本發(fā)明涉及魚類遺傳育種領(lǐng)域，具體是一種異源精子誘導(dǎo)翹嘴鱖人工雌核發(fā)育的方法。

背景技術(shù)：

翹嘴鱖魚(Siniperca chuatsi)隸屬于鱸形目(Perciformes)鰭科(Serranidae)鱖亞科(Sinipercinae)鱖屬(Siniperca)，為我國淡水名貴魚類，其肉質(zhì)潔白細嫩、肥厚鮮美、無小刺、富含人體所需的8種氨基酸，具有極高的營養(yǎng)價值和食療作用。鱖終生以其它魚類活餌為食，在鱖屬魚類中的幾種鱖魚(例如大眼鱖、斑鱖、翹嘴鱖)中，翹嘴鱖的體型最大、生長速度最快，因此翹嘴鱖是我國鱖養(yǎng)殖業(yè)中最主要的種類。在本項目的以下陳述中，除非特別說明，本申請項目中所說的研究對象“鱖”均是指“翹嘴鱖”(Siniperca chuatsi)。

自從上世紀(jì)80年代鱖魚人工繁育取得成功以來，鱖魚養(yǎng)殖業(yè)呈逐漸上升的趨勢，養(yǎng)殖30多年來經(jīng)久不衰，目前全國鱖魚產(chǎn)業(yè)規(guī)模年產(chǎn)值已達500億元以上，在淡水名優(yōu)魚類中占有非常獨特的地位。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)與農(nóng)業(yè)一樣，優(yōu)良的品種對于養(yǎng)殖產(chǎn)量的高低起著非常重要的作用。作為我國的一個重要的淡水名優(yōu)經(jīng)濟魚類，鱖人工繁殖技術(shù)的解決及完善為大規(guī)模養(yǎng)殖創(chuàng)造了條件。通過對鱖進行馴化、試養(yǎng)和人工繁殖，目前已經(jīng)建立了一套完整的生產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)。但是全國目前所養(yǎng)殖的鱖極度缺乏優(yōu)良品種，繁殖親本主要來自長江等水系捕撈的野生鱖或經(jīng)過數(shù)代人工養(yǎng)殖的鱖，野生種質(zhì)資源卻越來越難得獲??；另外隨著鱖養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模擴大，養(yǎng)殖密度也是不斷提高，水域生態(tài)壞境不斷的遭到人為的破壞，導(dǎo)致鱖疾病呈爆發(fā)之勢，養(yǎng)殖過程中所面臨的問題如雜合度下降、遺傳多樣性降低、生長慢、抗病差等問題也日益嚴(yán)重。此外子代生長速度較慢、抗病力弱、馴食能力差、種質(zhì)資源退化、適應(yīng)集約化養(yǎng)殖能力較弱等問題嚴(yán)重制約了鱖養(yǎng)殖養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，使得湖北水產(chǎn)界做大做強鱖產(chǎn)業(yè)的愿望進展較慢。與世界發(fā)達國家相比，我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)在技術(shù)水平發(fā)展上還處于一個較低的階段，尤其是在當(dāng)今全球化的背景下仍然面臨著非常多的科技問題的困擾，其中經(jīng)過遺傳改良具有“高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)”性狀的優(yōu)良品種的缺失則是重大問題之一。因此，為保證水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康穩(wěn)定的發(fā)展，需要將現(xiàn)代先進育種技術(shù)理論應(yīng)用到實踐當(dāng) 中去，大力開展和開發(fā)名貴經(jīng)濟水產(chǎn)品的人工繁育和養(yǎng)殖。國內(nèi)外的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)驗已證實，在同等條件下使用優(yōu)良品種比使用普通品種的增產(chǎn)效果可達10％-30％甚至更高。因此開展遺傳育種研究，培育生長速度快、抗病力強等經(jīng)濟性狀好的鱖優(yōu)良品種(系)對于保護鱖自然資源和滿足當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)的迫切需要具有極其重要的現(xiàn)實意義。

傳統(tǒng)水產(chǎn)動物良種選育過程，采用不斷近交的方式構(gòu)建純系至少需要經(jīng)過連續(xù)2O代的全同胞交配，這對于魚類育種來說，具有耗時長、成本高等問題。

人工雌核發(fā)育是一種較為特殊的有性生殖方式，即卵子經(jīng)遺傳物質(zhì)失活的精子激發(fā)產(chǎn)生只具有母系遺傳物質(zhì)的個體的有性生殖方式，經(jīng)此技術(shù)誘導(dǎo)的個體是可以存活并且可育的，其遺傳物質(zhì)與母本完全相同；且卵核的遺傳成分決定雌核發(fā)育個體的性別，如親本是雌性同配(即類似于XX/XY型性別決定，大部分魚類都屬于此類)，那么由其雌核發(fā)育而來的后代全部都是雌性。人工雌核發(fā)育技術(shù)在水產(chǎn)動物育種工作中相比其他育種方法具有十分明顯的特點：它可進行性別控制，其后代全為單性；還可以快速的建立純系，加速良種選育的過程，提高良種選育效率。20世紀(jì)70年代，我國開始進行人工雌核發(fā)育技術(shù)研究，且已經(jīng)成功應(yīng)用于鯉(Cyprinus carpio)、虹鱒(Salmo gairdneri)等近30種經(jīng)濟魚類。這些通過人工雌核發(fā)育技術(shù)進行提純復(fù)壯，獲得具有優(yōu)良養(yǎng)殖性能的新品種或選育出全雌單性苗種，進而對品種進行優(yōu)化，在魚類育種中具有重要意義，是魚類遺傳改良的主要發(fā)展方向之一。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種異源精子誘導(dǎo)翹嘴鱖人工雌核發(fā)育的方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種異源精子誘導(dǎo)翹嘴鱖人工雌核發(fā)育的方法，其主要步驟如下：

S1：冷凍保存斑鱖異源精子：采用Hanks冷凍稀釋液對斑鱖精子進行冷凍低溫(-24℃)保存，保存期為24h。解凍時，將冷凍精液管在25℃水浴中解凍備用；

S2：班鱖精子的遺傳失活：解凍后的斑鱖精液，按1：4的比例經(jīng)Hanks冷凍液稀釋后放入一個直徑10cm的培養(yǎng)皿中，在冰盒上手動搖勻后連同冰盒一起 放置在水平搖床上，然后用兩根15W UV紫外照射管充分照射25分鐘，照射距離17cm；照射后，將滅活的精液虹吸至一個5mL的Ep管中，放入冰盒中保存；

S3：獲得翹嘴鱖的卵子：2齡以上的性成熟雌魚通過注射外源催產(chǎn)激素發(fā)情后，采用干法將卵子擠入干燥的器皿中，放入冰盒中保存；

S4：啟動卵子雌核發(fā)育：將S2得到的遺傳失活的翹嘴鱖精子與S3得到的翹嘴鱖成熟卵子搖勻混合受精，受精時間30s；

S5：卵子單倍體染色體組加倍：受精后，轉(zhuǎn)移到淡水中進行冷休克處理，水溫4℃，時間約20～25min，得到二倍體卵；

S6：將S5所得到的二倍體卵轉(zhuǎn)入方形孵化槽中孵化，水溫25℃，按普通翹嘴鱖苗培育方法管理，得到翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體魚苗，二倍體雌核發(fā)育魚苗的誘導(dǎo)率為10～25％；

S7：用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定雌核發(fā)育魚苗。

作為本發(fā)明進一步的方案：所述S1中Hanks冷凍稀釋液由以下原料配制而成：KCL 0.4g,NaCL 8.00g，NaHCO3 0.35g，KH2PO4 0.06g，Na2HPO4·7H2O0.09g,Na2HPO4·12H2O 0.10g,MgSO4·7H2O 0.10g,MgCL2·6H2O 0.10g,CaCL2 0.14g,Glucose 1.00g；加蒸餾水配至1升。

作為本發(fā)明再進一步的方案：所述S2中紫外照射管照射強度為3396μW(cm3·s)。

作為本發(fā)明再進一步的方案：所述S3中外源催產(chǎn)激素由以下原料在23℃～27℃的溫度條件下混合而成：促黃體素釋放激素類似物(LRH-A2)4μg/Kg～6μg/Kg和絨毛膜促性腺激素(HCG)800IU/Kg～1200IU/Kg。

作為本發(fā)明再進一步的方案：所述S5中冷休克處理起始時間是在卵子受精后2-3min。

作為本發(fā)明再進一步的方案：所述S5中冷休克處理時間為25min。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明通過一套完整的異源精子誘導(dǎo)方法產(chǎn)生翹嘴鱖雌核發(fā)育苗種，經(jīng)過養(yǎng)殖過程逐步淘汰雌核發(fā)育后代中的劣勢個體，得到了全部為雌性的優(yōu)勢翹嘴鱖群體。一代翹嘴鱖雌核發(fā)育的近交效果大致相當(dāng)于6-7代的全同胞家系的近交效果，這為建立翹嘴鱖純系，快速優(yōu)化和固定翹嘴鱖優(yōu)良性狀的基因提供了快速的技術(shù) 方法。翹嘴鱖的雌性比雄性生長快約20％，因此養(yǎng)殖全雌性的鱖群體的經(jīng)濟效益非常顯著。本發(fā)明為今后建立高效生產(chǎn)全雌鱖苗種的成套生產(chǎn)技術(shù)提供了重要的基礎(chǔ)，具有很好的遺傳育種價值和推廣應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為雌核發(fā)育鱖。

圖2為普通翹嘴鱖(♀)。

圖3為斑鱖(♂)。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細地說明。

一種異源精子誘導(dǎo)翹嘴鱖人工雌核發(fā)育的方法，其主要步驟如下：

S1：冷凍保存斑鱖異源精子：采用Hanks冷凍稀釋液對斑鱖精子進行冷凍低溫(-24℃)保存，保存期為24h。解凍時，將冷凍精液管在25℃水浴中解凍備用；所述Hanks冷凍稀釋液由以下原料配制而成：KCL 0.4g,NaCL 8.00g，NaHCO3 0.35g，KH2PO4 0.06g，Na2HPO4·7H2O 0.09g,Na2HPO4·12H2O0.10g,MgSO4·7H2O 0.10g,MgCL2·6H2O 0.10g,CaCL2 0.14g,Glucose 1.00g；加蒸餾水配至1升；

S2：班鱖精子的遺傳失活：解凍后的斑鱖精液，按1：4的比例經(jīng)Hanks冷凍液稀釋后放入一個直徑10cm的培養(yǎng)皿中，在冰盒上手動搖勻后連同冰盒一起放置在水平搖床上，然后用兩根15W UV紫外照射管充分照射25分鐘，照射距離17cm；照射后，將滅活的精液虹吸至一個5mL的Ep管中，放入冰盒中保存；所述紫外照射管照射強度為3396μW(cm3·s)；

S3：獲得翹嘴鱖的卵子：2齡以上的性成熟雌魚通過注射外源催產(chǎn)激素發(fā)情后，采用干法將卵子擠入干燥的器皿中，放入冰盒中保存；所述外源催產(chǎn)激素由以下原料在23℃～27℃的溫度條件下混合而成：促黃體素釋放激素類似物(LRH-A2)4μg/Kg～6μg/Kg和絨毛膜促性腺激素(HCG)800IU/Kg～1200IU/Kg；

S4：啟動卵子雌核發(fā)育：將S2得到的遺傳失活的翹嘴鱖精子與S3得到的翹嘴鱖成熟卵子搖勻混合受精，受精時間30s；

S5：卵子單倍體染色體組加倍：受精后，轉(zhuǎn)移到淡水中進行冷休克處理，水溫4℃，時間約20～25min，得到二倍體卵；所述冷休克處理起始時間是在卵 子受精后2-3min；

S6：將S5所得到的二倍體卵轉(zhuǎn)入方形孵化槽中孵化，水溫25℃，按普通翹嘴鱖苗培育方法管理，得到翹嘴鱖雌核發(fā)育二倍體魚苗，二倍體雌核發(fā)育魚苗的誘導(dǎo)率為10～25％；

S7：用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定雌核發(fā)育魚苗：

將雌核發(fā)育后代進行PIT電子標(biāo)記，取少量尾鰭置于無水乙醇中保存?zhèn)溆谩?/p>

(1)基因組DNA提取

采用試劑盒法提取基因組DNA，取選取約0.1g翹嘴鱖鰭條組織放入1.5mL Eppendorf管中，加入蒸餾水浸泡1-2h，待酒精充分置換后用剪刀將其剪碎。

向Eppendorf管中加500μL Nucle Lysis Solution及17.5μL 20mg/uL蛋白酶K，充分混勻后于5℃水浴中至組織完全消化。消化期間每隔10min搖晃Eppendorf管以加快消化速度。待組織消化后放入4℃冷凍離心機中，10000rpm/min離心10min。用剪口的槍頭輕輕吸取上清液，轉(zhuǎn)入新的Eppendorf管中。加入200ul Protein Precrpitation Solution快速顛倒，置于冰上10min，然后放入4℃冷凍離心機中，10000rpm/min離心10min。用剪口的槍頭輕輕吸取上清液，轉(zhuǎn)入新的Eppendorf管中。向上清液中加入600μL的-20℃預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒，10000rpm/min離心10min，棄上清，沉淀DNA。沉淀的DNA用吸頭挑出并轉(zhuǎn)入新的Eppendorf管中，然后用70％的酒精洗滌兩次，放置在室溫下晾干。用300μL TE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH＝8.0)溶解沉淀DNA，置-20℃儲存?zhèn)溆谩?％瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，分光光度計檢測DNA純度和濃度，-20℃保存。

(2)微衛(wèi)星標(biāo)記PCR擴增及檢測

利用6對高度多態(tài)的翹嘴鱖微衛(wèi)星標(biāo)記合成熒光引物(FAM和HEX)，在各自特定的退火溫度下進行PCR擴增，PCR擴增體系和反應(yīng)程序如下，PCR反應(yīng)體系為25μL：Taq DNA聚合酶0.5μL(1U/μL)，10×Taq Buffer 2.5μL，MgCl₂2.5μL，dNTP 0.5μL，上下游引物各0.5μL(10μmol/L)，DNA 100ng。擴增程序為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，退火40s(最適退火溫度見表1)，72℃延伸45s，38個循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物后送北京天一輝遠公司，利用毛細管電泳方法測試獲得微衛(wèi)星位點的基因型。

表1微衛(wèi)星引物基本信息(只有14個引物編碼)

Tab.1The basic information of the primer

(3)數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)自動測序儀ABI Prism3730xl(Rox-500standard)測序并用軟件GENEMAPPER V.4.0讀取等位基因大小。利用軟件Cervus 2.0分析各個基因座上的等位基因頻率、觀測雜合度Ho和期望雜合度He、多態(tài)信息含量PIC、非親權(quán)排除率(NEP)和累計非親權(quán)排除率(CEP)，檢測微衛(wèi)星位點是否符合Hardy-Weinberg平衡及各位點無效等位基因頻率，再以父母本雙盲建模(simulation)模擬運行10000次得到Delta分布值，以每個候選父母的LOD值進行親權(quán)鑒定分析。

(4)利用6個高度多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記對三次雌核發(fā)育鱖親本和子代進行遺傳分析(第一批雌核發(fā)育親本雌魚4尾，親本雄魚4尾，子代隨機取樣35尾；第二批雌核發(fā)育親本雌魚15尾，親本雄魚1尾，子代隨機取樣100尾；第三批雌核發(fā)育親本雌魚8尾，親本雄魚2尾，子代隨機取樣26尾)，結(jié)果顯示：

第一批雌核發(fā)育鱖魚子代35尾中有20尾父母本正常交配產(chǎn)生的后代(表2)，15尾雌核發(fā)育后代個體，沒有父本基因，雌核發(fā)育后代占子代個體43％；

第二批雌核發(fā)育子代100尾中有2尾為父母本正常交配產(chǎn)生后代(表3)，98尾雌核發(fā)育后代個體，沒有父本基因，雌核發(fā)育后代占98％；

第三批雌核發(fā)育鱖魚36尾中有5尾為父母本正常交配產(chǎn)生后代(表4)，31尾雌核發(fā)育后代個體，沒有父本基因，雌核發(fā)育后代占86％。

這些利用分子生物學(xué)方法所進行的親子鑒定的證據(jù)表明，翹嘴鱖雌核發(fā)育個體的遺傳物質(zhì)完全來自母本翹嘴鱖，在“受精”中提供失活精子的斑鱖對雌核發(fā)育子代沒有遺傳貢獻。

表2第一批雌核發(fā)育父母本正常交配鱖后代父本編號及LOD值

表3第二批雌核發(fā)育父母本正常交配鱖后代父本編號及LOD值

表4第三批雌核發(fā)育父母本正常交配鱖后代父本編號及LOD值

(5)翹嘴鱖雌核發(fā)育子代的形態(tài)分析

經(jīng)過6個月養(yǎng)殖，對雌核發(fā)育發(fā)育翹嘴鱖的形態(tài)特征進行了分析。隨機取樣50尾，測量結(jié)果顯示，平均體重為750克，生長速度較普通翹嘴鱖快，全年沒有發(fā)生任何病害，顯示抗病能力強。翹嘴鱖雌核發(fā)育所有子代(圖1)的形態(tài)特征都與母本翹嘴鱖相同(圖2)，與提供異源精子的斑鱖完全不同(圖2)，這進一步證實利用本方法所獲得的雌核發(fā)育鱖的遺傳物質(zhì)來源于翹嘴鱖。

上面對本發(fā)明的較佳實施方式作了詳細說明，但是本發(fā)明并不限于上述實施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識范圍內(nèi)，還可以在不脫離本發(fā)明宗旨的前提下作出各種變化。