本發(fā)明屬于植物栽培領(lǐng)域，具體涉及提高紅麻幼苗期耐鎘性能的方法。
背景技術(shù)：
紅麻具有生長(zhǎng)周期短、生物量大(為樹木的三到四倍)、抗重金屬能力強(qiáng)、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，又因?yàn)槭抢w維作物，不易將重金屬帶入食物鏈。因此，紅麻有望用于治理大面積受重金屬污染的土壤，不僅能夠治理土壤污染，還可以獲得較高的經(jīng)濟(jì)效益。祁建民等研究了紅麻對(duì)重金屬的吸收特征，篩選出了高耐、高富集鎘的紅麻品種，研究了紅麻對(duì)重金屬鎘的吸收累積特征及其品種間的差異；比較了高耐品種和低耐品種的抗氧化系統(tǒng)對(duì)鎘脅迫響應(yīng)的差異以及鎘脅迫對(duì)紅麻根尖細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響(紅麻對(duì)重金屬的吸收特征及外源GSH緩解鎘毒的機(jī)理研究，福建農(nóng)林大學(xué)博士學(xué)位論文，2013)。
鄧勇等研究發(fā)現(xiàn)紅麻幼根丙二醛、As A含量與脅迫時(shí)間和鎘濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。As A和GSH含量及抗氧化酶活性的變化可能是紅麻抵御鎘毒害與抗性的重要生理基礎(chǔ)(鎘脅迫下紅麻幼根的生理響應(yīng)，中國麻業(yè)科學(xué)，2016)。李蘭平通過研究鉛、鎘對(duì)紅麻種子萌發(fā)生長(zhǎng)的影響，將Cd≦20mg/kg的濃度作為區(qū)分紅麻品種耐鎘強(qiáng)弱的理想濃度。
雖然紅麻耐鎘的特性得到了廣泛的認(rèn)可，然而將其作為修復(fù)植物廣泛進(jìn)行種植還未得到推廣，發(fā)明人通過深入研究發(fā)現(xiàn)，紅麻根部吸附土壤重金屬鎘的潛力還有提升空間，植物修復(fù)的關(guān)鍵部位是根系，Cd以共質(zhì)體進(jìn)入根尖并沉積在表皮細(xì)胞，再通過根系轉(zhuǎn)運(yùn)至其他部位。紅麻優(yōu)于其他經(jīng)濟(jì)作物的主要原因是發(fā)達(dá)的根系，為了增強(qiáng)紅麻對(duì)重金屬Cd的吸收能力，發(fā)明人做了各種嘗試，例如延長(zhǎng)紅麻主根長(zhǎng)度，增加須根數(shù)量等，但是收效甚微，如何激發(fā)紅麻吸收土壤重金屬Cd，是紅麻發(fā)展成為重金屬土壤修復(fù)作物的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期的研究和栽培實(shí)踐，對(duì)紅麻種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)期間的鎘脅迫進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)紅麻在整個(gè)生長(zhǎng)期中，對(duì)鎘脅迫最敏感的時(shí)期為幼苗期，尤其是播種或移栽后30-60天，一旦紅麻幼苗順利度過這一敏感期，相同濃度的鎘脅迫對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響將不會(huì)導(dǎo)致其死亡，本發(fā)明的目的就是進(jìn)一步提高種子萌發(fā)期間和幼苗生長(zhǎng)發(fā)育期間的鎘耐受性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提高紅麻幼苗期耐受土壤隔脅迫的性能，為達(dá)到此目的，本發(fā)明提供了一種提高紅麻幼苗期耐受重金屬鎘的方法。
本發(fā)明所述方法涉及一種組合物，因此本發(fā)明還將公開該組合物的制備方法。
所述組合物由五類化合物組成，五類化合物分別是S-亞硝基化谷胱甘肽(GSNO)、纖維素衍生物、兒茶素類、表面活性劑和螯合劑。
GSNO由亞硝酸鹽(NO2-)和還原型谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)制得，GSNO稀釋液在組合物中含量為1.0-1.5％。
組合物中纖維素衍生物為：甲基纖維素(Mc)、羥甲基纖維素(HMc)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥乙基甲基纖維素(HEMC)、甲基乙基纖維素(MEC)和甲基丙基纖維素(MPC)中的至少一種纖維素衍生物。
纖維素衍生物在所述組合物中質(zhì)量百分含量為65.5-86.5％。
組合物中的兒茶素類是指兒茶素、沒食子兒茶素、兒茶素沒食子酸酯等非表型兒茶素類，以及表兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯等表型兒茶素類中的至少一種。
兒茶素類在所述組合物中質(zhì)量百分含量為3.5-8.5％
組合物中的表面活性劑,是指烷基苯磺酸鈉、烷基磺酸鈉、烷基萘磺酸鈉、2-萘磺酸鈉、萘橫酸的縮合物鹽中的一種或多種。
表面活性劑在所述組合物中質(zhì)量百分含量為5.5-10.5％。
組合物中的螯合劑是指氨基三乙酸(NTA)或檸檬酸(CA)等可降解有機(jī)酸。
螯合劑在所述組合物中質(zhì)量百分含量為1.5-2.5％。
組合物中除GSNO外，其余化合物均有市售。
組合物的制備方法如下：
(1)一定質(zhì)量百分比的纖維素衍生物、兒茶素類、表面活性劑和螯合劑溶于乙醇；
(2)向步驟(1)中溶液中加入一定質(zhì)量百分比的GSNO稀釋液；
本發(fā)明提供的組合物的使用方法如下：
(1)水培幼苗時(shí)在營養(yǎng)液中添加一定濃度的GSNO母液，使培養(yǎng)液中GSNO的濃度為125-300μmol/L，移栽至大田后，施加含有GSNO稀釋液的組合物。
(2)移栽后管理：紅麻幼苗按照常規(guī)方法移栽并管理，移栽后30天進(jìn)行葉面噴施,組合物濃度優(yōu)選150-1500ppm,進(jìn)一步濃度優(yōu)選350-500ppm，施用量為10-50Kg/畝土壤；移栽后60天再次進(jìn)行葉面噴施,組合物濃度優(yōu)選150-1500ppm,進(jìn)一步濃度優(yōu)選200-800ppm。施用量為20-60Kg/畝土壤。
本發(fā)明的有益效果是，通過使用本方法，在鎘脅迫下，紅麻根系和地上部分的抑制明顯得到緩解，葉片發(fā)育恢復(fù)正常，葉片黃化程度顯著減弱，光合作用逐漸恢復(fù)，側(cè)根開始恢復(fù)生長(zhǎng)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 GSNO母液制備
GSNO母液的制備:等體積的10mmol/LNaNO2(在100mmol/LHCl中)與等體積的10mmol/LGSH(在100mmol/LpH7.的Na2HPO4－NaH2PO4磷酸緩沖液中)反應(yīng)，即可形成5mmol/LGSNO(混合液包含5mmol/LGSNO)。
實(shí)施例2 GSNO稀釋液制備
GSNO母液貯存在冰上，使用時(shí)用純凈水稀釋十倍(即500μmol/L)待用。室溫下，在100mmol/LpH7.4的磷酸緩沖液中(內(nèi)含50μmol/LDTT)，GSNO就可以釋放出NO，其中500μmol/L的GSNO 30min約釋放NO 3.25μmol/L。
實(shí)施例3組合物的配制
將78.5克羥甲基纖維素(HMc)、7.5克沒食子兒茶素、10.5克2-萘磺酸鈉和2.5克氨基三乙酸溶于200mL乙醇，向其中加入1克的GSNO稀釋液(濃度為500μmol/L)，所得溶液為本發(fā)明提供的組合物。
實(shí)施例4組合物的配制
將86.5克羥丙基甲基纖維素(HPMC)、4.5克兒茶素沒食子酸酯、6克烷基萘磺酸鈉和1.5克氨基三乙酸溶于200mL乙醇后，向其中加入1.5克的GSNO稀釋液(濃度為500μmol/L)，所得溶液為本發(fā)明提供的組合物。
實(shí)施例5組合物的使用方法
發(fā)芽試驗(yàn):挑選飽滿且胚完整的種子，用3％H2O2消毒15min，蒸餾水反復(fù)沖洗后在蒸餾水中浸泡過夜，使其充分吸脹。然后將種子擱在底部鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放于25℃恒溫暗培養(yǎng)48小時(shí)使種子發(fā)芽。
幼苗培養(yǎng)：待芽長(zhǎng)到2～3cm(約3～4d)后，置于光照培養(yǎng)間培養(yǎng)(光照強(qiáng)度為800μmol·m-1·S-1，光周期14h/10h，晝夜溫度28℃/20℃，空氣相對(duì)濕度70％)。自來水中適應(yīng)培養(yǎng)3d后，將幼苗移栽至1/4Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)，并將上述合成的5mmol/L GSNO母液添加到Hoagland營養(yǎng)液中，使其中的GSNO濃度為125-300μmol/L。
Hoagland營養(yǎng)液配方為Ca(NO3)25.79mM,KNO38.02mM,NH4H2PO41.35mM,MgSO44.17mM,MnSO48.90μM，H3BO348.3μM,ZnSO40.94μM,CuSO40.20μM,(NH4)2MoO40.015μM,Fe-EDTA72.6μM,用NaOH調(diào)節(jié)pH6.5左右。
移栽后管理：紅麻幼苗按照常規(guī)方法移栽并管理，移栽后30天進(jìn)行葉面噴施,組合物濃度優(yōu)選150-1500ppm,進(jìn)一步濃度優(yōu)選350-500ppm，施用量為10-50Kg/畝土壤。
移栽后60天再次進(jìn)行葉面噴施,組合物濃度優(yōu)選150-1500ppm,進(jìn)一步濃度優(yōu)選200-800ppm。施用量為20-60Kg/畝土壤。
實(shí)施例6使用本組合物的紅麻幼苗的指標(biāo)測(cè)定
1.測(cè)定幼苗地上部分的指標(biāo)株高、莖粗、葉面積和全株生物質(zhì)量，用于指征紅麻的生長(zhǎng)性能。
不同組合物濃度(0-850ppm)處理下，對(duì)鎘脅迫(試驗(yàn)設(shè)定的鎘濃度為200mg/Kg土壤)下盆栽幼苗生理形態(tài)的影響，試驗(yàn)設(shè)定了對(duì)照組，對(duì)照組是無鎘脅迫下，紅麻幼苗的生長(zhǎng)狀況，所有測(cè)試植株的生長(zhǎng)期均為30天，每組紅麻的測(cè)試數(shù)量為20株；
使用本組合物，土壤鎘對(duì)紅麻幼苗生長(zhǎng)的脅迫得到了顯著緩解，優(yōu)化的組合物濃度為350-500ppm。
2.光合色素含量采用丙酮浸提法，用UV-2450型紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)，分別在波長(zhǎng)663、645和470nm處測(cè)定吸光度值，按公式分別計(jì)算葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的濃度，葉綠素a和葉綠素b的濃度相加即得葉綠素總濃度。
試驗(yàn)測(cè)定了為不同濃度組合物處理下，對(duì)土壤鎘脅迫下紅麻幼苗光合色素含量的影響。大于150PPM的組合物處理使Cd脅迫黃麻幼苗各光合色素含量的抑制作用被顯著緩解(P＜0.05),且隨著組合物處理濃度的升高，緩解作用逐漸增大。濃度為PPM350-500處理使葉綠素總量、葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量分別比為使用該組合物處理的增加了290.98-307.74％、210.86-254.55％、438.65-621.01％和95.65-109.31％,類胡蘿卜素的含量甚至達(dá)到了對(duì)照的水平，即抑制作用完全被解除。
3.抗氧化酶的活性測(cè)定采用Elavarthi和Mart in的分光光度法。
生長(zhǎng)期為30天的盆栽紅麻在200mg/Kg土壤的鎘脅迫下，無論在根系還是葉片組織上，都顯著地抑制了幾種抗氧化酶的活性。與無鎘脅迫的正常幼苗相比，鎘脅迫處理使紅麻根系的SOD、CAT、APX和POD活性分別下降了69.30％、81.97％、90.91％和71.93％，葉片的SOD、CAT、APX和POD活性分別下降了34.86％、78.68％、53.16％和57.90％。
紅麻幼苗抗氧化酶活性的響應(yīng)與組合物的濃度、酶蛋白自身特性和組織特異性都有關(guān)。
適宜濃度的組合物噴施處理使Cd脅迫下的紅麻幼苗根系和葉片中幾種抗氧化酶活性均顯著增加(P＜0.05)。紅麻葉片組織中SOD、APX活性均隨組合物濃度增加而增加，PPM445濃度處理達(dá)到峰值，根系組織的SOD、APX活性在PPM490濃度處理達(dá)到峰值，處理濃度再次增加后均維持在這一水平。紅麻葉片組織和根系組織中CAT、POD活性均隨組合物濃度增加而增加，PPM500濃度處理達(dá)到峰值，說明就組合物誘導(dǎo)的對(duì)Cd脅迫的抗氧化防御來講，不同的抗氧化酶在根系和葉片中的敏感性不同，對(duì)組合物濃度的敏感性也不同。綜合使用成本考慮，優(yōu)化后的濃度為445-500PPM。
實(shí)施例7組合物的使用方法對(duì)效果的影響
水培紅麻幼苗時(shí)在營養(yǎng)液中添加125～250μmol/L的S-亞硝基化谷胱甘肽(GSNO)，而在移栽至大田后，施加一定濃度的組合物，可以進(jìn)一步提高本組合物的使用效果，具體表現(xiàn)在紅麻根系和地上部分的抑制情況，與僅在幼苗期噴施本組合物相比，進(jìn)一步得到緩解，葉片發(fā)育迅速恢復(fù)正常，葉片黃化程度可得到恢復(fù)，光合作用逐漸正常，側(cè)根開始恢復(fù)生長(zhǎng)。