼聚糖1％；甘油1％；磷酸二氫鉀1％；磷酸氫二鈉1％；氯化鈉0.1％；其余用蒸餾水。
2、配制步驟
(1)將磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉，溶于蒸餾水中，得到溶液A；
(2)按照制劑處方，稱取所需的生物抗菌肽BQ、聚六亞甲基雙胍和甘氨酸，加入到部分A溶液中，攪拌并使溶解，得到溶液B。
(3)按配比稱取殼聚糖、氯化鈉溶于蒸餾水中，得到溶液C；
(4)將上述溶液B和溶液C混合后，加入甘油，攪拌均勻，即得成品。
分裝于塑料或者玻璃瓶中直接作為消毒液使用；也可分裝于帶手動(dòng)泵的噴霧瓶中，制備成消毒噴霧劑；也可作為濕巾添加液吸附于無紡布中，制成衛(wèi)生濕巾。
實(shí)施例2
1、組成和配比：(重量百分比)
生物抗菌肽BQ 10％；聚六亞甲基雙胍(PHMB)0.01％；甘氨酸8％；殼聚糖10％；甘油5％；磷酸二氫鉀20％；磷酸氫二鈉30％；氯化鈉2％；其余用蒸餾水，各組份的重量百分比總和為100％。
2、制備方法同實(shí)施例1；
分裝于塑料或者玻璃瓶中直接作為消毒液使用；也可分裝于帶手動(dòng)泵的噴霧瓶中，制備成消毒噴霧劑；也可作為濕巾添加液吸附于無紡布中，制成衛(wèi)生濕巾。
實(shí)施例3
1、組成和配比
生物抗菌肽BQ 2％；聚六亞甲基雙胍(PHMB)0.02％；甘氨酸2％；殼聚糖2％；甘油3％；磷酸二氫鉀10％；磷酸氫二鈉20％；氯化鈉1％；其余用蒸餾水，各組份的重量百分比總和為100％。
2、制備方法同實(shí)施例1。
分裝于塑料或者玻璃瓶中直接作為消毒液使用；也可分裝于帶手動(dòng)泵的噴霧瓶中，制備成消毒噴霧劑；也可作為濕巾添加液吸附于無紡布中，制成衛(wèi)生濕巾。
實(shí)施例4
1、組成和配比
生物抗菌肽BQ 1％；聚六亞甲基雙胍(PHMB)0.01％；甘氨酸8％；殼聚糖10％；甘油80％；磷酸二氫鉀5％；磷酸氫二鈉10％；氯化鈉0.75％；其余用蒸餾水，各組份的重量百分比總和為100％。
2、制備方法同實(shí)施例1。
分裝于塑料或者玻璃瓶中作為涂抹劑使用。
實(shí)施例5
下表是抗菌肽BQ與抗菌肽BQ復(fù)配物對(duì)各種微生物的殺滅作用比較(對(duì)微生物殺菌率試驗(yàn)按GB 15979-2002＿1＿2002-03-05＿0相關(guān)規(guī)定進(jìn)行試驗(yàn))：
由上表可知抗菌肽BQ與聚六亞甲基雙胍復(fù)配物的殺菌作用并不是兩種物質(zhì)殺菌作用的簡單疊加，抗菌肽BQ與聚六亞甲基雙胍聯(lián)合使用，可以極大的發(fā)揮抗菌肽BQ的抗菌效果。且聚六亞甲基雙胍濃度極低(重量含量萬分之一)的情況下就可以維持好抗菌肽BQ的蛋白活性，并使得抗菌肽BQ有效作用濃度降低，仍可以達(dá)到同樣高效的殺菌效果。
實(shí)施例6
本發(fā)明生物抗菌多肽制劑的臨床試用報(bào)告說明其功效：
試驗(yàn)一：生物抗菌多肽制劑對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌殺菌實(shí)驗(yàn)
一、器材
1、試驗(yàn)菌：金黃色葡萄球菌第6代(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院消毒檢測(cè)中心提供)、大腸桿菌笫6代(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院消毒檢測(cè)中心提供)
2、樣品：實(shí)施例1的生物抗菌多肽制劑
3、中和劑：2％組氨酸、8％卵磷臘、10％吐溫-80的D/E肉湯
4、PBS：0.03mol/L磷酸鹽緩沖液
5、GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)
6、培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)瓊脂
7、機(jī)械秒表(504型)
8、可調(diào)恒溫水浴箱(CBN28-3)
二、方法
1、檢驗(yàn)依據(jù)：《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》GB15979-2002附錄C3
2、中和劑鑒定試驗(yàn)：試驗(yàn)菌株：金黃色葡萄球菌樣品濃度：1：20稀釋液，作用時(shí)間：0.5min
3、定量殺菌試驗(yàn)：樣品濃度：1:20稀釋液
4、試驗(yàn)溫度20℃，試驗(yàn)重復(fù)3次
三、結(jié)果
1、中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果表明：笫1、2組生長茵落數(shù)分別為0cfu/mL和4.47*102cfu/mL，第3、4、5組三組間誤差率分別為7.80％、9.72％、4.08％。
表1中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果
2、試驗(yàn)溫度20℃時(shí)，樣品1：:2稀釋液作用2分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌殺菌率均為100％。
表2對(duì)實(shí)驗(yàn)菌殺菌效果
實(shí)施例7
試驗(yàn)二：實(shí)施例1的生物抗菌多肽制劑對(duì)白色念珠菌殺菌實(shí)驗(yàn)
一、器材
1、試驗(yàn)菌：白色念珠菌第6代(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院消毒檢測(cè)中心提供)
2、樣品：生物抗菌多肽制劑
3、中和劑：2％組氨酸、8％卵磷臘、10％吐溫-80的D/E肉湯
4、PBS：0.03mol/L磷酸鹽緩沖液
5、GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)
6、培養(yǎng)基：沙氏培養(yǎng)基
7、機(jī)械秒表(504型)
8、可調(diào)恒溫水浴箱(CBN28-3)
二、方法
1、檢驗(yàn)依據(jù)：《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》GB15979-2002附錄C3
2、中和劑鑒定試驗(yàn)：樣品濃度：原液，作用時(shí)間：0.5min
3、定量殺菌試驗(yàn)：樣品濃度：原液
4、試驗(yàn)溫度20℃，試驗(yàn)重復(fù)3次
三、結(jié)果
1、中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果表明：笫1、2組生長茵落數(shù)分別為0cfu/mL和1.06*103cfu/mL，第3、4、5組三組間誤差率分別為7.78％、13.83％、9.08％。
表3中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果
2、試驗(yàn)溫度20℃時(shí)，樣品1：:2稀釋液作用2分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘對(duì)白色念珠菌的殺菌率均為100％。
表4對(duì)實(shí)驗(yàn)菌殺菌效果
實(shí)施例8
試驗(yàn)三：實(shí)施例3的生物抗菌多肽制劑對(duì)流感病毒的殺菌實(shí)驗(yàn)
1、材料與方法
1.1測(cè)試樣品：實(shí)施例3的生物抗菌多肽制劑。
1.2試驗(yàn)菌株：
流感病毒(H3N2)
1.3試驗(yàn)依據(jù)：
衛(wèi)生部《消毒技術(shù)規(guī)范》中相應(yīng)規(guī)定。
2、對(duì)流感病毒的滅活試驗(yàn)結(jié)果
在試驗(yàn)溫度為20℃±1℃條件下，經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)證明，測(cè)試樣品原液作用5.0min，對(duì)流感病毒平均殺滅對(duì)數(shù)值>5.00。(結(jié)果見表5)
表5對(duì)流感病毒的滅活效果
注：陽性對(duì)照平均對(duì)數(shù)值及范圍4.32(4.23-4.50)。
實(shí)施例9
試驗(yàn)三：實(shí)施例2的生物抗菌多肽制劑陰道粘膜刺激性試驗(yàn)
―、材料和動(dòng)物
1、受試物：樣品為無色液體，取樣品原液作為受試物，
2、動(dòng)物：健康雌性新西蘭白兔6只，普通級(jí)，金陵種兔場(chǎng)提供，合格證號(hào)：SCXK(蘇)2012—0003號(hào)，體重2.0-2.4kg。
3.試驗(yàn)條件：動(dòng)物環(huán)境設(shè)施合格證號(hào)：SYXK(蘇)2012—0036號(hào)；環(huán)境溫度：22±2℃；相對(duì)濕度：40-70％；飼料來源及證號(hào)：江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司，蘇A飼生字(2002)009號(hào)。主要儀器：嬰兒秤(05-324)，病理切片機(jī)，顯微鏡。
二、方法
1、檢驗(yàn)依據(jù)：衛(wèi)生部(2002年版)《消毒技術(shù)規(guī)范》第二部分2.3.5陰道黏膜刺激試驗(yàn)。
2、試驗(yàn)方法：動(dòng)物分入試驗(yàn)組、對(duì)照組，每組3只。動(dòng)物仰面固定，暴露出會(huì)陰和陰道口。將小號(hào)消毐導(dǎo)尿管與2mL注射器連接，導(dǎo)管用受試物濕潤后輕柔地插入動(dòng)物陰道內(nèi)(4-5cm),并緩慢注入2mL受試物，抽出導(dǎo)管，完成染毐。對(duì)照組動(dòng)物闬生理鹽水作同樣處理，24mL后采用氣栓法處死動(dòng)物，剖腹取出完整的陰道，縱向切開，肉眼觀察有無充血、水腫等表現(xiàn)，供病理取材時(shí)參考，將陰道放入10％福爾馬林中固定24h以上，選取陰道的兩端和中央3個(gè)部位的組織制片，HE染色后進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
肉眼觀察可見對(duì)照組2號(hào)和試驗(yàn)組各動(dòng)物陰道黏膜輕度致中度水腫。組織病理學(xué)觀察結(jié)果見下表。
受試物對(duì)動(dòng)物陰道黏膜刺激反應(yīng)評(píng)分
四、結(jié)論
受試物對(duì)家兔陰道粘膜刺激指數(shù)為1.56，陰道粘膜刺激強(qiáng)度為極輕刺激性。