本發(fā)明屬于植物室內(nèi)無(wú)土栽培和繁殖方法，具體涉及冬季煙草室內(nèi)加代繁育方法。
背景技術(shù)：
無(wú)土栽培是設(shè)施農(nóng)業(yè)中的重要技術(shù)方法，利用營(yíng)養(yǎng)液直接在水培裝置中進(jìn)行植物水培種植，或用基質(zhì)栽培固定植物后用營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行滴灌、滲灌或澆灌，其具有生長(zhǎng)環(huán)境條件可控、周年種植生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)效益高的優(yōu)勢(shì)，所以目前在蔬菜和花卉等經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的植物中應(yīng)用較廣泛。與此同時(shí)，利用水培技術(shù)和方法，可以開(kāi)展植物營(yíng)養(yǎng)和抗逆性的水培鑒定研究，其中水培技術(shù)用于植物材料耐鹽性篩選(一種篩選甘薯耐鹽突變體的方法，CN101002539A；篩選作物抗逆品系的方法，CN101385438A)等研究比較多，有關(guān)煙草水培技術(shù)主要是輔助的水培固定裝置（組合式煙草水培煙株固定裝置，CN201595055U）和煙草抗病性水培鑒定(一種煙草黑脛病抗性的苗期恒溫水培鑒定方法CN101999287A；一種新的煙草黑脛病抗性快速鑒定方法，CN102498878A)，而綜合利用無(wú)土栽培技術(shù)和剪葉處理控制植物生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)冬季煙草重要遺傳材料在室內(nèi)有限環(huán)境條件下進(jìn)行加代繁育和生物學(xué)研究相對(duì)較少。
煙草和其他作物一樣，為加快其繁育進(jìn)程，一年需要種兩季，冬天可在海南進(jìn)行煙草育種材料的加代繁育，或利用具有可控光源和加熱取暖設(shè)施的溫室進(jìn)行加代繁育。正常生長(zhǎng)的煙株一般高120～150cm，按正常煙草栽培密度1100株/畝計(jì)算，單株煙占地~0.61m2；溫室盆栽條件下，一塊2.4m×0.73m的水泥平地可以擺16個(gè)花盆（上部直徑32cm，底部直徑25cm，高27cm），以供煙苗正常生長(zhǎng)成熟，煙草單株溫室占地~0.11m2。一般的遺傳研究或遺傳育種材料會(huì)有上百或上千株，需要大田栽培和冬天南繁，溫室栽培可以控制光溫條件，但日光溫室建造成本和冬天運(yùn)行成本高，而且普通栽培煙草不具有蔬菜、花卉等植物株型小和生育期短的生物學(xué)特性，所以在溫室條件下只能種植少量煙株，使冬天溫室加代繁育煙草在使用成本和實(shí)際可用面積上具有一定的局限性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明基于普通煙草的生物學(xué)特性，綜合利用水培和無(wú)土基質(zhì)栽培技術(shù)，對(duì)煙草遺傳材料進(jìn)行水培和基質(zhì)栽培，并且在其生長(zhǎng)前期進(jìn)行剪葉處理，抑制煙苗底部節(jié)間伸長(zhǎng)，達(dá)到控制煙草株高和煙葉大小，以利于冬天在室內(nèi)有限環(huán)境條件下進(jìn)行大批量煙株的栽培與花藥培養(yǎng)研究，代替冬天南繁加代的步驟和克服日光溫室栽培的場(chǎng)地和成本限制。
本發(fā)明的突出特點(diǎn)是利用煙草的自然生長(zhǎng)特性，結(jié)合水培和基質(zhì)栽培，以及剪葉處理技術(shù)，控制煙草株高在35～65cm，節(jié)間長(zhǎng)度1～2cm，中部煙葉長(zhǎng)15～25cm，寬 8～12cm，株型顯著減小，并且正常生長(zhǎng)和開(kāi)花結(jié)實(shí)，室內(nèi)煙草單株占地0.03m2，相比大田單株占地面積，可提高空間利用率20.3倍，相比溫室提高3.7倍，從而較大程度上提高室內(nèi)煙草無(wú)土基質(zhì)栽培的空間利用率，有利于冬季在室內(nèi)大批量種植煙草遺傳材料，開(kāi)展花藥培養(yǎng)等生物學(xué)研究工作。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
冬季煙草室內(nèi)加代繁育方法，按如下步驟進(jìn)行：
步驟1）煙草育苗
首先用0.9mm孔徑篩子將蛭石過(guò)篩控制蛭石粒徑大小，剔除其中比較大的蛭石，過(guò)篩后的蛭石裝到耐高溫的鐵磁盤(pán)中，在烘箱中高溫滅菌，待冷卻后用蒸餾水浸潤(rùn)蛭石，將煙草種子撒播到蛭石育苗基質(zhì)上，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)正常光照催芽；待煙苗長(zhǎng)出2片真葉后備用；
步驟2）無(wú)土定植
將步驟1）中獲得的長(zhǎng)出2片真葉煙苗，移植在漂浮板上的定植孔中，再將漂浮板放在水培容器中并加入完全營(yíng)養(yǎng)液，對(duì)煙苗進(jìn)行水培至成苗期；
所述漂浮板選用1～1.5cm厚度的泡沫板，先將泡沫板裁剪成長(zhǎng)56cm，寬37cm，然后在泡沫板上用直徑1cm打孔器按一定行株距打定植孔，在打有定植孔的泡沫板背面用針線縫合固定上一塊空隙比較小又利于根系扎入的紗網(wǎng)，制成漂浮板；
所述水培容器利用長(zhǎng)×寬×高為59cm×39cm×14.5cm塑料周轉(zhuǎn)箱，將其內(nèi)壁用黑色塑料膜包裹，透明膠固定，制作成一個(gè)盛水防漏遮光的水培容器；
每1升所述完全營(yíng)養(yǎng)液中含有：
濃度為1 mol/L的 KNO3溶液，5.0mL；
濃度為1 mol/L的MgSO4·7H2O 溶液，2.0 mL；
濃度為1 mol/L的KH2PO4溶液，1.0 mL；
濃度為1 mol/L的Ca（NO3）2·4H2O溶液，5 mL；
鐵鹽溶液，10 mL：每1升所述鐵鹽溶液由2.78 g的FeSO4·7H2O和3.72 g的EDTA·2Na混合制備而成；
還含有微量元素：H3BO3，2.86g；MnCL2·4H2O，1.81g；ZnSO4·7H2O，0.22g；CuSO4·5H2O，0.08g；H2MoO4·4H2O，0.09g；
余量為水；
步驟3）基質(zhì)移栽培植
將蛭石裝入小花盆中，小花盆依次排列放置在硬質(zhì)紙盒水培容器中；將水倒入水培容器中，當(dāng)硬質(zhì)紙盒水培容器中的水浸透蛭石基質(zhì)后，再倒入完全營(yíng)養(yǎng)液；
再將步驟2）中成苗期的煙苗移栽到小花盆中后，將硬質(zhì)紙盒水培容器移至光照室的培養(yǎng)架上光照培養(yǎng)，光照室溫度25～28℃，光照時(shí)間10～12h，每7～14d換一次水和完全營(yíng)養(yǎng)液的混合液，換混合液前栽培基質(zhì)控水晾置1～2d，以利于根系生長(zhǎng)；
在煙苗16～20葉期以前，每7～14d剪葉，剪掉中下部煙葉長(zhǎng)度的2/3～1/2，以抑制節(jié)間伸長(zhǎng)，而促進(jìn)頂部煙葉生長(zhǎng)；16～20葉期以后，停止剪葉，待煙株正常生長(zhǎng)和開(kāi)花結(jié)種子；利用花朵取花藥可以開(kāi)展花藥培養(yǎng)試驗(yàn)，利用所結(jié)種子可以用于繁殖。
所述硬質(zhì)紙盒水培容器是利用硬質(zhì)紙盒箱在其內(nèi)壁用黑色塑料膜包裹，并用透明膠固定，制作成一個(gè)盛水防漏遮光的水培容器；該水培容器長(zhǎng)度控制在30～120cm，寬度控制在20～47cm，高度控制在5～15cm。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1
冬季煙草室內(nèi)加代繁育方法，按如下步驟進(jìn)行：
步驟1）煙草育苗
首先用0.9mm孔徑篩子將蛭石過(guò)篩控制蛭石粒徑大小，剔除其中比較大的蛭石，過(guò)篩后的蛭石裝到耐高溫的方形鐵磁盤(pán)（44cm×34cm）中，在烘箱中100℃高溫滅菌，待冷卻后用蒸餾水浸潤(rùn)蛭石，將煙草種子K326、B21、F1(K326/B21)和F1(B21/K326）（煙草種子由湖北煙草科研所提供）撒播到蛭石育苗基質(zhì)上，在光照培養(yǎng)箱（25℃～28℃）內(nèi)正常光照催芽；待煙苗長(zhǎng)出2片真葉后備用。
步驟2）無(wú)土定植
將步驟1）中獲得的長(zhǎng)出2片真葉煙苗，移植在漂浮板上的定植孔中，再將漂浮板放在水培容器中并加入完全營(yíng)養(yǎng)液，用稀鹽酸調(diào)節(jié)完全營(yíng)養(yǎng)液pH在6.5；對(duì)煙苗進(jìn)行水培至成苗期。
所述漂浮板選用1cm厚度的泡沫板，先將泡沫板裁剪成長(zhǎng)56cm，寬37cm，然后在泡沫板上用直徑1cm打孔器按一定行株距打定植孔，在打有定植孔的泡沫板背面用針線縫合固定上一塊空隙比較小又利于根系扎入的紗網(wǎng)，制成漂浮板。
所述水培容器利用長(zhǎng)×寬×高為59cm×39cm×14.5cm塑料周轉(zhuǎn)箱，將其內(nèi)壁用黑色塑料膜包裹，透明膠固定，制作成一個(gè)盛水防漏遮光的水培容器。
選用K326、B21、F1(K326/B21)和F1(B21/K326）煙苗開(kāi)展鉀脅迫對(duì)比試驗(yàn)
取上述4～5葉期煙苗，先用自來(lái)水沖洗根部蛭石，再把煙苗根系直接放到定植孔中，每個(gè)遺傳材料在兩個(gè)水培漂浮板上各定植2行，在完全營(yíng)養(yǎng)液中先緩苗一周；緩苗后，在一個(gè)水培容器中加入完全營(yíng)養(yǎng)液（見(jiàn)發(fā)明內(nèi)容部分），另一個(gè)水培容器中加入缺鉀營(yíng)養(yǎng)液，每周換一次營(yíng)養(yǎng)液；三周后調(diào)查不同煙草遺傳材料的葉形（長(zhǎng)和寬）、根長(zhǎng)、煙株鮮重等指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1；
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：相比對(duì)照正常處理，在鉀脅迫條件下，不同遺傳材料各指標(biāo)均明顯降低或減小，其中葉片大小和地上重影響較大，兩個(gè)品種正反雜交材料對(duì)鉀脅迫的響應(yīng)程度存在一定差異，說(shuō)明部分胞質(zhì)效應(yīng)影響煙草對(duì)鉀脅迫的響應(yīng)。
每1升所述缺鉀營(yíng)養(yǎng)液中含有：
濃度為5 mol/L的NH4NO3溶液，0.5 mL；
濃度為3 mol/L的NaH2PO4·2H2O溶液，0.33 mL；
濃度為1 mol/L的MgSO4·7H2O 溶液，2.0 mL；
濃度為1 mol/L的Ca（NO3）2·4H2O溶液，5 mL；
鐵鹽溶液，10 mL：每1升所述鐵鹽溶液由2.78 g的FeSO4·7H2O和3.72 g的EDTA·2Na混合制備而成；
還含有微量元素：H3BO3，2.86g；MnCL2·4H2O，1.81g；ZnSO4·7H2O，0.22g；CuSO4·5H2O，0.08g；H2MoO4·4H2O，0.09g；
余量為水。
步驟3）基質(zhì)移栽培植
將蛭石裝入小花盆中，小花盆依次排列放置在硬質(zhì)紙盒水培容器中；將水倒入水培容器中，當(dāng)硬質(zhì)紙盒水培容器中的水浸透蛭石基質(zhì)后，再倒入完全營(yíng)養(yǎng)液。
再將步驟2）中成苗期的煙苗移栽到小花盆中后，將硬質(zhì)紙盒水培容器移至光照培養(yǎng)室的培養(yǎng)架上光照培養(yǎng)，設(shè)定溫度25～28℃，光照時(shí)間10～12h，每7～14d換一次完全營(yíng)養(yǎng)液，換營(yíng)養(yǎng)液前栽培基質(zhì)控水晾置1～2d，以利于根系生長(zhǎng)。
在煙苗16～20葉期以前，每7～14d剪葉，剪掉中下部煙葉長(zhǎng)度的2/3～1/2，以抑制節(jié)間伸長(zhǎng)，而促進(jìn)頂部煙葉生長(zhǎng)；16～20葉期以后，停止剪葉，待煙株正常生長(zhǎng)和開(kāi)花結(jié)種子；剪葉處理的煙株，一般在基質(zhì)栽培3～4個(gè)月后，煙株高35～45cm ，中部煙葉長(zhǎng)15～25cm，寬8～12cm，并且每個(gè)花序正常開(kāi)花6～8朵，由于煙草種子繁殖系數(shù)高，可以滿足正常的留種，以備開(kāi)春播種繁育。
所述硬質(zhì)紙盒水培容器是利用硬質(zhì)紙盒箱在其內(nèi)壁用黑色塑料膜包裹，并用透明膠固定，制作成一個(gè)盛水防漏遮光的水培容器；該水培容器長(zhǎng)度控制在30～120cm，寬度控制在20～47cm，高度控制在5～15cm。
步驟4）煙草花藥培養(yǎng)
選取F1(B21/K326)和F1(K326/B21) 遺傳材料開(kāi)展花藥培養(yǎng)構(gòu)建煙草DH遺傳群體；待F1(B21/K326)和F1(K326/B21)開(kāi)花時(shí)，將花萼和花瓣等長(zhǎng)的花朵全部剪下，放在濕潤(rùn)的紗布中，將其放入編有號(hào)碼的一次性自封袋中，自封袋不封口，放在4℃冰箱中以備用；在無(wú)菌操作臺(tái)上，用捻指將花藥取出，放在滅菌的紗布上折疊包裹后在70%（v/v）酒精中消毒10s，然后在10%（m/v）次氯酸鈣溶液中消毒5～10min，用滅菌蒸餾水浸洗2～3次后接種在煙草花藥培養(yǎng)H培養(yǎng)基中；一個(gè)月后花藥中長(zhǎng)出單倍體苗，在其4～6葉期，取出單倍體苗用90mg/L的秋水仙素溶液處理48h，再用滅菌蒸餾水清洗后，轉(zhuǎn)接到MS (Murashige and Skoog)培養(yǎng)基中成苗；然后在室內(nèi)無(wú)土基質(zhì)中栽培煉苗，溫室移栽到土壤中。煙草在剪取花朵后，會(huì)刺激煙株腋芽的生長(zhǎng)和成花，所以花藥接種一個(gè)月后，煙株會(huì)長(zhǎng)出新的花序，可以繼續(xù)留種繁育。
表 1