本發(fā)明屬于作物遺傳育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種多室油菜種質(zhì)資源的選育方法。
背景技術(shù)：
：在油菜遺傳育種中，遺傳資源的多樣性是選育油菜新品種的物質(zhì)基礎(chǔ)，油菜育種突破性成就的取得往往與其關(guān)鍵性基因資源的發(fā)現(xiàn)、研究和利用密切相關(guān)。因此，種質(zhì)資源的創(chuàng)新對(duì)油菜育種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。長(zhǎng)期以來(lái)，高產(chǎn)育種一直是油菜遺傳育種最重要最基本的研究?jī)?nèi)容之一，也是油菜育種的熱點(diǎn)研究方向之一。在油菜育種實(shí)踐中，以提高油菜產(chǎn)量為目的的育種手段主要包括提高油菜品種的角粒數(shù)、角果數(shù)、千粒重，以及雜種優(yōu)勢(shì)的利用等方面；以提高油菜產(chǎn)量為目的的栽培措施主要包括適當(dāng)?shù)乃?、種植密度、以及病蟲草害的防治等方面，以達(dá)到生產(chǎn)應(yīng)用上的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的目的。在油菜角粒數(shù)育種方面，常以提高油菜角果中籽粒的絕對(duì)數(shù)量為出發(fā)點(diǎn)，選育平均角粒數(shù)高的油菜材料。常規(guī)的油菜角果一般為兩室，即只有兩排種子。而相對(duì)于普通的兩室油菜而言，多室油菜是指角果為三室或多于三室的油菜，是具有多室多粒性狀的一類特殊的油菜種質(zhì)資源。多室角果(三室或更多室)由于具有三排或三排以上的種子，可達(dá)到增加油菜每角粒數(shù)的目的。因此，多室油菜具有一定的增產(chǎn)潛力。但是甘藍(lán)型三室油菜的選育目前未見報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提出一種多室油菜種植資源的選育方法，本發(fā)明可快速累積和穩(wěn)定油菜多室性狀，選育綜合性狀優(yōu)良的多室材料。為解決上述問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種多室油菜種質(zhì)資源的選育方法，包括以下步驟：步驟一，初始多室油菜多代自交，獲得多室油菜群體；步驟二，將步驟一得到的多室油菜群體兩兩之間進(jìn)行雜交配制雜交組合，油菜成熟期收獲各組合的雜種F1代種子，對(duì)雜種F1代種子進(jìn)行秋播；步驟三，當(dāng)雜種F1代種子生長(zhǎng)到油菜蕾苔期至初花期時(shí)，先取油菜花蕾進(jìn)行游離孢子培養(yǎng)，再依次經(jīng)胚培養(yǎng)、幼苗培養(yǎng)和田間移栽，獲得雙單倍體植株群體；步驟四，雙單倍體植株群體各單株油菜進(jìn)行套袋自交，收獲自交后代各單株的種子進(jìn)行播種；步驟五，重復(fù)步驟二～四，直至育成平均多室角率大于60％的不同性狀的多室油菜種質(zhì)資源。步驟一所述多代自交為3～5代，初始多室油菜多代自交包括以下步驟：1.1將不同年份收集的油菜初始多室角果脫粒得到油菜種子，進(jìn)行播種種植；1.2在油菜花期時(shí)選單株油菜進(jìn)行套袋自交，在成熟期時(shí)收集每個(gè)單株油菜自交后代種子并播種，再在成熟期時(shí)統(tǒng)計(jì)每個(gè)單株油菜自交后代多室株率、多室角率和平均多室角率；1.3選自交后代多室株率、多室角率和平均多室角率滿足條件A的油菜依次重復(fù)步驟1.1和1.2，進(jìn)行多代自交選育；以初始多室油菜第一次自交選育為第1代，第1～2代時(shí)，條件A包括：多室株率＞30％，多室角率＞50％，平均多室角率＞20％，第3～5代時(shí)，條件A為：多室株率＞100％，多室角率＞85％，平均多室角率＞60％；多室株率＝(油菜植株群體中具有多室角果的植株數(shù)量÷油菜植株群體的植株總數(shù))×100％，多室角率＝(單株油菜多室角數(shù)總和÷單株油菜角果總數(shù)之和)×100％，平均多室角率＝(所有單株油菜多室角率之和÷油菜植株群體的植株總數(shù))×100％。步驟二中，所述兩兩之間進(jìn)行雜交配制雜交組合包括兩兩之間進(jìn)行人工剝蕾、授粉雜交，配制正反交雜交組合。步驟三中，所述游離孢子培養(yǎng)包括對(duì)油菜花蕾經(jīng)過(guò)擠壓或研磨，使小孢子從花蕾中釋放出，然后再在培養(yǎng)基中進(jìn)行孢子培養(yǎng)獲得胚狀體；所述胚培養(yǎng)包括將上述胚狀體轉(zhuǎn)入B5固體培養(yǎng)基上，進(jìn)一步誘導(dǎo)胚狀體分化成苗；所述雙單倍體植株群體包括在孢子培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入秋水仙堿，在誘導(dǎo)胚狀體產(chǎn)生的同時(shí)，對(duì)小孢子染色體組進(jìn)行加倍，獲得加倍的雙單倍體植株群體。所述培養(yǎng)基為NLN液體淺層培養(yǎng)基。步驟四中，所述雙單倍體植株群體各單株油菜套袋自交選育包括：當(dāng)所述雙單倍體植株群體生長(zhǎng)到初花期時(shí)，對(duì)雙單倍體植株群體中所有單株油菜逐個(gè)進(jìn)行套袋自交，油菜成熟期時(shí)統(tǒng)計(jì)多室株率和單株多室角率，收獲各單株的種子進(jìn)行播種。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：(1)本發(fā)明首次成功選育公開了甘藍(lán)型三室油菜種質(zhì)資源，采用本發(fā)明所提供的多室油菜種植資源的選育方法成功獲得株率100％，角率大于90％的三室油菜材料。(2)采用本發(fā)明的方法可創(chuàng)建一批不同類型性狀的油菜多室材料，拓寬并豐富了油菜種質(zhì)資源。(3)本發(fā)明采用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)和秋水仙堿加倍技術(shù)，可快速累積和聚合多室性狀基因，純化油菜多室材料，構(gòu)建多室材料的DH系純合自交群體，加速多室油菜的選育過(guò)程。(4)本發(fā)明采用“雜交→小孢子培養(yǎng)→自交”三者有序結(jié)合且進(jìn)行二次重復(fù)的選育方法進(jìn)行油菜多室材料的選育，加速了多室油菜的選育過(guò)程。(5)本發(fā)明克服了油菜花期多室性狀不明顯和不易辨認(rèn)的難點(diǎn)，從多室株率和多室角率兩方面的指標(biāo)入手進(jìn)行選育，加速了多室油菜的選育過(guò)程。實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的方法，發(fā)明人首次在世界上選育了甘藍(lán)型三棱角(三室)油菜。迄今為止，采用本發(fā)明的方法已經(jīng)創(chuàng)建了一批甘藍(lán)型油菜三棱角(三室)材料，如：高、中、低桿材料、長(zhǎng)角材料、雙低材料、含油量45％左右的材料，而且目前已經(jīng)選育出三棱角(三室)株率為100％且角率大于90％的性狀較優(yōu)的長(zhǎng)角三棱角(三室)油菜新材料。由此可見，本發(fā)明是一種行之有效的選育多室油菜的方法途徑，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明的技術(shù)路線結(jié)構(gòu)圖。圖2為三棱角(三室)油菜材料04ds55(編號(hào)為不同三室油菜材料植株編號(hào))的游離小孢子培養(yǎng)和DH系繁殖圖。其中：A.04ds55經(jīng)小孢子培養(yǎng)獲得的胚狀體；B.04ds55胚狀體誘導(dǎo)獲得的試管苗。圖3為三棱角(三室)材料與普通角(兩室)材料的角果形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)比較圖。其中：A.主花序角果比較；B.角果形態(tài)比較；C.角果橫截面形態(tài)比較。其中，左：普通角果(兩室)；右：三棱角角果(三室)。圖4為選育的甘藍(lán)型三棱角(三室)油菜成熟期角果和植株群體圖。其中：A.三棱角油菜材料12ds145(左)、12ds147(中)、12ds146(右)三室角果形態(tài)特征比較；B.選育的三棱角油菜11ds242結(jié)角期的植株群體。以下結(jié)合附圖進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)介紹。具體實(shí)施方式本發(fā)明探索了一種新的有效的獲得多室油菜種質(zhì)資源的方法，對(duì)于提高油菜產(chǎn)量，進(jìn)行油菜多室種質(zhì)資源的創(chuàng)新和多室油菜的選育，提高油菜產(chǎn)量具有重要意義。此種方法具有普適性，不局限于油菜的品種，并且理論上可以獲得四室等更高室種質(zhì)資源材料。而關(guān)于本發(fā)明獲得的甘藍(lán)型三室油菜種質(zhì)資源及該多室油菜資源的創(chuàng)新選育方法，國(guó)內(nèi)外至今未見報(bào)道。本發(fā)明從增加油菜角果的果室數(shù)來(lái)達(dá)到增加油菜角粒數(shù)的目的，創(chuàng)建油菜多室材料，以最終達(dá)到培育多室油菜品種和提高油菜產(chǎn)量的目的。三棱角(三室)油菜是發(fā)明人近年來(lái)發(fā)現(xiàn)并自主選育的一種新的甘藍(lán)型油菜種質(zhì)資源，是多室油菜的一種重要類型，具有多室、多粒和抗裂角性強(qiáng)的特性。其角果呈三棱柱狀、三室，角果皮為三瓣、角果橫截面為近三角形。三室油菜的研究，對(duì)豐富和充實(shí)油菜花器官的發(fā)育和角果的形態(tài)建成理論、油菜的生殖生理、起源進(jìn)化以及探討三棱角油菜的遺傳特性和分子機(jī)理具有重要的理論意義；三棱角油菜種質(zhì)資源的開發(fā)利用，對(duì)豐富和充實(shí)油菜種質(zhì)資源、開發(fā)利用多室油菜以及油菜的高產(chǎn)育種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。甘藍(lán)型油菜的角果數(shù)一般少則幾百，多則上千，作者早期收集多室角果時(shí)，油菜材料中的多室角果出現(xiàn)頻率極低，只有個(gè)別植株上偶爾出現(xiàn)1個(gè)多室角果，選育過(guò)程中，油菜植株上的普通兩室角果與三棱角三室角果共存，即存在角果嵌合現(xiàn)象，并且，本三室性狀是一種隱性性狀，屬于一種數(shù)量性狀，受多基因控制，增加了選育難度，同時(shí)，本三室性狀是伴隨著雌蕊和子房的發(fā)育和分化而發(fā)育形成的，雖然在角果期清晰易辨，但是在油菜蕾苔期至花期由于子房很小，不易辨認(rèn)，不易操作。由于以上原因，使得本三室油菜雜交和選育難度增大。因此，通過(guò)自交、雜交結(jié)合油菜小孢子培養(yǎng)，以及三室株率和角率等篩選指標(biāo)進(jìn)行本三室油菜的選育，以加速其選育進(jìn)程。本發(fā)明所述重復(fù)步驟二～四的方法，是指采用“雜交→小孢子培養(yǎng)→自交”的有機(jī)結(jié)合且二次重復(fù)的方法進(jìn)行油菜多室材料的選育，進(jìn)一步有效累積且聚合了油菜多室性狀，加速了多室油菜的選育進(jìn)程。本發(fā)明步驟1.3中多代自交選育是一個(gè)動(dòng)態(tài)的選育過(guò)程，沒有固定不變的標(biāo)準(zhǔn)。早期選育以多室株率＞30％，多室角率＞50％，平均多室角率＞20％的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行選育。之后隨著選育進(jìn)程的推進(jìn)，以上標(biāo)準(zhǔn)也在相應(yīng)提高。目前的選育指標(biāo)是：多室株率＞100％，多室角率＞85％，平均多室角率＞60％。本發(fā)明所用油菜材料來(lái)自于不同年份收集的甘藍(lán)型油菜三室角果，稱為初始三室角果，所述按常規(guī)方法進(jìn)行播種和田間管理是發(fā)明人在所在單位—陜西省雜交油菜研究中心試驗(yàn)田進(jìn)行常規(guī)的播種(秋播)和田間管理。本發(fā)明油菜三棱角(三室)角果的發(fā)現(xiàn)與收集：早期(1995～1998年)在油菜結(jié)角期、成熟期以及油菜夏收脫粒過(guò)程中，常在油菜試驗(yàn)田發(fā)現(xiàn)一些油菜材料中，在個(gè)別植株上的角果中會(huì)出現(xiàn)個(gè)別多室角果，包括三棱角(三室)角果，于是，在不同年份收集這些角果并脫粒保存種子。實(shí)施例1：本實(shí)施例提供一種多室油菜種質(zhì)資源的選育方法，具體步驟如下：(1)初始多室油菜多代自交，獲得多室油菜群體：1997年開始將在不同年份收集的多室角果種子進(jìn)行編號(hào)和播種。次年油菜初花期選3～5株進(jìn)行套袋自交。油菜成熟期統(tǒng)計(jì)自交和開放授粉下普通兩室角果和多室角果的數(shù)量，計(jì)算各材料的株率和角率，秋季選取多室角果株率和角率高的材料進(jìn)行播種，如此反復(fù)，進(jìn)行多代自交選育(一般為3～5代)，以提高各多室材料的株率和角率；(2)雜交：油菜多室材料間的有性雜交——油菜初始多室材料經(jīng)多代(3-5代)自交選育，2001年油菜花期，對(duì)選育的較高株率和角率的不同油菜多室材料之間進(jìn)行兩兩雜交，角果成熟期收獲各雜交組合F1代種子用于秋播。兩兩之間進(jìn)行雜交配制雜交組合是指采取油菜遺傳育種中常規(guī)的油菜雜交方法，對(duì)經(jīng)過(guò)多代自交選育所得到的株率和角率較高的各多室材料，兩兩之間進(jìn)行人工剝蕾、授粉雜交，配制正反交雜交組合；(3)游離小孢子培養(yǎng)：自2002年開始，在油菜蕾苔期至初花期，取各雜種F1代的花蕾進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，對(duì)所選油菜花蕾經(jīng)過(guò)擠壓或研磨，使小孢子從花蕾中釋放出來(lái)，然后再在NLN液體淺層培養(yǎng)基(Lichter,1982)上進(jìn)行培養(yǎng)，從而誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生的過(guò)程。通過(guò)小孢子培養(yǎng)得到胚狀體，胚狀體培養(yǎng)得到試管苗，試管苗進(jìn)一步移栽到田間獲得DH系植株群體。(4)自交：油菜多室材料DH系群體(雙單倍體植株群體)各單株套袋自交：在油菜初花期，對(duì)獲得的油菜多室材料的DH系植株群體各單株分別進(jìn)行套袋自交。在油菜成熟期，統(tǒng)計(jì)DH系群體中各自交單株兩室角果和多室角果的數(shù)量，計(jì)算各單株的多室角率，收獲各單株的自交種子用于秋播。(5)重復(fù)步驟(2)～(4)“雜交→游離小孢子培養(yǎng)→自交”過(guò)程，進(jìn)一步選育株率和角率高且性狀優(yōu)良的油菜多室新材料，最終育成一批角率大于60％的不同性狀的多室油菜種質(zhì)資源。實(shí)施例2：如圖1至圖4所示，本實(shí)施例提供一種甘藍(lán)型三室油菜種質(zhì)資源的選育方法，本實(shí)施例按照實(shí)施例1的選育方法，通過(guò)收集的甘藍(lán)型三室油菜種子，成功選育了一批甘藍(lán)型三室油菜，采用步驟如下：按照實(shí)施例1的方法，先在不同年份收集甘藍(lán)型油菜初始三室角果共計(jì)17份，通過(guò)多代自交，以及結(jié)合三室角率和株率作為選育指標(biāo)，使所選育三室材料的角率和株率得以逐步提高，2001年油菜花期，在所選取的三室株率和角率較高的油菜三室材料之間進(jìn)行兩兩雜交，共配制7個(gè)雜交組合。從2002年開始，在油菜蕾苔期至初花期，取各雜交組合F1代的花蕾進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，獲得了來(lái)源于4個(gè)雜交組合的DH系植株群體(圖2)。2003年在油菜初花期，對(duì)獲得的三室材料的DH系植株群體各單株分別進(jìn)行套袋自交。在油菜成熟期，統(tǒng)計(jì)各自交單株兩室角果和三室角果的數(shù)量，計(jì)算各單株的三室角率，收獲各群體單株的種子分別為106份、55份、41份、16份，再重復(fù)“雜交→小孢子培養(yǎng)→自交”過(guò)程，最終育成株率為100％、角率大于90％的甘藍(lán)型油菜三室材料(圖3)。以下是對(duì)按照實(shí)施例1的選育方法選育出的甘藍(lán)型三室油菜的說(shuō)明，甘藍(lán)型油菜三棱角(三室)材料的角果特征如圖3和表1所示。由圖3和表1可知，三棱角(三室)角果明顯比普通角(兩室)角果粗大，其平均角粒數(shù)明顯比普通角(兩室)角果多，而且其角果橫截面為近三角形，使其角果由于獨(dú)特的三棱柱狀結(jié)構(gòu)因而具有較強(qiáng)的抗裂角特性。表1三棱角果(三室)與普通角果(兩室)特征比較角果類型普通角果三棱角果角果外形偏平柱狀三棱柱狀角果長(zhǎng)度/cm7.0477.095角果截面周長(zhǎng)/cm1.2381.533千粒重/g4.1293.497角粒數(shù)15.26319.683角果橫截面近橢圓形，兩室近三角形，三室角果皮兩瓣三瓣隔膜橫截面“1”狀“Y”狀迄今為止，發(fā)明人已成功獲得了一批高稈(株高165～175cm)、莖稈高度中等(株高介于高稈和矮稈之間)、矮稈(株高40～50cm)、長(zhǎng)角(角果長(zhǎng)度6.5～8.29cm)、早熟(比一般材料早熟3～5天)、雙低(芥酸含量＜5％，硫苷含量＜30μmol/g)、含油量40％～45％(本發(fā)明油菜樣品含油量分析方法采用近紅外光譜法，所用儀器為德國(guó)布魯克MATRIX_I型近紅外光譜儀)的三棱角(三室)油菜種質(zhì)資源(如圖4)。由圖4(A)可知，三棱角油菜材料12ds147的三棱角角果明顯長(zhǎng)于12ds145和12ds146的三棱角角果，屬于長(zhǎng)角角果。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3