本發(fā)明涉及動(dòng)物醫(yī)學(xué)模型領(lǐng)域，具體是一種胃腸動(dòng)力障礙動(dòng)物模型的制備方法。

背景技術(shù)：

胃腸動(dòng)力障礙性疾是一類多發(fā)的神經(jīng)-肌肉等異常性疾病，其可發(fā)生于消化道的任何部位，以胃腸功能障礙、蠕動(dòng)變緩、胃排空及小腸推進(jìn)時(shí)間延長(zhǎng)等為主要病機(jī)。通常將其分為運(yùn)動(dòng)性障礙和功能性障礙兩大類，常見(jiàn)的DGIMD主要包括賁門(mén)失弛癥、胃食管返流病、功能性消化不良、腸易激綜合征、慢傳輸性便秘、胃輕癱、假性腸梗阻等。

目前臨床上用于促胃腸動(dòng)力的藥物主要以多巴胺受體拮抗劑、5-HT受體激動(dòng)劑及胃動(dòng)素受體激動(dòng)劑等化學(xué)藥物為主。甲氧氯普胺(又名胃復(fù)安)作為一種經(jīng)典的多巴胺受體拮抗類藥物，其應(yīng)用于緩解糖尿病引起的胃輕癱及手術(shù)或化療引起的惡心、嘔吐等癥狀已有數(shù)十年的歷史，但該藥物卻因明顯的錐體外系反應(yīng)限制了其廣泛使用，而其他同類藥物也因錐體外系反應(yīng)或高泌乳素血癥等不良事件而受到質(zhì)疑。西沙必利是第一代5-HT受體激動(dòng)劑，其用于治療功能性消化不良、胃輕癱、假性腸梗阻等癥狀具有肯定的療效，然而因其苯甲酰胺結(jié)構(gòu)能夠阻滯人類果蠅相關(guān)基因鉀離子通道，可導(dǎo)致心律失常甚至猝死，故而逐漸退出藥品市場(chǎng)。后續(xù)出現(xiàn)的同類藥物如替加色羅、普蘆卡必利等也因?yàn)樯鲜霾涣挤磻?yīng)或致癌性而被限制使用。以紅霉素為代表的MTL受體激動(dòng)劑在治療胃腸動(dòng)力障礙方面也具有一定的療效，但其可降低進(jìn)食后的胃體舒張的敏感性，同時(shí)還可能影響心肌細(xì)胞鈉離子通道而誘發(fā)心律失常。其他可能用于胃腸動(dòng)力障礙治療的藥物主要有膽囊收縮素受體拮抗劑、阿片肽受體拮抗劑等，但目前仍處于臨床及臨床前期研發(fā)階段，具體療效及安全性有待繼續(xù)探討。

當(dāng)前用于DGIMD動(dòng)物模型制備的方法主要有糖尿病模型、肝硬化模型、炎癥性腸病模型、避水應(yīng)激或加尾應(yīng)激刺激模型、嗎啡等誘導(dǎo)的慢傳輸性便秘模型、開(kāi)腹刺激腸管模型等。以上幾種動(dòng)物模型都具有明確的針對(duì)性，如針對(duì)糖尿病或肝硬化等，因此不具有廣泛的代表性，同時(shí)，他們導(dǎo)致胃腸動(dòng)力障礙發(fā)生的共同機(jī)制主要都是影響了ICC細(xì)胞的功能或減少了腸道激素的分泌，并不能完全符合臨床上DGIMD發(fā)病機(jī)制的多樣性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種簡(jiǎn)易廉價(jià)且具有廣泛代表性的胃腸動(dòng)力障礙動(dòng)物模型的制備方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：一種胃腸動(dòng)力障礙動(dòng)物模型的制備方法，采用SPF級(jí)7周齡Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重200g-240g，先飼養(yǎng)1周適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，或待其質(zhì)量達(dá)標(biāo)后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，包括以下步驟：

(1)飼養(yǎng)期間自由進(jìn)食進(jìn)水，采用周期為12小時(shí)的光照/黑暗交替，溫、濕度適宜，將78只符合標(biāo)準(zhǔn)的SD大鼠從1號(hào)到78號(hào)進(jìn)行標(biāo)記，雌雄各半，每只大鼠對(duì)應(yīng)固定的序號(hào)。然后采用隨機(jī)數(shù)字表法將其均分為A(n＝18)、B(n＝18)、C(n＝18)、D(n＝18)和E(n＝6)5個(gè)大組，其中前4個(gè)組根據(jù)不同的觀察時(shí)間又分為3個(gè)小組，每個(gè)小組6只大鼠。

(2)A組：L-Arg干預(yù)短期組，第1天腹腔注射L-Arg 5.2g/kg(20％L-Arg,2.6ml/100g)，第2-5天腹腔注射量減半，即L-Arg 2.6g/kg(20％L-Arg,1.3ml/100g)。

(3)B組：L-Arg干預(yù)長(zhǎng)期組，第1天腹腔注射L-Arg 5.2g/kg(20％L-Arg,2.6ml/100g)，第2-10天腹腔注射量減半，即L-Arg 2.6g/kg(20％L-Arg,1.3ml/100g)。

(4)C組：生理鹽水干預(yù)短期組，在各時(shí)間段給予與A組L-Arg相同體積的生理鹽水，干預(yù)周期為5天。

(5)D組：生理鹽水干預(yù)長(zhǎng)期組，在各時(shí)間段給予與B組L-Arg相同體積的生理鹽水，干預(yù)周期為10天。

(6)E組：正常對(duì)照組，不予任何干預(yù)，所有實(shí)驗(yàn)大鼠均采用自由進(jìn)食水。

(7)標(biāo)本采樣：前4個(gè)組分別在干預(yù)結(jié)束后的第1天、第7天及第14天進(jìn)食24h后采集標(biāo)本，E組則在干預(yù)結(jié)束后第14天采集標(biāo)本。

(8)進(jìn)行大鼠體重的變化、小腸推進(jìn)率、胃腸激素、RAS系統(tǒng)成分、一氧化氮(NO)及環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)的檢測(cè)。

優(yōu)選地，所述20％L-Arg溶液采用適量左旋精氨酸(L-Arg)粉末溶于生理鹽水，配成20％(w/v)左旋精氨酸鹽溶液(20g L-Arg溶于100ml生理鹽水中)，攪拌混勻后加入適量0.1mol/L HCI或0.1mol/L NaOH直至溶液變澄清，調(diào)節(jié)PH 7.35-7.45左右，常溫保存。

優(yōu)選地，所述2％BD-2000溶液采用2g葡聚糖藍(lán)-2000溶于100ml的去離子水中，攪拌均勻，常溫保存。

優(yōu)選地，所述0.5％戊巴比妥鈉溶液采用0.1g戊巴比妥鈉粉末溶于20ml生理鹽水中，避光常溫保存。

優(yōu)選地，所述4％多聚甲醛溶液采用40g多聚甲醛粉末溶于900ml蒸餾水中，逐漸調(diào)整PH至7.35-7.45，最后調(diào)整液體總量為1000ml，常溫保存。

優(yōu)選地，所述標(biāo)本采集主要包括血樣采集、胃組織采集和腸組織采集。

優(yōu)選地，所述大鼠體重的變化采用電子稱每天稱量并記錄大鼠體重的變化，所述小腸推進(jìn)率根據(jù)量取幽門(mén)至BD-2000最前端的距離及小腸全長(zhǎng)進(jìn)行計(jì)算。

優(yōu)選地，所述胃腸激素檢測(cè)主要包括胃動(dòng)素(MTL)、胃泌素(GAS)、血管活性腸肽(VIP)及生長(zhǎng)抑素(SST)等。采用ELISA試劑盒法檢測(cè)大鼠血漿中各類胃腸激素的表達(dá)水平。

優(yōu)選地，所述RAS系統(tǒng)成分檢測(cè)主要包括血漿腎素、血管緊張素II(AngII)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)及組織中血管緊張素II受體(AT2R)，胃腸組織中AT2R的檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)法。

優(yōu)選地，所述一氧化氮(NO)檢測(cè)在組織中NO的含量采用格里斯試劑系統(tǒng)(Griess Reagent System)進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果是：

1.制備方法簡(jiǎn)單：本方案通過(guò)對(duì)比,最后確立了通過(guò)時(shí)長(zhǎng)5天腹腔注射L-Arg鹽溶液即可制備理想的胃腸動(dòng)力障礙動(dòng)物模型，和現(xiàn)有的糖尿病模型、肝硬化模型、夾尾刺激模型及外科手術(shù)模型相比，其制作方法簡(jiǎn)單，成模時(shí)間短,無(wú)需特殊的設(shè)備和技術(shù)；

2.質(zhì)控指標(biāo)明確：干預(yù)結(jié)束后小腸推進(jìn)率、胃動(dòng)素及血管活性腸肽等指標(biāo)具有明顯的變化規(guī)律，可作為重要的模型質(zhì)控指標(biāo)，具有很好的可重復(fù)性；

3.維持時(shí)間較長(zhǎng)：該模型制備成功后，其胃腸動(dòng)力障礙狀態(tài)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，能滿足實(shí)驗(yàn)的基本需求；

4.制備成本低廉：該模型干預(yù)試劑為L(zhǎng)-Arg和Nacl溶液，二者價(jià)格低廉，均為常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)試劑；

5.貼切疾病特征：糖尿病模型、肝硬化模型、夾尾刺激模型及外科手術(shù)模型等胃腸動(dòng)力障礙模型僅僅代表具有某一特性的疾病模型，不具有廣泛的代表性，更不符合胃腸動(dòng)力障礙性疾病發(fā)病機(jī)理的復(fù)雜性。而L-Arg鹽溶液模型成模機(jī)制較為復(fù)雜，更符合該類疾病發(fā)病的基本特征；

6.成模機(jī)制獨(dú)特：除NO的參與外，RAS系統(tǒng)在該模型形成過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，而RAS系統(tǒng)與胃腸動(dòng)力的相關(guān)性將成為今后該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，該模型也將為其進(jìn)行深入的研究提供了基本保障。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)部分技術(shù)路線圖；

圖2為本發(fā)明造模干預(yù)期間各組大鼠體重的變化趨勢(shì)；

圖3為本發(fā)明造模干預(yù)結(jié)束后各組大鼠體重的變化趨勢(shì)；

圖4為本發(fā)明各組大鼠小腸推進(jìn)率變化趨勢(shì)對(duì)比圖(其中，A組為理想模型制備方案)；

圖5為本發(fā)明各組大鼠血漿中胃動(dòng)素表達(dá)水平變化趨勢(shì)對(duì)比圖(其中，A組為理想模型制備方案)；

圖6為本發(fā)明各組大鼠血漿中血管活性腸肽表達(dá)水平變化趨勢(shì)對(duì)比圖(其中，A組為理想模型制備方案)。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用SPF級(jí)7周齡Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重200g-240g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SCXK(甘)2009-0004)。購(gòu)買(mǎi)大鼠后，先飼養(yǎng)1周適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，或待其質(zhì)量達(dá)標(biāo)后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)期間自由進(jìn)食進(jìn)水，采用周期為12小時(shí)的光照/黑暗交替，溫、濕度適宜。本實(shí)驗(yàn)獲得了蘭州大學(xué)第二醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)(編號(hào)：B2015-004)。

2.使用藥物

左旋精氨酸：Sigma公司生產(chǎn)。

戊巴比妥鈉：上海索萊寶生物科技有限公司。

生理鹽水：北京華興科諾生物技術(shù)有限公司。

3.化學(xué)試劑

4.藥物及試劑配制

20％L-Arg溶液：取適量左旋精氨酸(L-Arg)粉末溶于生理鹽水，配成20％(w/v)鹽酸左旋精氨酸溶液(20g L-Arg溶于100ml生理鹽水中)，攪拌混勻后加入適量0.1mol/L HCI或0.1mol/L NaOH直至溶液變澄清，調(diào)節(jié)PH 7.35-7.45左右，常溫保存。

2％BD-2000溶液：去2g葡聚糖藍(lán)-2000溶于100ml的去離子水中，攪拌均勻，常溫保存。

0.5％戊巴比妥鈉溶液：取0.1g戊巴比妥鈉粉末溶于20ml生理鹽水中，避光常溫保存。

4％多聚甲醛溶液：取40g多聚甲醛粉末溶于900ml蒸餾水中，逐漸調(diào)整PH至7.35-7.45，最后調(diào)整液體總量為1000ml，常溫保存。

5.主要器材

實(shí)施例1

一種胃腸動(dòng)力障礙動(dòng)物模型的制備方法，包括以下步驟：

1.動(dòng)物分組

(1)將78只符合標(biāo)準(zhǔn)的SD大鼠從1號(hào)到78號(hào)進(jìn)行標(biāo)記，雌雄各半，每只大鼠對(duì)應(yīng)固定的序號(hào)。然后采用隨機(jī)數(shù)字表法將其均分為A(n＝18)、B(n＝18)、C(n＝18)、D(n＝18)和E(n＝6)5個(gè)大組，其中前4個(gè)組根據(jù)不同的觀察時(shí)間又分為3個(gè)小組，每個(gè)小組6只大鼠。

2.干預(yù)措施

(2)A組：L-Arg干預(yù)短期組，第1天腹腔注射L-Arg 5.2g/kg(20％L-Arg,2.6ml/100g)，第2-5天腹腔注射量減半，即L-Arg 2.6g/kg(20％L-Arg,1.3ml/100g)；

(3)B組：L-Arg干預(yù)長(zhǎng)期組，第1天腹腔注射L-Arg 5.2g/kg(20％L-Arg,2.6ml/100g)，第2-10天腹腔注射量減半，即L-Arg 2.6g/kg(20％L-Arg,1.3ml/100g)；

(4)C組：生理鹽水干預(yù)短期組，在各時(shí)間段給予與A組L-Arg相同體積的生理鹽水，干預(yù)周期為5天；

(5)D組：生理鹽水干預(yù)長(zhǎng)期組，在各時(shí)間段給予與B組L-Arg相同體積的生理鹽水，干預(yù)周期為10天；

(6)E組：正常對(duì)照組，不予任何干預(yù)。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均采用自由進(jìn)食水。

3.標(biāo)本采集

前4個(gè)組分別在干預(yù)結(jié)束后的第1天、第7天及第14天進(jìn)食24h后采集標(biāo)本，E組則在干預(yù)結(jié)束后第14天采集標(biāo)本，具體如下：

干預(yù)結(jié)束后，禁食24h，給予2％的葡聚糖藍(lán)-2000 0.8ml/只灌胃，灌胃30min后，戊巴比妥鈉(50mg/kg，1％v/v)經(jīng)腹腔注射麻醉。

開(kāi)腹，經(jīng)下腔靜脈采血2ml，置于事先加入EDTA-K2(10％,30ul＝3mg，即1.5mg/ml血液)的抗凝采血管中，3500r/min，4℃離心15min，收集血漿并分裝(100ul/管)，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

采血后，頸椎脫臼處死大鼠，立即完整解剖出全胃和腸管，測(cè)量并計(jì)算小腸推進(jìn)率。

胃組織：解剖出胃體并將內(nèi)容物溶于蒸餾水后，立即將胃體分為2部分，其中一部分立即置于0.1％DEPC水處理過(guò)的5ml離心管中，-80℃保存；另一部分浸入4％多聚甲醛(pH：7.35-7.45)固定液中固定24-48h,然后進(jìn)行組織的修剪取材，石蠟包埋，常溫下長(zhǎng)期保持(HE染色/免疫組化染色等備用)。

腸組織：解剖出組織后，盡快分別離斷十二指腸近端及距離回腸末端10cm處的腸組織各6cm，用蒸餾水清洗干凈后分為2部分，一部分立即置于0.1％DEPC水處理過(guò)的5ml離心管中，-80℃保存；另一部分浸入4％多聚甲醛固定液中固定24-48h，最后取材并包埋，保存?zhèn)溆谩?/p>

4.結(jié)局指標(biāo)

1)大鼠體重的變化。每天用電子稱稱量并記錄大鼠體重的變化。

2)小腸推進(jìn)率：解剖出整個(gè)腸道后，量取幽門(mén)至BD-2000最前端的距離及小腸全長(zhǎng)，按以下公式計(jì)算小腸推進(jìn)率。

3)胃腸激素：主要包括胃動(dòng)素(MTL)、胃泌素(GAS)、血管活性腸肽(VIP)及生長(zhǎng)抑素(SST)等。采用ELISA試劑盒法檢測(cè)大鼠血漿中各類胃腸激素的表達(dá)水平。具體步驟如下：

①先從冰箱取出96孔板，室溫平衡20min，然后從鋁箔袋中取出96孔板需要部分，若有剩余可密封后放回4℃保存；

②按需設(shè)置好標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔分別加入各種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

③樣本孔中先加待測(cè)樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加；

④除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃恒溫箱孵育60min；

⑤孵育結(jié)束后，甩去孔中的所有液體，吸水紙上垂直拍干，用排槍每孔加滿洗滌液，靜置1min后，甩去洗滌液，吸水紙上再次拍干，如此重復(fù)洗板5次；

⑥各孔加入終止液50μL，輕輕搖勻，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值；

⑦采用CurveExpert軟件，以標(biāo)準(zhǔn)孔數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及曲線方程，以此計(jì)算各待測(cè)樣本中胃動(dòng)素的水平。

⑧統(tǒng)計(jì)分析

4)RAS系統(tǒng)成分：主要包括血漿腎素、血管緊張素II(AngII)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)及組織中血管緊張素II受體(AT2R)等。前幾種成分的檢查方法及流程與胃腸激素檢查方法相同，胃腸組織中AT2R的檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)法。

5)一氧化氮(NO)：組織中NO的含量采用格里斯試劑系統(tǒng)(Griess Reagent System)進(jìn)行檢測(cè)。具體步驟如下：

①將事先凍存的胃腸組織置于常溫下解凍，然后稱取0.2g組織，在1.8ml的生理鹽水中進(jìn)行充分研磨，然后在4℃，3000r/min離心15min，吸取離心管上層清亮的液體，分裝(100ul/管)后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

②實(shí)驗(yàn)前將試劑盒取出，在常溫下平衡15-30min，取1ml的蒸餾水和1ul的NS溶液，充分混合；

③96孔板中留出前3列作為標(biāo)準(zhǔn)孔。在B-H的前三列孔中各加入50ul蒸餾水，在A的前三個(gè)孔中加入前面配好的標(biāo)準(zhǔn)液100ul；

④從A到H進(jìn)行6系列2倍稀釋，最終每孔中液體的體積為50ul；

⑤剩余孔中各加入50ul的待測(cè)樣本，每個(gè)樣本設(shè)置2-3個(gè)復(fù)孔；

⑥用排槍向每孔中加入50ul的SS液，常溫避光孵育8min；

⑦每孔中加入50ul的NED液，常溫避光再孵育8min；

⑧30min內(nèi)，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔吸光度；

⑨繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品NO濃度；

⑩統(tǒng)計(jì)分析。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。