本發(fā)明涉及一種體胚發(fā)生大量繁殖忽地笑方法，屬于植物的人工繁殖和栽培方法技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

忽地笑(Lycoris aurea Herb.)又稱(chēng)黃花石蒜，主產(chǎn)我國(guó)，分布于我國(guó)西南、華東、華南、西北地區(qū)的16個(gè)省區(qū)，日本和緬甸也有少量分布。忽地笑的花葉均具有頗高的觀賞價(jià)值，其花為金黃色，華亭挺拔，花型奇特；花后冬春季又可觀葉，其葉形似蘭草，姿態(tài)優(yōu)雅。在日本、荷蘭等一些國(guó)家，其道路、庭院都廣泛栽培忽地笑，是一種頗受人們喜愛(ài)的庭院觀賞植物。

另外，忽地笑亦具有很高的藥用價(jià)值，其鱗莖是提取加蘭他敏的良好原料，加蘭他敏在忽地笑中的含量很高，野生資源中發(fā)現(xiàn)的最高含量為0.2％。目前加蘭他敏的市場(chǎng)價(jià)格為40萬(wàn)元每公斤，因此忽地笑的人工繁育栽培蘊(yùn)藏著巨大的市場(chǎng)前景和社會(huì)效益。

雖然我國(guó)的忽地笑資源豐富，但由于目前忽地笑種球市場(chǎng)需求日益增大。而其栽培技術(shù)落后，種球繁殖率低，導(dǎo)致其野生資源遭到亂采濫挖。近幾年來(lái)，由于制藥工業(yè)的大量提取，原分布最廣、蘊(yùn)藏量最多的紅花石蒜(L.radiata)和忽地笑(L.aurea)的野生資源也急劇減少。要解決這一問(wèn)題，組織培養(yǎng)是一條有效途徑，但長(zhǎng)期以來(lái)忽地笑的組織培養(yǎng)受其種球繁殖率低、褐化等問(wèn)題較為嚴(yán)重的影響，效率一直較低。之前報(bào)道的忽地笑組織培養(yǎng)大多以誘導(dǎo)不定芽為主，少數(shù)誘導(dǎo)愈傷的報(bào)道主要以小鱗莖和種子為于是材料，而且誘導(dǎo)率和再分化率較低，繁殖系數(shù)不高。本發(fā)明通過(guò)先誘導(dǎo)出忽地笑的不定芽，在對(duì)其無(wú)菌苗進(jìn)行誘導(dǎo)，從體細(xì)胞胚的發(fā)生途徑進(jìn)行忽地笑愈傷組織誘導(dǎo)，首次將除草劑毒莠定用于忽地笑的組織培養(yǎng)，獲得了穩(wěn)定的可繼代增殖的愈傷組織，誘導(dǎo)率可達(dá)到95％以上，經(jīng)過(guò)合理的激素調(diào)配，誘導(dǎo)出的愈傷組織可再分化出大量的不定芽。此方法對(duì)比傳統(tǒng)的植物生長(zhǎng)激素調(diào)節(jié)，將忽地笑的繁殖系數(shù)至少提高了8倍以上，大大提高了忽地笑組培的繁殖效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種體胚發(fā)生的忽地笑的繁殖方法，進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)以及以忽地笑組培為基礎(chǔ)的其他學(xué)科的研究工作的需要。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的，該種忽地笑繁殖方法的主要特點(diǎn)是：

A外殖體消毒：選取在-4℃，保存30天以上的忽地笑小鱗莖，剝?nèi)ネ鈱喻[片，切除根部，用0.1％的安利洗滌液在搖床上震蕩洗滌15～20min，流水沖洗30～60min后，再在超凈工作臺(tái)上用75％的酒精漂洗30s，無(wú)菌水清洗4遍后，用含2～5％次氯酸鈉滅菌20～30min，無(wú)菌水沖洗4-5遍，最后用無(wú)菌濾紙吸干表面水分；

B叢生芽誘導(dǎo)：將消毒好的忽地笑切去上部1/2，將帶有鱗莖盤(pán)的鱗莖均勻分為4-8塊，接種到以下培養(yǎng)基中：MS基本培養(yǎng)基，適當(dāng)濃度的植物生長(zhǎng)激素，蔗糖(食用糖)20～40g/L，適當(dāng)pH值；培養(yǎng)溫度28±1℃，光照強(qiáng)度1000～3000lx，光照時(shí)間10～16h，進(jìn)行光照培養(yǎng)；

C愈傷組織誘導(dǎo)：將不定芽萌發(fā)后培養(yǎng)20天左右的小鱗莖切開(kāi)，去除原有鱗片和褐化部分，接種到以下培養(yǎng)基中：MS基本培養(yǎng)基，蔗糖(食用糖)20～40g/L，適當(dāng)濃度植物生長(zhǎng)激素，適當(dāng)pH值；培養(yǎng)溫度28±1℃；

D愈傷組織增殖：將誘導(dǎo)出20天左右的愈傷組織切下，接種到以下培養(yǎng)基上：MS基本培養(yǎng)基，適當(dāng)植物生長(zhǎng)激素，培養(yǎng)溫度28±1℃，光照時(shí)間10～16h，進(jìn)行光照培養(yǎng)30～40天；

E愈傷組織的分化：將進(jìn)行增殖培養(yǎng)后的愈傷組織切成2cm左右的小塊，接種到以下培養(yǎng)基上：MS基本培養(yǎng)基，適當(dāng)植物生長(zhǎng)激素，培養(yǎng)溫度25±1℃，光照時(shí)間10～16h，進(jìn)行光照培養(yǎng)30～40天；

F生根培養(yǎng)：選取生長(zhǎng)健壯的試管苗，連同小鱗莖接種到如下培養(yǎng)基中：1/2MS或MS基本培養(yǎng)基，蔗糖60～90g/L，適當(dāng)濃度的植物生長(zhǎng)激素，適當(dāng)PH值，進(jìn)行光照培養(yǎng)50～60天。

H煉苗移栽：將組培瓶蓋打開(kāi)，并添加少量的蒸餾水，進(jìn)行有菌條件馴化；用鑷子將組培苗從瓶中取出，移栽到已經(jīng)滅菌的栽培基質(zhì)中，進(jìn)行遮陰馴化3周，期間不定期的噴施1/2MS營(yíng)養(yǎng)液。

所述的忽地笑速繁殖方法的延伸技術(shù)方案包括：步驟A中的消毒試劑和時(shí)間、步驟B中的pH值范圍以及步驟B、C、D、E、F中忽地笑繁殖所述的培養(yǎng)基中涉及的植物生長(zhǎng)激素，包括6-卞基腺嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)、毒秀定(Picolarm)、萘乙酸(NAA)其中一種或幾種。

所述的忽地笑繁殖方法的延伸技術(shù)方案包括：步驟A中的種子消毒用試劑0.1％的安利洗滌液在搖床上震蕩洗滌15～20min和含2％次氯酸鈉滅菌20～30min。

所述的忽地笑繁殖方法的延伸技術(shù)方案包括：步驟B中pH值范圍為5.8～7.0，植物生長(zhǎng)激素包括6-卞基腺嘌呤(6-BA)4.0～6.0mg/L，吲哚乙酸(IBA)0.1～0.5mg/L。

所述的忽地笑繁殖方法的延伸技術(shù)方案包括：其特征在于步驟C所涉及里面到的植物生長(zhǎng)激素包括毒莠定(Picolarm)1.0～3.0mg/L，6-卞基腺嘌呤(6-BA)0.1～0.5mg/L。

所述的忽地笑繁殖方法的延伸技術(shù)方案包括：步驟D中所涉及到的植物生長(zhǎng)激素包括6-卞基腺嘌呤(6-BA)4.0～6.0mg/L，萘乙酸(NAA)0.1～0.5mg/L。

所述的忽地笑繁殖方法的延伸技術(shù)方案包括：步驟E中所涉及到的植物生長(zhǎng)激素萘乙酸(NAA)400～500mg/L，浸泡時(shí)間為10-15min。

所述的忽地笑繁殖方法的延伸技術(shù)方案包括：步驟H中添加蒸餾水5～10ml，進(jìn)行有菌馴化2-3天。

采用體胚發(fā)生培養(yǎng)的方法繁殖忽地笑，不僅可以擺脫外界條件的影響，四季都能進(jìn)行生產(chǎn)，而且可以節(jié)約育苗占地，降低生產(chǎn)成本。本技術(shù)是利用細(xì)胞的全能性，采取植物體上的細(xì)胞團(tuán)伙一塊組織，通過(guò)人為條件的控制，使這些組織形成千百萬(wàn)植株，并且保存了母體的全部?jī)?yōu)良性狀，且遺傳性狀穩(wěn)定。組織培養(yǎng)快速繁殖是目前盡快滿足市場(chǎng)需求的有效途徑，同時(shí)也是種質(zhì)保存(超低溫保存)、誘變育種及遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。這種方法保留了忽地笑的植株活性，可在短期內(nèi)形成大量?jī)?yōu)良試管苗，進(jìn)行規(guī)?；⒐S化生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1是開(kāi)始萌發(fā)不定芽的忽地笑鱗莖圖，圖2是體細(xì)胞胚誘導(dǎo)出的愈傷組織，圖3是愈傷組織再分化，圖4是煉苗移栽前的忽地笑小鱗莖和植株。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合忽地笑體外繁殖的實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方式。

實(shí)例1愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)

1.取忽地笑的地下鱗莖，剝?nèi)ネ鈱喻[片，切除根部，切去鱗莖上半部分約1/2～2/3。將留有鱗莖盤(pán)的鱗莖均分為4～8塊，用0.1％的安利洗滌液在搖床上震蕩洗滌15～20min，流水沖洗60min后，再在超凈工作臺(tái)上用75％的酒精漂洗30s，無(wú)菌水清洗4遍后，用含1％次氯酸鈉溶液消毒20～30min(在次氯酸鈉溶液中加入幾滴吐溫80)，無(wú)菌水沖洗4-5次，最后用無(wú)菌濾紙吸干小鱗莖表面水分。

2.將消毒好的忽地笑鱗莖小塊直接接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中：MS基本培養(yǎng)基中添加，6-卞基腺嘌呤(6-BA)3.0mg/L，吲哚乙酸(IBA)0.2mg/L，蔗糖30g/L，適當(dāng)pH值；培養(yǎng)溫度28±1℃，光照強(qiáng)度1000～3000lx，光照時(shí)間10～16h，進(jìn)行光照培養(yǎng)。

3.培養(yǎng)30天后，待叢生芽生長(zhǎng)至2-3cm，將叢生芽切開(kāi)接種到本發(fā)明的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加植物生長(zhǎng)激素毒莠定(Picolarm)3.0mg/L，6-卞基腺嘌呤(6-BA)0.5mg/L，培養(yǎng)30天以上，誘導(dǎo)率達(dá)到90％。

4.待忽地笑愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)30天以上，將愈傷組織轉(zhuǎn)接到本發(fā)明的愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，進(jìn)行增殖培養(yǎng)。愈傷組織增殖培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加植物生長(zhǎng)激素毒莠定(Picolarm)1.5mg/L，6-卞基腺嘌呤(6-BA)1.5mg/L，培養(yǎng)30天以上，愈傷組織可增殖2～3倍。

實(shí)例2愈傷組織的分化和試管苗的生根、移栽

1.培養(yǎng)30-60天后，待愈傷組織生長(zhǎng)至2-3cm，將其切開(kāi)重新接種到本發(fā)明的愈傷組織分化培養(yǎng)基中，進(jìn)行分化培養(yǎng)。愈傷組織分化培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加植物生長(zhǎng)激素6-卞基腺嘌呤(6-BA)6.0mg/L，萘乙酸(NAA)0.2mg/L，蔗糖30g/L，進(jìn)行增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)30天以上，誘導(dǎo)率達(dá)到98％，大部分愈傷可誘導(dǎo)出叢生芽數(shù)達(dá)到5-6個(gè)

2.選取生長(zhǎng)健壯的試管苗，然后接種到1/2MS基本培養(yǎng)基上，吲哚丁酸(IBA)1.0mg/L，蔗糖60g/L，進(jìn)行生根誘導(dǎo)。培養(yǎng)40天后，生根率達(dá)86％，平均根數(shù)目達(dá)8.5根。

3.將忽地笑組培苗生根培養(yǎng)1.5-2個(gè)月后開(kāi)始進(jìn)行煉苗移栽，首先將組培瓶移入光照培養(yǎng)箱，進(jìn)行變溫變光馴化5-7天，再將組培瓶蓋打開(kāi)，并添加10ml蒸餾水，進(jìn)行有菌條件馴化2-3天。然后將組培苗移栽到已經(jīng)滅菌的栽培基質(zhì)(泥潭∶珍珠巖∶園土＝1∶1∶5)中，放置無(wú)加溫加光的溫室中，進(jìn)行遮陰馴化3周，期間不定期的噴施1/2MS營(yíng)養(yǎng)液，移栽后成活率達(dá)78％。以上實(shí)例的忽地笑組織培養(yǎng)狀況見(jiàn)附圖。