本發(fā)明涉及一種高效篩選抗旱苜蓿品種的方法。

背景技術(shù)：

篩選具有較強(qiáng)抗旱能力的苜蓿品種對(duì)進(jìn)一步挖掘和利用優(yōu)異抗旱苜蓿種質(zhì)資源具有重要意義。以往常用的抗旱苜蓿品種篩選方法多是通過(guò)測(cè)定田間指標(biāo)或者結(jié)合若干生理指標(biāo)，并采用一些公認(rèn)的評(píng)定方法如直接比較法、總抗旱性評(píng)價(jià)法、隸屬函數(shù)法、層次分析法(AHP)、主成分分析法和灰色關(guān)聯(lián)度模型等對(duì)苜蓿品種進(jìn)行不同抗旱級(jí)別的劃分，從中篩選出一些抗旱的苜蓿品種。目前，對(duì)苜?？购敌缘脑u(píng)價(jià)方法眾多、不統(tǒng)一，而這種不統(tǒng)一的評(píng)價(jià)方法導(dǎo)致了“一種苜蓿多重身份”的現(xiàn)象，這對(duì)進(jìn)一步篩選較強(qiáng)抗旱能力苜蓿品種及深入挖掘其優(yōu)良抗旱基因的研究很不利。因此，有必要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)更加準(zhǔn)確簡(jiǎn)單的篩選較強(qiáng)抗旱苜蓿品種的方法，以挖掘和利用抗旱品種自身優(yōu)良的抗逆基因。

PEG模擬干旱脅迫結(jié)合測(cè)定若干生理指標(biāo)的方法能夠有效地篩選出大量的抗旱苜蓿品種。李崇巍等（2002）在室內(nèi)采用PEG模擬干旱脅迫研究了21個(gè)苜蓿品種的抗旱性，結(jié)果表明隨水分脅迫加重，苜蓿葉片的膜透性增加，活性氧的氧化傷害加劇，根系活力下降，在-0.8 MPa的PEG脅迫下，苜蓿的細(xì)胞膜即受到明顯傷害，且品種間差異顯著。吳曉麗等（2008）運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)分析法，對(duì)5項(xiàng)抗旱指標(biāo)與5個(gè)紫花苜蓿品種抗旱性的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明各指標(biāo)對(duì)苜?？购敌缘挠绊?，以游離脯氨酸含量最大，其次為 SOD 及 POD，再次相對(duì)含水量，而葉片水勢(shì)的影響最小。穆懷彬等（2011）用5種不同水勢(shì)（0、-0.3、-0.6、-0.9和-1.2 MPa）的PEG-6000溶液對(duì)10個(gè)苜蓿品種幼苗進(jìn)行模擬干旱脅迫，比較其幼苗期的抗旱性。測(cè)定細(xì)胞膜透性，丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）和類(lèi)胡蘿卜素（Car）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）活性等生理指標(biāo)，結(jié)果表明，細(xì)胞膜透性及丙二醛含量在-0.3 MPa水勢(shì)時(shí)與對(duì)照相比變化不大，而脯氨酸含量與SOD活性均在-0.3 MPa水勢(shì)時(shí)下降。結(jié)果表明苜蓿幼苗在-0.3 MPa水勢(shì)下幾乎沒(méi)有受到干旱脅迫的傷害，而在-0.9 MPa水勢(shì)時(shí)，各測(cè)試指標(biāo)的變化趨勢(shì)均出現(xiàn)了明顯的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，說(shuō)明-0.9 MPa是苜蓿幼苗耐旱的關(guān)鍵水勢(shì)點(diǎn)，同時(shí)苜蓿幼苗耐旱的極限在一個(gè)適當(dāng)?shù)拈撝祪?nèi)。

以上技術(shù)雖通過(guò)PEG模擬干旱脅迫結(jié)合測(cè)定某些生理指標(biāo)的方法篩選了抗旱苜蓿品種，同時(shí)確定了苜蓿幼苗抗旱的關(guān)鍵水勢(shì)點(diǎn)及與苜蓿抗旱性相關(guān)的生理指標(biāo)，但以上篩選方法未考慮不同PEG濃度脅迫下不同抗旱能力苜蓿品種敏感性生理指標(biāo)體系不同，也缺乏極端干旱脅迫條件下，不同抗旱級(jí)別能力苜蓿品種間耐受能力的比較，以及反映苜蓿品種強(qiáng)抗旱性的敏感性生理指標(biāo)篩選，故難以準(zhǔn)確篩選出耐旱性較強(qiáng)的苜蓿品種。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種高效篩選抗旱苜蓿品種的方法。能夠準(zhǔn)確篩選出耐旱性較強(qiáng)的苜蓿品種。

本發(fā)明提供一種高效篩選抗旱苜蓿品種的方法，包括以下步驟：

（1）苜蓿幼苗培養(yǎng)；

（2）用含0.38 g/mL和0.43g/mL PEG-6000溶液的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液模擬干旱脅迫，對(duì)生長(zhǎng)40-45d的苜蓿幼苗根際脅迫處理7d；

（3）分別測(cè)定2個(gè)PEG-6000濃度脅迫下苜蓿的下列生理指標(biāo)：

1）0.38 g/mL PEG-6000溶液脅迫時(shí)，測(cè)定羥自由基濃度和過(guò)氧化氫酶活性；

2）0.43g/mL PEG-6000溶液脅迫時(shí)，測(cè)定可溶性糖含量、葉綠素含量、POD活性、葉片相對(duì)含水量、還原性抗壞血酸含量、丙二醛和超氧陰離子自由基；

（4）根據(jù)不同濃度的PEG-6000溶液脅迫下各生理指標(biāo)的敏感閾值，篩選抗旱苜蓿品種：

1）0.38 g/mL PEG-6000溶液脅迫時(shí)，若苜蓿體內(nèi)羥自由基濃度低于4143.99 A·1000·g^-1，CAT活性高于251.46 U·g^-1·min^-1；

2）0.43g/mL PEG-6000溶液脅迫時(shí)，若苜蓿體內(nèi)的可溶性糖含量高于20.94 mg·g^-1、Chl b高于1.51 mg·g^-1、Chl(a+b) 高于2.45 mg·g^-1、POD活性高于584.32 U·g^-1·min^-1、葉片相對(duì)含水量高于29.45%、還原性抗壞血酸含量高于214.68μg·g^-1、丙二醛低于0.14μmol·g^-1、超氧陰離子自由基含量低于146.98 nmol·g^-1·min^-1；

同時(shí)滿(mǎn)足1）、2）指標(biāo)體系及閾值范圍，則為抗旱苜蓿品種。

作為優(yōu)選，步驟（1）中所述苜蓿幼苗培養(yǎng)是將供試苜蓿種子播種在營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，出苗后間苗，生長(zhǎng)期間澆灌Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。

本發(fā)明采用2個(gè)極高濃度的PEG-6000溶液模擬強(qiáng)干旱脅迫環(huán)境結(jié)合測(cè)定苜蓿對(duì)抗旱性貢獻(xiàn)較大的生理指標(biāo)，通過(guò)比較不同抗旱苜蓿品種對(duì)高濃度PEG脅迫的耐受能力及相應(yīng)的敏感性生理指標(biāo)變化閾值，準(zhǔn)確、高效地篩選抗旱苜蓿品種。

本發(fā)明方法采用2個(gè)極高濃度的PEG-6000脅迫結(jié)合測(cè)定對(duì)苜蓿抗旱性反應(yīng)最敏感的生理指標(biāo)，確定出不同濃度PEG脅迫下，反映抗旱能力苜蓿品種的敏感性生理指標(biāo)體系及相應(yīng)的生理指標(biāo)敏感閾值，可進(jìn)一步簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確地從苜蓿種質(zhì)中篩選出抗旱苜蓿品種，也可為進(jìn)一步挖掘和利用較強(qiáng)抗旱苜蓿品種自身的抗逆基因提供參考方法，具有一定的實(shí)用性和可靠性。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售。

實(shí)施例1

一種高效篩選抗旱苜蓿品種的方法，步驟如下：

（1）苜蓿幼苗培養(yǎng)?？梢圆捎矛F(xiàn)有技術(shù)中任何苜蓿幼苗培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，比如采用營(yíng)養(yǎng)液沙培法。將供試苜蓿種子播種在營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，出苗后間苗，生長(zhǎng)期間澆灌Hoagland營(yíng)養(yǎng)液；

（2）用含0.38 g/mL(-1.6 MPa)和0.43g/mL (-2.0 MPa)PEG-6000溶液的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液模擬干旱脅迫，對(duì)生長(zhǎng)6周左右的苜蓿幼苗根際脅迫處理7d；

（3）分別測(cè)定2個(gè)PEG-6000濃度脅迫下，苜蓿的下列生理指標(biāo)；

1）0.38 g/mL PEG-6000溶液脅迫時(shí)，測(cè)定羥自由基（OH^?）濃度和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性；

2）0.43g/mL PEG-6000溶液脅迫時(shí)，測(cè)定可溶性糖含量、葉綠素含量、POD活性、葉片相對(duì)含水量（RWC）、還原性抗壞血酸（AsA）含量、丙二醛（MDA）和超氧陰離子自由基（O₂^?-）；

（4）根據(jù)不同濃度的PEG-6000溶液脅迫下各生理指標(biāo)的敏感閾值，篩選抗旱苜蓿品種：

1）0.38 g/mL PEG-6000溶液脅迫時(shí)，若苜蓿體內(nèi)羥自由基（OH^?）濃度低于4143.99 A·1000·g^-1，CAT活性高于251.46 U·g^-1·min^-1；

2）0.43g/mL PEG-6000溶液脅迫時(shí)，若苜蓿體內(nèi)的可溶性糖含量高于20.94 mg·g^-1、Chl b高于1.51 mg·g^-1、Chl(a+b) 高于2.45 mg·g^-1、POD活性高于584.32 U·g^-1·min^-1、葉片相對(duì)含水量（RWC）高于29.45%、還原性抗壞血酸（AsA）含量高于214.68μg·g^-1、丙二醛（MDA）低于0.14μmol·g^-1、超氧陰離子自由基（O₂^?-）含量低于146.98 nmol·g^-1·min^-1；

同時(shí)滿(mǎn)足1）、2）指標(biāo)體系及閾值范圍，則為抗旱苜蓿品種。

實(shí)施例2

本實(shí)驗(yàn)以長(zhǎng)期生長(zhǎng)于年降雨量200~350mm，年蒸發(fā)量1531mm，年平均氣溫 6.3℃，年日照時(shí)數(shù) 2500 h，無(wú)霜期平均為 140 d的黃土高原隴中干旱區(qū)域的強(qiáng)抗旱苜蓿品種隴中苜蓿為例，采用PEG-6000模擬干旱脅迫，測(cè)定其響應(yīng)干旱脅迫時(shí)反應(yīng)較敏感的生理指標(biāo)，步驟如下：

（1）隴中苜蓿幼苗培養(yǎng)。采用營(yíng)養(yǎng)液沙培法。將供試苜蓿種子播種在營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，出苗后間苗，生長(zhǎng)期間澆灌Hoagland營(yíng)養(yǎng)液；

（2）用含0.38 g/mL(-1.6 MPa)和0.43g/mL (-2.0 MPa)PEG-6000溶液的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液模擬干旱脅迫，對(duì)生長(zhǎng)6周左右的苜蓿幼苗根際脅迫處理7d；

（3）分別測(cè)定2個(gè)PEG-6000濃度脅迫下，反映隴中苜?？购敌缘纳碇笜?biāo)，包括：葉綠素a(Chl a)、葉綠素b( Chl b) 、葉綠素(a+b)、葉片相對(duì)含水量（RWC）、脯氨酸含量（Pro）、可溶性蛋白含量（SP）、可溶性糖含量（SS）、丙二醛（MDA）、過(guò)氧化氫（H₂O₂）含量、羥自由基含量（OH^·）、 超氧陰離子自由基（O₂^·-）、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、還原性抗壞血酸（AsA）含量、還原性抗壞血酸（GSH）含量。

（4） 主成分分析法分析隴中苜蓿響應(yīng)干旱脅迫時(shí)反應(yīng)最敏感的生理指標(biāo)。

1） 0.38 g/mL PEG-6000溶液脅迫時(shí)，隴中苜蓿前2個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分別為68.38%和31.62%，累積方差貢獻(xiàn)率為100%，表明前2個(gè)主成分可將隴中苜蓿100%的抗旱性信息反映出來(lái)。第一主成分對(duì)應(yīng)較大的特征向量有Chl b、RWC、OH^? 和Chl (a+ b)；第二主成分對(duì)應(yīng)較大的特征向量有 CAT；

2）0.43 g/mL PEG-6000溶液脅迫時(shí)，隴中苜蓿前2個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分別為60.12%和39.88%，累積方差貢獻(xiàn)率為100%，表明前2個(gè)主成分可將隴中苜蓿100%的抗旱性信息反映出來(lái)。第一主成分對(duì)應(yīng)較大的特征向量有SS、Chl b、Chl( a+b)和POD；第二主成分對(duì)應(yīng)較大的特征向量有 RWC、MDA、O₂^?-和AsA。

（5）確定隴中苜蓿響應(yīng)干旱脅迫時(shí)反應(yīng)最敏感的生理指標(biāo)的含量。

1）0.38 g/mL PEG-6000溶液脅迫時(shí)，隴中苜蓿體內(nèi)羥自由基（OH^?）濃度為4143.99 A·1000·g^-1，CAT活性為251.46 U·g^-1·min^-1；

2）0.43g/mL PEG-6000溶液脅迫時(shí)，苜蓿體內(nèi)的可溶性糖含量為20.94 mg·g^-1、Chl b為1.51 mg·g^-1、Chl(a+b)為2.45 mg·g^-1、POD活性為584.32 U·g^-1·min^-1、葉片相對(duì)含水量（RWC）為29.45%、還原性抗壞血酸（AsA）含量為214.68μg·g^-1、丙二醛（MDA）為0.14μmol·g^-1、超氧陰離子自由基（O₂^?-）含量為146.98 nmol·g^-1·min^-1。

（6）不同PEG濃度脅迫下篩選抗旱苜蓿品種的生理指標(biāo)體系及相應(yīng)的閾值范圍。

1）0.38 g/mL PEG-6000溶液脅迫時(shí)，苜蓿體內(nèi)羥自由基（OH^?）濃度低于4143.99 A·1000·g^-1，CAT活性高于251.46 U·g^-1·min^-1；

2）0.43g/mL PEG-6000溶液脅迫時(shí)，苜蓿體內(nèi)的可溶性糖含量高于20.94 mg·g^-1、Chl b高于1.51 mg·g^-1、Chl(a+b) 高于2.45 mg·g^-1、POD活性高于584.32 U·g^-1·min^-1、葉片相對(duì)含水量（RWC）高于29.45%、還原性抗壞血酸（AsA）含量高于214.68μg·g^-1、丙二醛（MDA）低于0.14μmol·g^-1、超氧陰離子自由基（O₂^?-）含量低于146.98 nmol·g^-1·min^-1；

隴中苜蓿同時(shí)滿(mǎn)足1）、2）指標(biāo)體系及閾值范圍，為抗旱苜蓿品種。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。