本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生態(tài)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于阿魏酸含量評定水稻化感作用誘導(dǎo)效率的方法。
背景技術(shù)：
植物化感作用（Allelopathy）是指一個活體植物（供體）通過向環(huán)境中釋放次生代謝物質(zhì)，從而影響周圍植物（受體）生長和發(fā)育的化學(xué)生態(tài)學(xué)現(xiàn)象。這些次生代謝物質(zhì)被稱為化感物質(zhì)（Allelochemical）。1985年美國遺傳育種學(xué)家Dilday等在研究水稻對除草劑甲草胺的抗性評價中，首次在田間試驗中發(fā)現(xiàn)了對水生雜草ducksalad具有明顯抑草作用的水稻品種，這些品種被稱為化感水稻品種。此研究結(jié)果引起了世界各國政府和研究機(jī)構(gòu)的高度重視，人們寄希望于利用水稻自身的化感抑草作用來控制農(nóng)田雜草，減少對化學(xué)除草劑的依賴。稗草是大田水稻最常見的伴生雜草，本實驗室前期研究已經(jīng)表明稗草種植液可以誘導(dǎo)提高水稻的化感作用。通過植物的誘導(dǎo)作用來提高水稻化感作用，從而減少除草劑的使用，保護(hù)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境，具有更加重要的科學(xué)意義和應(yīng)用潛力。
目前，尚無評價水稻化感作用誘導(dǎo)效率的方法，但我們可以借鑒水稻化感品種的篩選方法。篩選方法主要在實驗室、溫室和田間進(jìn)行。室內(nèi)篩選在水稻化感潛力篩選初期是一種實用和必須的方法，其中生測是最簡單、方便和有效的篩選方法，其通過測定水稻對受體植株根長或者株高的抑制率來評價其化感潛力。通常，生測的指示受體有萵苣（Lactuca sativa L.），蘿卜（Raphanus sativus）和水芹（Lepidium sativum L.）等。研究者可以在有限的空間和時間內(nèi)對不同的水稻品種完成篩選工作。其它一些室內(nèi)篩選方法，如HPLC、GC-MS通過對化感水稻的酚酸類或者萜類化感物質(zhì)的含量進(jìn)行測定來評價水稻的化感潛力，通常需要對多種物質(zhì)的含量進(jìn)行分析，測定所需的經(jīng)費比較昂貴。其他的溫室或者田間篩選方法都是以間種的稗草、散播的稗草或者指定區(qū)域自然生長的雜草等作為指示受體進(jìn)行篩選化感潛力水稻品種，但由于無法降低在大田環(huán)境下植株之間的競爭作用，而且耗時較長，因此其通常作為水稻化感潛力篩選晚期的驗證方法。
當(dāng)前評價水稻化感潛力的最普遍方法是室內(nèi)生測法，但是由于研究者所采用的不同生物測試方法在供體植物與受體植物的植株數(shù)量、共培時間、培養(yǎng)載體、培養(yǎng)條件等方面存在明顯的差異,導(dǎo)致同一個作物品種在不同的測試方法中的化感作用潛力表現(xiàn)不盡相同,給準(zhǔn)確評價一個特定品種的化感作用潛力帶來困難。如果用這種方法來評價水稻化感作用誘導(dǎo)效率的話，需要對誘導(dǎo)后的水稻葉片浸提液或者水稻種植液對受體生長的抑制情況進(jìn)行分析，所需的樣品用量很大，同時其實驗時間一般在3-7天，需要耗費大量的時間和精力，而且結(jié)果重復(fù)性較差。因此，需要尋找一種能夠快速、簡便、準(zhǔn)確的評價水稻化感作用誘導(dǎo)效率的方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種基于阿魏酸含量評定水稻化感作用誘導(dǎo)效率的方法，其通過建立化感水稻葉片浸提液對萵苣根長抑制率與葉片浸提液中阿魏酸的含量的關(guān)系式，實現(xiàn)了通過對葉片浸提液中阿魏酸含量的測定而達(dá)到快速評價水稻化感作用誘導(dǎo)效率的目的，可有效解決目前采用生測法評定水稻化感作用誘導(dǎo)效率費時費力且結(jié)果重復(fù)性較差的問題。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種基于阿魏酸含量評定水稻化感作用誘導(dǎo)效率的方法，其步驟如下：
1）稗草種植液的收集：挑選顆粒飽滿的稗草種子，用0.5wt%的次氯酸鈉溶液消毒處理10min后，用蒸餾水沖洗干凈，再將種子平鋪到沙盤中，加水并加蓋保鮮膜后于30 ℃進(jìn)行催芽，待稗草長至一葉期時，挑取120株長勢均一的稗草，將其轉(zhuǎn)移到裝有10 L霍格蘭全營養(yǎng)液的塑料盆中，于25℃-35℃室外自然種植，每周補(bǔ)足水分和營養(yǎng)；種植25d至稗草長到5葉后，收集盆中的營養(yǎng)液，用2層濾紙過濾，再經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至120 mL，即得稗草種植液，-20 ℃儲藏備用；
2）水稻幼苗：將化感水稻PI312777的種子用自來水浸泡，去除漂浮、不飽滿的種子，然后用蒸餾水沖洗3遍后，用0.5wt%的次氯酸鈉溶液消毒處理10min，并用蒸餾水沖洗5遍后，用蒸餾水浸泡24h，每12h換一次水，再用蒸餾水沖洗3遍后，將種子平鋪到燒杯壁上，蓋好保鮮膜，上面扎孔，30℃黑暗放置24h；待種子冒芽后，把種子沖洗3遍后放到紗網(wǎng)上，將紗網(wǎng)固定到小塑料盆上，加蒸餾水至將種子浸沒，30℃下培養(yǎng)至水稻長至一葉一芯；
3）稗草種植液誘導(dǎo)：將水稻幼苗轉(zhuǎn)移到5組裝有5L霍格蘭全營養(yǎng)液的塑料盆上分別進(jìn)行培養(yǎng)，每盆種50株水稻，間距4cm×5cm；待水稻長至3葉期時，倒去營養(yǎng)液，分別加入5L含稗草種植液濃度依次為0、0.5、1.0、1.5、2.0 vol%的霍格蘭全營養(yǎng)液，誘導(dǎo)培養(yǎng)2d后收集各組水稻葉片；
4）葉片浸提液的制備：將所得水稻葉片剪成1cm的小段，按1g葉片加10mL蒸餾水，20℃浸提24h，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，得葉片浸提液；
5）阿魏酸含量的檢測：取葉片浸提液20mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH到4.00，然后加入1.6g NaCl，溶解后得葉片提取液；將葉片提取液加入到預(yù)處理好的Cleanert PEP固相萃取小柱中，當(dāng)溶液流完后加入2mL蒸餾水沖洗，然后加入6mL甲醇洗脫，并收集洗脫液，所得洗脫液冷凍干燥后，采用HPLC法測定其中阿魏酸含量；
測定條件為：色譜柱為C18柱，規(guī)格為4.6 mm×250 mm，ID 5μm；流動相：甲醇與體積濃度為0.1 %的磷酸溶液的混合溶液；洗脫條件：0-10min，甲醇27%；10-20min，甲醇50%；20-25min，甲醇73%；檢測波長為280 nm；流速為1.3 mL/min；進(jìn)樣量10μL；柱溫為30℃；
6）葉片浸提液對萵苣根長抑制率的測定：另取4mL葉片浸提液和1mL蒸餾水混合后加入到墊有濾紙的組培瓶中，并將5顆剛冒白的萵苣種子播在濾紙上，蓋好蓋子，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后測定萵苣的根長，并計算根長抑制率；
7）回歸方程的制備：根據(jù)所測定阿魏酸含量與根長抑制率的關(guān)系建立回歸方程，其所得回歸方程為：Y=90.6979X-55.2929，其中Y為根長抑制率，X為阿魏酸含量；
8）水稻化感作用誘導(dǎo)效率的評定：按步驟4）、5）制備經(jīng)稗草種植液誘導(dǎo)后的待測水稻樣品的葉片浸提液，并測定其中阿魏酸含量，然后根據(jù)所得回歸方程判定該水稻化感作用誘導(dǎo)效率。
PEP固相萃取小柱的預(yù)處理方法為：依次用8mL蒸餾水、8mL甲醇、6mL蒸餾水浸潤，淋洗，活化后去除殘余甲醇。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于：本發(fā)明建立了一種基于阿魏酸含量評定水稻化感作用誘導(dǎo)效率的方法，其先利用一系列濃度稗草種植液誘導(dǎo)化感水稻化感作用后，通過分別測定所得水稻葉片浸提液對萵苣根長的抑制率與其中阿魏酸含量，獲得兩者關(guān)系的回歸方程式，再利用該回歸方程式判定水稻化感作用誘導(dǎo)效率，以實現(xiàn)通過對葉片浸提液中阿魏酸含量的測定而達(dá)到快速評價水稻化感作用誘導(dǎo)效率的目的，其可有效解決目前采用生測法評定水稻化感作用誘導(dǎo)效率費時費力的問題，具有良好推廣前景。
附圖說明
圖1為不同劑量稗草種植液誘導(dǎo)后所得水稻葉片浸提液對萵苣根長生長抑制情況的變化圖。
具體實施方式
為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
所用稗草（Echinochloa crusgalli (L.) Beauv）種子收集于福建農(nóng)林大學(xué)田間實驗田并保存一年。
所用化感水稻PI312777引自美國，在福建省武夷山擴(kuò)繁。
所用原兒茶酸、丁香酸、阿魏酸、肉桂酸、香草酸、對香豆酸、水楊酸、對羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品均自購于阿拉丁公司。
所用Cleanert PEP固相萃取小柱的規(guī)格為：平均粒徑40-60μm、，平均孔徑70 ?，比表面積600m2/g。
1 材料與方法
1.1 稗草種植液的收集
挑選顆粒飽滿的稗草種子，用0.5wt%的次氯酸鈉溶液消毒處理10min后，用蒸餾水沖洗干凈，再將種子平鋪到沙盤中（沙子預(yù)先于65℃消毒30min，冷卻后反復(fù)3次），加適量蒸餾水后蓋上保鮮膜，并用鑷子在保鮮膜上戳一些小孔，放入恒溫培養(yǎng)箱中于30℃進(jìn)行催芽，待稗草長至一葉期時，挑取長勢均一的稗草（高4cm左右），將其轉(zhuǎn)移到裝有10L霍格蘭全營養(yǎng)液的塑料盆中（塑料盆規(guī)格：長45cm×寬35cm×高15cm），每盆120株，將盆放于25℃-35℃室外自然種植，每周補(bǔ)足水分和營養(yǎng)（直接補(bǔ)水至10L，營養(yǎng)按7天完全消耗計算，補(bǔ)回原來營養(yǎng)物質(zhì)濃度）；種植25d至稗草長到5葉后，分別收集各盆中營養(yǎng)液，將其用2層濾紙過濾后，再經(jīng)0.45μm濾膜過濾，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至120mL（每1mL即等于一株稗草的分泌液），得稗草種植液，-20℃儲藏備用。
1.2 水稻種植與稗草誘導(dǎo)液誘導(dǎo)
將化感水稻PI312777種子先用自來水浸泡，去除漂浮、不飽滿的水稻種子，用蒸餾水沖洗3遍后用0.5wt%的次氯酸鈉溶液消毒處理10min，然后用蒸餾水沖洗5遍后，再用蒸餾水浸泡24h，每12h換一次水，然后用蒸餾水沖洗3遍后，將種子平鋪到燒杯壁上，蓋好保鮮膜，上面扎孔，30℃黑暗放置24h；待種子冒芽后，把種子沖洗3遍后放到紗網(wǎng)（2mm）上，將紗網(wǎng)固定到小塑料盆（長28cm×寬19cm×高8cm）上，加蒸餾水至將種子浸沒，30℃下培養(yǎng)至水稻長至一葉一芯后，轉(zhuǎn)移到裝5L霍格蘭全營養(yǎng)液的另一塑料盆（長45cm×寬35cm×高15cm）上，每盆種50株水稻，間距4cm×5cm，待水稻長至3葉期時，倒去種植液，分別加入按表1配方配制的5組誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)實驗，每個處理重復(fù)3次；誘導(dǎo)處理2d后，分別收集各組水稻葉片和水稻種植液，將水稻葉片剪成1cm的小段，按1g葉片加10mL蒸餾水，20℃浸提24h，浸提液經(jīng)0.45μm濾膜過濾，得水稻葉片提取液；水稻種植液過濾后于40℃減壓蒸餾濃縮，過0.45μm濾膜過濾后定容至250mL，得水稻種植液。
表1 稗草種植液誘導(dǎo)化感水稻PI312777實驗配方表
1.3 水稻葉片浸提液的生物測試
取4mL水稻葉片浸提液和1mL蒸餾水混合后加到墊有濾紙的組培瓶中，然后將5顆剛冒白的萵苣種子播在濾紙上，蓋好蓋子，對照組采用5mL蒸餾水。實驗重復(fù)4次，組培瓶放在25℃培養(yǎng)箱（12h光照，12小時黑暗）中培養(yǎng)3天，然后測量萵苣的根長。
1.4 水稻葉片提取液中酚酸類物質(zhì)含量的測定
取Cleanert PEP固相萃取小柱，分別經(jīng)蒸餾水-甲醇-蒸餾水（8 mL-8 mL-6 mL）浸潤和淋洗活化后，去除殘余甲醇備用；
取水稻葉片提取液20mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH到4.00，后加入1.6g NaCl，溶解后將所得溶液加到已經(jīng)活化的固相萃取小柱中，當(dāng)溶液都流完后，加入2mL的蒸餾水沖洗，再加入6mL的甲醇洗脫，并收集洗脫液冷凍干燥，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>
采用HPLC法測定其中原兒茶酸、丁香酸、阿魏酸、肉桂酸、香草酸、對香豆酸、水楊酸、對羥基苯甲酸的含量，測定條件為：HPLC為Waters e2695，色譜柱為SunFireTW-C18（4.6 mm×250 mm，ID 5μm）；流動相：A-甲醇（色譜純）和B-0.1 %磷酸溶液（分析純）；洗脫條件：0-10min，A:B=27:73，10-20min A:B=50:50，20-25min A:B=73:37，檢測波長為280 nm；流速為1.3 mL/min；進(jìn)樣量10μL；柱溫為30℃。
1.5 數(shù)據(jù)分析
采用SigmaPlot 11.0軟件繪制，抑制率計算按公式：IR=（1-TR/CK）×100 %計算，其中，IR：抑制率，TR：處理組生長指標(biāo)，CK：對照組生長指標(biāo)。數(shù)據(jù)采用DPS2000軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析、相關(guān)性分析和回歸分析，采用LSD法進(jìn)行顯著性差異分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 水稻葉片浸提液的生測效果
圖1為不同劑量稗草種植液誘導(dǎo)后所得水稻葉片浸提液對萵苣根長生長抑制情況的變化圖（其中，abc表示5%顯著水平）。由圖1可見，化感水稻葉片浸提液對萵苣根長的抑制率在誘導(dǎo)劑量為25-50mL時與無誘導(dǎo)時無顯著差異，當(dāng)稗草誘導(dǎo)液劑量達(dá)到75mL時，抑制率顯著提高，達(dá)到75.11%，但與100mL劑量間無顯著差異，由此表明在稗草種植液的誘導(dǎo)下可以提高化感水稻PI312777對萵苣根長的抑制作用。
2.2 水稻葉片浸提液中酚酸類物質(zhì)含量測定
表2 不同劑量稗草種植液誘導(dǎo)后水稻葉片浸提液中阿魏酸含量的測定結(jié)果
由表2可見，不同劑量稗草種植液誘導(dǎo)化感水稻PI312777后，水稻葉片中的酚酸類物質(zhì)含量隨著誘導(dǎo)劑量的增大而增加。當(dāng)誘導(dǎo)劑量提高到75mL時，水稻葉片合成酚酸類物質(zhì)的總量顯著提高。但在單一酚酸的量的變化上看，不是所有酚酸的含量都是隨著誘導(dǎo)劑量的增加而增大，而是呈現(xiàn)出不規(guī)律的變化。僅阿魏酸的含量隨誘導(dǎo)劑量顯著增長，在誘導(dǎo)劑量為25mL時，水稻葉片中阿魏酸含量是未誘導(dǎo)時的2.21倍，隨著誘導(dǎo)劑量的增加，阿魏酸的含量也隨之增加，而當(dāng)在誘導(dǎo)劑量為75mL時，水稻葉片中的阿魏酸含量是未加入誘導(dǎo)劑時的5.14倍。
2.3 水稻葉片浸提液對萵苣根長抑制率和阿魏酸含量的相關(guān)性
表3 水稻葉片浸提液對萵苣根長抑制率和阿魏酸含量回歸方程方差分析
由表3可見，水稻葉片浸提液對萵苣根長的抑制率和葉片中阿魏酸含量相關(guān)系數(shù)達(dá)r=0.976，根據(jù)相關(guān)性的關(guān)系0.8≤r＜1稱為高度相關(guān)，說明兩者為高度相關(guān)，而且p=0.0043<0.01，差異達(dá)到極顯著水平?；貧w方程的斜率為90.70>0，證明稗草種植液誘導(dǎo)后化感水稻PI312777化感作用誘導(dǎo)效率的增強(qiáng)與葉片中阿魏酸的含量高度相關(guān)。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。