本發(fā)明涉及植物育種技術(shù)，具體屬于一種蘭科植物的育種方法。

背景技術(shù)：

蘭科植物是單子葉第一大植物，其中許多極具價(jià)值的高檔花卉和珍貴藥用植物。君子蘭、蕙蘭等中國(guó)蘭自古以來就是文人心中高風(fēng)亮節(jié)的代表花朵。蘭花以其強(qiáng)韌的生命力和環(huán)境適應(yīng)力，優(yōu)美雅麗的花朵，被賦予高雅脫俗的人文意義。蝴蝶蘭(Phalaenopsis)又稱蝶蘭,是蘭科植物中栽培最廣泛、最普及的種類之一。由于，花色艷麗豐富，花形別致，花大，開花期長(zhǎng)(2-3個(gè)月)，深受人們的喜愛,享有“花中皇后”的美譽(yù)。素有“九大仙草之首”之稱的鐵皮石斛更是名貴的中藥材。具有滋陰養(yǎng)胃，抗癌抑菌，降糖降壓等重要功效。

雖然蘭科植物具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但是由于蘭科植物的種子無胚乳，自然條件下，萌發(fā)率極低或者不能萌發(fā)，加之蘭科植物生長(zhǎng)發(fā)育慢，新品種選育需要經(jīng)過漫長(zhǎng)的時(shí)間，因此，蘭科植物普遍存在著品種結(jié)構(gòu)單調(diào)，優(yōu)種繁育周期長(zhǎng)等弊病。因此，高效的育種、繁殖技術(shù)對(duì)蘭科植物產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展具有重要意義，同時(shí)也是育種行業(yè)迫切需要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種蘭科植物的育種方法。

本發(fā)明提供的一種蘭科植物的育種方法，包括如下步驟：

1)根據(jù)育種目標(biāo)選取蘭科植物親本材料進(jìn)行栽植培養(yǎng)，在盛花期進(jìn)行人工授粉，授粉后100-150天采收果莢；

果莢經(jīng)消毒后，在無菌條件下播種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，置于25±2℃下培養(yǎng)，光照時(shí)間16小時(shí)/天，光照強(qiáng)度2000±100lx；50天后，誘導(dǎo)出原球莖；

所述的萌發(fā)培養(yǎng)基為：花寶1號(hào)2-4g/L+6-BA1-5mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂6g/L+活性炭1-2g/L；

2)將誘導(dǎo)出的原球莖轉(zhuǎn)入類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生類原球莖及增殖培養(yǎng)；培養(yǎng)條件：25±2℃，光照時(shí)間16小時(shí)/天，光照強(qiáng)度2000±100lx；

所述的類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：花寶1號(hào)2-4g/+6-BA 1.0-6.0mg/L+NAA0.1-0.8mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂6g/L+活性炭1-2g/L；

3)類原球莖基因型鑒定：利用過氧化物酶(POD)同工酶對(duì)類原球莖的進(jìn)行鑒定；根據(jù)POD同工酶條帶的位置和顏色深淺確定其與親本的關(guān)系，對(duì)獲得的類原球莖個(gè)體進(jìn)行篩選；

4)將入選的類原球莖，無菌條件下，接種于花寶1號(hào)2-4g/L+6-BA 1.0-4.0mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂6g/L+活性炭1-2g/L，pH為5.4-5.8的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)；培養(yǎng)條件：溫度為25.0±2℃，光照時(shí)間16小時(shí)/天，光照強(qiáng)度2000±100lx；培養(yǎng)30天后分化出芽和根；

5)將分化出的蘭科植物幼苗培養(yǎng)于壯苗培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至幼苗長(zhǎng)出3-5片葉，移入溫室生長(zhǎng)至開花；

所述的壯苗培養(yǎng)基為：花寶1號(hào)2-4g/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.5g/L+活性炭1-2.0g/L，pH為5.4-5.8；培養(yǎng)條件：溫度為25.0±2℃，光照時(shí)間16小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為2000±100lx，空氣濕度為65％-80％。

與目前常規(guī)的蘭科植物雜交育種技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

1)本發(fā)明利用現(xiàn)代生化技術(shù)或分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)雜交一代進(jìn)行快速鑒定，不需要先選育自交系，節(jié)省了育種的時(shí)間。

2)本發(fā)明利用原球莖誘導(dǎo)產(chǎn)生類原球莖并誘導(dǎo)類原球莖進(jìn)行增殖，大大擴(kuò)大了種子的數(shù)量，又節(jié)省了種子繁育時(shí)間。

3)本發(fā)明不僅為蘭科植物提供了一個(gè)新的育種技術(shù)，而且也為其他難以進(jìn)行正常有性繁殖的植物種提供了可以借鑒得育種技術(shù)。

附圖說明

圖1蝴蝶蘭品種HCH(左)和品種HOO7(右)，為本實(shí)驗(yàn)蝴蝶蘭雜交的母本和父本。

圖2蝴蝶蘭原球莖發(fā)育圖，其中：A播種45天的蝴蝶蘭原球莖；B蝴蝶蘭原球莖接種于增殖培養(yǎng)基30d后的生長(zhǎng)情況；C類蝴蝶蘭原球莖接種于分化培養(yǎng)基60天后的生長(zhǎng)情況

圖3蝴蝶蘭類原球莖POD同工酶分析，其中：1.母本；5.父本；2-4.為不同的雜交后代。

圖4鐵皮石斛原球莖發(fā)育圖，其中：A播種50天的鐵皮石斛原球莖；B鐵皮石斛原球莖增殖；C鐵皮石斛再生苗

圖5鐵皮石斛類原球莖POD同工酶分析，其中：1.為自交親本；2-為自交后代。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1蝴蝶蘭雜交育種

(1)蝴蝶蘭雜交及雜交種子無菌播種方法

在盛花期取蝴蝶蘭HCH和HOO7(見圖1)的花粉進(jìn)行雜交。雜交花朵注意保濕，仔細(xì)管理，直到發(fā)育為成熟的果莢。

取發(fā)育到120天尚未開裂的蝴蝶蘭果莢，在超凈工作臺(tái)中用0.1％的HgCl₂溶液中處理8-10min，用無菌水沖洗5-8次。在超凈臺(tái)上用解剖刀將果莢縱剖，將果莢中的種子取出接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基：花寶1號(hào)3.5g/L+6-BA 3mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂6g/L+活性炭2g/L上培養(yǎng)室中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：光照時(shí)間16小時(shí)/天，溫度為25.0±2℃，光照強(qiáng)度為2000lx。蝴蝶蘭種子播種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上14天后開始膨脹，呈白色；30天后種子開始萌發(fā)，少量胚出現(xiàn)，呈淡黃色；50天后種子萌發(fā)完成，胚大量出現(xiàn)，呈黃綠色；種子萌發(fā)率達(dá)到65.04％，見圖2中A。

(2)類原球莖誘導(dǎo)及增殖

種子播種后50天后，將誘導(dǎo)出的原球莖轉(zhuǎn)入類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生類原球莖并進(jìn)行類原球莖增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)條件同上。

類原球莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：花寶1號(hào)3.5g/L+6-BA5.0mg/L+NAA0.7mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.5g/L+活性炭2.0g/L，pH為5.4-5.8；蝴蝶蘭類原球莖誘導(dǎo)和增殖效果較好，增殖系數(shù)達(dá)到17.33，見圖2中B。

(3)類原球莖過氧化物酶同工酶鑒定

取類原球莖0.5g加入液氮研磨成細(xì)粉，加入1ml樣品提取液(Tis-HCl pH7.0)，冰上放置30分鐘，4℃條件下12000r/min離心15分鐘。取上清得到POD同工酶粗提液。每個(gè)樣品取10ul酶粗提液上樣，用SDS-PAGE膠進(jìn)行檢測(cè)。POD同工酶采用醋酸聯(lián)苯胺染色法染色。如圖3所示，樣品2，3的帶型與親本1，5一致，表明樣品2，3具有與親本相同的基因型，為本實(shí)驗(yàn)入選的材料。

(4)類原球莖分化

將入選的類原球莖細(xì)胞塊，在超凈工作臺(tái)中小心切割開，接種于分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)類原球莖分化成再生植株。

分化培養(yǎng)基為：花寶1號(hào)3.5g/L+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂6g/L+活性炭2g/L；蝴蝶蘭原球莖分化率可以達(dá)到96.67％。培養(yǎng)條件為：光照時(shí)間16小時(shí)/天，溫度為25.0±2℃，光照強(qiáng)度為2000lx，。

(5)壯苗培養(yǎng)

分化出的蝴蝶蘭幼苗培養(yǎng)在壯苗培養(yǎng)基，即花寶1號(hào)3.5g/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.5g/L+活性炭2.0g/L，pH為5.4-5.8的壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)60天后，將小苗轉(zhuǎn)移到溫室繼續(xù)培養(yǎng)，直至成為完整的成品花。

溫室條件為：光照時(shí)間16小時(shí)/天，溫度為25.0±2℃，光照強(qiáng)度為2000lx，空氣濕度為65％-75％。

實(shí)施例2鐵皮石斛自交后代的選擇

(1)鐵皮石斛實(shí)生種子萌發(fā)

在鐵皮石斛盛花期取同株不同花的花粉自交授粉，得到果莢。

取發(fā)育成熟尚未開裂的果莢，在超凈工作臺(tái)中用0.1％的HgCl₂溶液中處理8-10分鐘，用無菌水沖洗5-8次。在超凈臺(tái)上用解剖刀將果莢縱剖，將果莢中的種子接種于花寶1號(hào)3.5g/L+6-BA 2mg/L+NAA0.3mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂6g/L+活性炭2g/L中培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度25.0±2℃，光照強(qiáng)度為2000lx。在此條件下，鐵皮石斛的種子萌發(fā)率達(dá)到80％，見圖4中A。

(2)類原球莖誘導(dǎo)

種子播種后60天左右，將誘導(dǎo)出的原球莖轉(zhuǎn)入類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生類原球莖并進(jìn)行類原球莖增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)條件同上。

鐵皮石斛類原球莖誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為：花寶1號(hào)3.5g/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.5g/L+活性炭2.0g/L，pH為5.4-5.8。類原球莖誘導(dǎo)率達(dá)93％，平均增殖系數(shù)為4.93，最大增殖系數(shù)可達(dá)23見圖4中B。

(3)類原球莖基因型鑒定(過氧化物酶同工酶鑒定)

采用與上述實(shí)施例1中蝴蝶蘭相同的POD同工酶鑒定方法對(duì)自交后代進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出2，3，7，8的帶型與親本1完全一致，表明2，3，7，8具有與親本相同的基因型，為本實(shí)驗(yàn)入選的材料。

(4)類原球莖分化及生根培養(yǎng)

將入選的類原球莖細(xì)胞塊，在超凈工作臺(tái)中小心切割開，接種于花寶1號(hào)3.5g/L+6-BA 2.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂6g/L+活性炭2g/L，pH為5.4-5.8的分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)類原球莖分化出芽苗。接種后30天芽苗開始分化，45天時(shí)分化率達(dá)到95％，生根率達(dá)85％。

(5)壯苗培養(yǎng)

將分化出的鐵皮石斛幼苗培養(yǎng)于花寶1號(hào)3.5g/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.5g/L+活性炭2.0g/L，pH為5.4-5.8的壯苗培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為：溫度25.0±2℃，光照強(qiáng)度為2000lx。經(jīng)過70天壯苗培養(yǎng)后，將小苗轉(zhuǎn)移到網(wǎng)室中生長(zhǎng)。見圖4中C。