本發(fā)明涉及作物抗病育種技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及瓠瓜黃瓜綠斑駁花葉病毒的接種鑒定、定量檢測方法。
背景技術(shù)：
瓠瓜[Lagenaria siceraria (Molina) Standl.]又名瓠子、長瓜、蒲瓜、夜開花、葫蘆等，隸屬葫蘆科(Cucurbitaceae)葫蘆屬(Lagenaria)，為一年生攀緣性草本植物。瓠瓜是我國南方地區(qū)夏季重要的瓜類蔬菜作物，也是嫁接西瓜、黃瓜首選的砧木。黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV)是近年來新傳入我國的有害生物，由于該病毒傳播迅速、危害嚴(yán)重，因此對瓠瓜生產(chǎn)造成極大的威脅。CGMMV屬于蕪菁花葉病毒科(Tymoviridae)煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)的一種，主要侵染黃瓜、西瓜、甜瓜、瓠瓜、南瓜等葫蘆科作物，造成的產(chǎn)量損失高達(dá)15%以上。CGMMV侵染植株后，主要引起葉片斑駁褪綠、花葉，果實(shí)出現(xiàn)水漬、纖維化。該病最早于1935年在英國黃瓜上發(fā)現(xiàn)，隨后在德國、芬蘭等許多國家都有報(bào)道, 曾對日本和韓國的西瓜和甜瓜生產(chǎn)造成毀滅性打擊；CGMMV最早在2002年隨種苗進(jìn)口從日本傳入我國，目前在多個省份的瓠瓜葉片、砧木種子上均已檢測到CGMMV病毒。鑒于CGMMV對我國葫蘆科作物的嚴(yán)重危害，農(nóng)業(yè)部已經(jīng)將CGMMV確定為全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物，屬國家三類檢疫性病害(農(nóng)業(yè)部第788號公告)。
選育抗病品種是防治瓠瓜CGMMV最經(jīng)濟(jì)有效的方法。獲得抗CGMMV種質(zhì)資源是抗CGMMV育種的前提和基礎(chǔ)，而快速、可靠、定量的接種鑒定是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的關(guān)鍵。目前，瓠瓜CGMMV抗性鑒定主要使用帶病毒鮮葉汁液摩擦接種的方法，雖然操作簡單，但難以保證病毒的單一性。此外，瓠瓜CGMMV癥狀復(fù)雜，幾乎無法根據(jù)植株表現(xiàn)進(jìn)行傳統(tǒng)的分級描述，加上CGMMV侵染后有時會出現(xiàn)隱癥表現(xiàn)，使得對CGMMV發(fā)病癥狀的準(zhǔn)確評價(jià)成為鑒定瓠瓜種質(zhì)抗性的主要限制因素。但是，目前缺乏一種客觀、定量的方法準(zhǔn)確評價(jià)不同瓠瓜種質(zhì)資源對CGMMV的抗病能力。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種瓠瓜CGMMV接種鑒定和定量分析抗性的方法，該方法首先利用攜帶侵染性克隆載體的菌液以子葉壓觸法接種瓠瓜幼苗，進(jìn)而利用ELISA技術(shù)檢測接種后兩個時間段內(nèi)瓠瓜植株體內(nèi)的CGMMV吸光值，根據(jù)CGMMV的含量變化情況，綜合評價(jià)不同瓠瓜種質(zhì)的抗CGMMV能力，從而代替基于發(fā)病癥狀的表型鑒定。
為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：
一種定量評價(jià)瓠瓜抗CGMMV能力的方法，該方法使用攜帶侵染性克隆的菌液，采用子葉壓觸法接種鑒定，該方法包括以下的步驟：
1）使用攜帶CGMMV侵染性克隆載體的農(nóng)桿菌菌液，接種工作液為OD600=1的農(nóng)桿菌菌液稀釋100倍；
2）子葉壓觸法接種：將待鑒定材料播于營養(yǎng)缽內(nèi)，置于溫度和光照可控的玻璃溫室內(nèi)培養(yǎng)，光照時間為16h，白天溫度控制在25-30℃，晚上控制在20-25℃；待幼苗子葉平展至一葉一心期接種，用1ml注射器吸取菌液后按壓子葉背面至菌液緩慢均勻滲透入葉脈，防止穿透葉片，每個植株的2片子葉各產(chǎn)生1個接種點(diǎn)，接種后控制植株生長環(huán)境溫度，白天25-30℃，晚上20-25℃，設(shè)置攜帶空載體的浸潤緩沖液作為接種對照；
3）CGMMV病毒含量檢測：接種15天后進(jìn)行第一次取樣，選擇標(biāo)準(zhǔn)為頂芽下第一片平展的葉子，每份材料可取3-5個單株的葉片混合，使用液氮研磨后放入15ml的離心管中，分別在裝入樣品前后對離心管稱重；接種25天后進(jìn)行第二次取樣，取樣標(biāo)準(zhǔn)和處理方式與第一次一致；利用CGMMV?；碾p抗體夾心ELISA技術(shù)測定樣品中CGMMV病毒含量，每份樣品加入10ml提取液，設(shè)置陰性對照、陽性對照和無樣品提取液對照，按ELISA操作步驟進(jìn)行，利用酶標(biāo)儀讀取樣品在405nm波長光下的吸光值；
4）CGMMV抗性評價(jià)：利用樣品吸光值反映其CGMMV的含量，計(jì)算方法為：
（樣品實(shí)測吸光值-陰性對照吸光值）/樣品重，
樣品重=放入樣品后離心管重-空離心管重；
若某一材料1g樣品的吸光值超過陰性對照吸光值2倍以上時，即認(rèn)為該樣品為感病，若其吸光值小于或等于陰性對照2倍時，則認(rèn)為該樣品為抗病；
根據(jù)兩個時間段內(nèi)樣品吸光值的變化情況綜合評價(jià)某一材料的CGMMV抗性能力，評估方法為：第二次樣品吸光值-第一次樣品吸光值，若差值為正數(shù)，表明在兩次取樣間隔的時間段內(nèi)，CGMMV病情進(jìn)一步擴(kuò)展加重；若差值為負(fù)數(shù)，表明該材料的CGMMV病情擴(kuò)展較慢或得到一定程度的抑制；兩次吸光值及其差值均較小的材料，判定為相對抗病的材料。
作為優(yōu)選，所述的攜帶侵染性克隆載體由全長6243 bp 的CGMMV序列融合到帶35S啟動子和核酶Rz的載體pCB301-CH制備得到，攜帶侵染性載體的為EHA105農(nóng)桿菌菌株。
本發(fā)明的有益效果是：
(1)采用攜帶侵染性克隆的農(nóng)桿菌菌液，可以保證CGMMV病毒單一性，不同批次接種病毒的濃度和侵染活性的一致性。
(2)采用CGMMV?；碾p抗體夾心ELISA技術(shù)測定病毒含量，與傳統(tǒng)的基于發(fā)病癥狀分級描述相比，可以避免因表型復(fù)雜造成的分級不確定性，鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確、客觀。
(3)接種后選擇2個時間點(diǎn)動態(tài)監(jiān)測植株體內(nèi)病毒含量，可以反映病毒入侵植株后在體內(nèi)的擴(kuò)展情況，可以更真實(shí)、系統(tǒng)的評價(jià)某一材料的抗病能力。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
不同濃度的侵染性克隆菌液接種效果分析：
(1)植物材料：杭州長瓜，田間表現(xiàn)為感CGMMV。
(2)接種鑒定：將杭州長瓜種子播種于營養(yǎng)缽內(nèi)，置于玻璃溫室內(nèi)生長，光照時間為16h，白天控溫25-30℃，夜晚控溫20-25℃。接種工作液為OD600=1的菌液稀釋10、100、1000、10000倍，即OD600=0.1、0.01、0.001、0.0001四種濃度。幼苗生長至一葉一心期后采用子葉壓觸法接種，每個單株產(chǎn)生2個接種點(diǎn)，每個濃度接種4株，同時選擇4株接種浸潤緩沖液（攜帶空載體的農(nóng)桿菌））作為對照(ck)。接種后15天、25天后分別取樣，選擇標(biāo)準(zhǔn)為頂芽下第一片平展的葉子，液氮研磨、稱重，加入10ml提取液，利用CGMMV專化的ELISA技術(shù)檢測CGMMV，在405nm波長光下利用酶標(biāo)儀檢測樣品吸光值。采用發(fā)明內(nèi)容3的計(jì)算方法對各樣品測定吸光值進(jìn)行分析。
(3)鑒定結(jié)果分析：如表1所示，隨著接種濃度的加大，杭州長瓜體內(nèi)的病毒含量也逐步增加，OD600=0.1濃度接種的杭州長瓜在2個時間點(diǎn)上體內(nèi)病毒含量最多，10天內(nèi)病毒復(fù)制量也最大；OD600=0.0001濃度接種后病毒侵染癥狀最輕，OD600=0.01和OD600=0.001濃度的接種效果居中。接種濃度過高，可能造成所有材料均嚴(yán)重發(fā)病，難以區(qū)分不同材料的抗病能力；反之，濃度過低可能造成所有材料均表現(xiàn)抗病，無法篩選到真正的抗病材料，綜合考慮，OD600=0.01和OD600=0.001的接種濃度較為合適。
表1. 不同濃度接種后CGMMV含量
實(shí)施例2
瓠瓜抗CGMMV種質(zhì)資源鑒定
(1)植物材料：173份瓠瓜種質(zhì)資源。
(2)接種鑒定：所有材料統(tǒng)一播于營養(yǎng)缽內(nèi)，每份材料種6-10株，分別排成2列，置于玻璃溫室內(nèi)生長。使用OD600=0.01濃度的菌液，在各材料子葉平展后至一葉一心期接種，用1ml針筒按壓子葉背面至菌液均勻滲透入葉片，接種后白天控溫25-30℃，夜晚控溫20-25℃。接種15天后對所有材料進(jìn)行第一次取樣，選擇標(biāo)準(zhǔn)為頂芽下第一片平展的葉子，每份材料每列植株取樣后混在一起，各形成2份樣品，液氮研磨后稱重，每份加入15ml提取液，按ELISA操作步驟進(jìn)行試驗(yàn)，在405nm波長光下利用酶標(biāo)儀檢測各樣品吸光值。接種25天后進(jìn)行第二次取樣，所有檢測步驟與第一次實(shí)驗(yàn)一致。采用發(fā)明內(nèi)容3的計(jì)算方法對各樣品測定吸光值進(jìn)行分析。
(3)鑒定結(jié)果分析：鑒定的173份瓠瓜材料中，兩次鑒定的吸光值之間差值變異幅度很大，從OD405=-5.60到11.10，其中差值為正數(shù)的有147份材料，差值為負(fù)數(shù)的有26份材料。對單個材料而言，兩個時間段取樣檢測的吸光值之間差值只能反映在這一時間段內(nèi)CGMMV病情的發(fā)展情況，并不能完全反映該材料對CGMMV的抗病能力。為了準(zhǔn)確評估不同材料的抗病能力，本發(fā)明認(rèn)為兩次吸光值及其差值均較小的材料，有可能是較為抗病的材料，以此為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)有11個材料較為抗病(表2)。進(jìn)一步結(jié)合其整株表型，發(fā)現(xiàn)這些材料癥狀均較輕，葉片上無明顯綠脈、斑點(diǎn)及褪綠等典型癥狀，說明這些材料確實(shí)抗CGMMV，同時也說明本發(fā)明的方法可以替代表型鑒定的方法，直觀、定量的反映瓠瓜種質(zhì)的真實(shí)抗性。
表2 利用本發(fā)明的方法鑒定出的抗CGMMV的瓠瓜種質(zhì)
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