本發(fā)明涉及睪丸組織冷凍保存，更詳細(xì)地說，本發(fā)明涉及寵物睪丸組織凍存與復(fù)蘇試劑以及寵物睪丸組織凍存與復(fù)蘇方法。
背景技術(shù)：
：寵物(主要指作為伴侶動(dòng)物的狗和貓)能夠陪伴人類，緩解日常生活中的壓力，愉悅心情，促進(jìn)人類健康，成為家庭中的一員。隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、老齡化程度的加重，對(duì)寵物的需求越來越大。寵物數(shù)量增加的同時(shí)，寵物食品、寵物用品、寵物培訓(xùn)等產(chǎn)業(yè)得到了蓬勃的發(fā)展。寵物健康領(lǐng)域并沒有受到足夠的關(guān)注，也尚未形成規(guī)范。相比人類健康市場(chǎng)，寵物健康市場(chǎng)有很大的空間尚待挖掘。關(guān)愛寵物，關(guān)注寵物健康。國內(nèi)外一般推薦寵物在6到8月齡時(shí)進(jìn)行絕育或去勢(shì)手術(shù)。主要優(yōu)點(diǎn)包括避免很多與生殖激素相關(guān)疾病的發(fā)生，節(jié)省寵物主人在寵物生殖方面的時(shí)間花費(fèi)，控制群體數(shù)量。寵物的去勢(shì)是指雄性寵物的睪丸及其附屬組織摘除術(shù)。對(duì)于寵物個(gè)體而言，去勢(shì)手術(shù)可以降低雄性寵物發(fā)生前列腺增生和感染的機(jī)率，減少會(huì)陰疝的發(fā)生率。然而，切除睪丸之后，目前都將睪丸組織丟棄，寵物不僅喪失了生殖能力，體內(nèi)的激素水平也遭到了破壞。長(zhǎng)期的激素水平失調(diào)會(huì)造成寵物精神狀態(tài)萎靡、行為異常，隨著年齡的增長(zhǎng)往往導(dǎo)致肥胖等代謝疾病。寵物的運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)發(fā)育也會(huì)受到影響，關(guān)節(jié)韌帶發(fā)育不良，骨質(zhì)疏松等發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高，還會(huì)增加骨肉瘤的發(fā)生率。目前的處理方式無法給寵物二次選擇的機(jī)會(huì)，絕育就意味著喪失生殖力與破壞激素水平。相比人類健康領(lǐng)域，睪丸組織凍存技術(shù)、精原細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化技術(shù)和睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)在不斷發(fā)展。理想的方式是通過凍存技術(shù)保存生殖力，在必要的時(shí)候可選擇性的體外分化出精子來恢復(fù)生殖力，擴(kuò)增間質(zhì)細(xì)胞可用于自體回輸恢復(fù)激素水平。寵物健康領(lǐng)域此類凍存技術(shù)尚沒有得到開發(fā)和應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種快速高效的寵物睪丸組織凍存與復(fù)蘇試劑以及凍存與復(fù)蘇方法。用于解決上述技術(shù)問題的方案本發(fā)明包含寵物睪丸組織凍存試劑和寵物睪丸組織復(fù)蘇試劑，成分明確穩(wěn)定，保質(zhì)期長(zhǎng)，制備后可直接應(yīng)用于寵物睪丸組織的凍存和復(fù)蘇，使用方便，組織復(fù)蘇活性高。本發(fā)明依托組織玻璃化凍存(快速凍存，直接從常溫進(jìn)入液氮)理論技術(shù)，凍存試劑中聯(lián)合使用兩種低溫保護(hù)劑二甲基亞砜(DMSO)、丙二醇(PROH)，提高玻璃化效率的同時(shí)減低保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的毒性。首次將枸杞多糖(LBP)用于組織玻璃化凍存，在寵物睪丸組織凍存中效果遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)的蔗糖(SUC)；針對(duì)睪丸組織特性，凍存和復(fù)蘇試劑中均添加膽固醇(CHO)，較大程度的保護(hù)了睪丸組織中精原細(xì)胞和精子的活性。本發(fā)明的第一方面，提供了寵物睪丸組織凍存試劑組。所述寵物睪丸組織凍存試劑組包括：(1)凍存試劑1：枸杞多糖2～7W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，二甲基亞砜6～14V/V％，丙二醇2～7V/V％，MEM培養(yǎng)基80～90V/V％；(2)凍存試劑2：枸杞多糖8～10W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，二甲基亞砜6～20V/V％，丙二醇5～15V/V％，MEM培養(yǎng)基70～80V/V％；(3)凍存試劑3：枸杞多糖15～20W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，二甲基亞砜6～20V/V％，丙二醇5～15V/V％，MEM培養(yǎng)基70～80V/V％。較優(yōu)的，所述凍存試劑組包括：(1)凍存試劑1：枸杞多糖2～7W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，二甲基亞砜6～14V/V％，丙二醇2～7V/V％，MEM培養(yǎng)基80～90V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％；(2)凍存試劑2：枸杞多糖8～10W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，二甲基亞砜6～20V/V％，丙二醇5～15V/V％，MEM培養(yǎng)基70～80V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％；(3)凍存試劑3：枸杞多糖15～20W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，二甲基亞砜6～20V/V％，丙二醇5～15V/V％，MEM培養(yǎng)基70～80V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％。較優(yōu)的，所述凍存試劑組包括：(1)凍存試劑1：枸杞多糖6W/V％，膽固醇2.5W/V％，二甲基亞砜10V/V％，丙二醇5V/V％，MEM培養(yǎng)基85V/V％；(2)凍存試劑2：枸杞多糖9W/V％，膽固醇2.5W/V％，二甲基亞砜12V/V％，丙二醇13V/V％，MEM培養(yǎng)基75V/V％；(3)凍存試劑3：枸杞多糖18W/V％，膽固醇2.5W/V％，二甲基亞砜12V/V％，丙二醇13V/V％，MEM培養(yǎng)基75V/V％。更優(yōu)的，所述凍存試劑組包括：(1)凍存試劑1：枸杞多糖6W/V％，膽固醇2.5W/V％，二甲基亞砜10V/V％，丙二醇5V/V％，MEM培養(yǎng)基85V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％；(2)凍存試劑2：枸杞多糖9W/V％，膽固醇2.5W/V％，二甲基亞砜12V/V％，丙二醇13V/V％，MEM培養(yǎng)基75V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％；(3)凍存試劑3：枸杞多糖18W/V％，膽固醇2.5W/V％，二甲基亞砜12V/V％，丙二醇13V/V％，MEM培養(yǎng)基75V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％。本發(fā)明的第二方面，提供了寵物睪丸組織復(fù)蘇試劑組，所述復(fù)蘇試劑組包括：(1)復(fù)蘇試劑1：枸杞多糖35～55W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，維生素E0.05～0.35V/V％，MEM培養(yǎng)基99.65～99.95V/V％；(2)復(fù)蘇試劑2：枸杞多糖25～45W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，維生素E0.05～0.35V/V％，MEM培養(yǎng)基99.65～99.95V/V％；(3)復(fù)蘇試劑3：枸杞多糖15～35W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，維生素E0.05～0.35V/V％，MEM培養(yǎng)基99.65～99.95V/V％；(4)復(fù)蘇試劑4：枸杞多糖5～25W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，維生素E0.05～0.35V/V％，MEM培養(yǎng)基99.65～99.95V/V％。較優(yōu)的，所述復(fù)蘇試劑組包括：(1)復(fù)蘇試劑1：枸杞多糖35～55W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，維生素E0.05～0.35V/V％，MEM培養(yǎng)基99.65～99.95V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％；(2)復(fù)蘇試劑2：枸杞多糖25～45W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，維生素E0.05～0.35V/V％，MEM培養(yǎng)基99.65～99.95V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％；(3)復(fù)蘇試劑3：枸杞多糖15～35W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，維生素E0.05～0.35V/V％，MEM培養(yǎng)基99.65～99.95V/V％，葡萄糖1～10W/V％；(4)復(fù)蘇試劑4：枸杞多糖5～25W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，維生素E0.05～0.35V/V％，MEM培養(yǎng)基99.65～99.95V/V％，葡萄糖1～10W/V％。較優(yōu)的，所述復(fù)蘇試劑組包括：(1)復(fù)蘇試劑1：枸杞多糖40W/V％，膽固醇2.5W/V％，維生素E0.2V/V％，MEM培養(yǎng)基99.8％；(2)復(fù)蘇試劑2：枸杞多糖30W/V％，膽固醇2.5W/V％，維生素E0.2V/V％，MEM培養(yǎng)基99.8％；(3)復(fù)蘇試劑3：枸杞多糖20W/V％，膽固醇2.5W/V％，維生素E0.2V/V％，MEM培養(yǎng)基99.8％；(4)復(fù)蘇試劑4：枸杞多糖10W/V％，膽固醇2.5W/V％，維生素E0.2V/V％，MEM培養(yǎng)基99.8％。更優(yōu)的，所述復(fù)蘇試劑組包括：(1)復(fù)蘇試劑1：枸杞多糖40W/V％，膽固醇2.5W/V％，維生素E0.2V/V％，MEM培養(yǎng)基99.8％，聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％；(2)復(fù)蘇試劑2：枸杞多糖30W/V％，膽固醇2.5W/V％，維生素E0.2V/V％，MEM培養(yǎng)基99.8％，聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％；(3)復(fù)蘇試劑3：枸杞多糖20W/V％，膽固醇2.5W/V％，維生素E0.2V/V％，MEM培養(yǎng)基99.8％，葡萄糖5W/V％；(4)復(fù)蘇試劑4：枸杞多糖10W/V％，膽固醇2.5W/V％，維生素E0.2V/V％，MEM培養(yǎng)基99.8％，葡萄糖5W/V％。本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供一種寵物睪丸組織凍存復(fù)蘇試劑套裝，包括上述第一方面的凍存試劑組和第二方面的復(fù)蘇試劑組。本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供一種寵物睪丸組織凍存方法，包括：將離體寵物睪丸組織依次浸入上述第一方面的凍存試劑1、凍存試劑2、凍存試劑3中保持5分鐘以上之后，液氮存儲(chǔ)。本發(fā)明的第五個(gè)方面是提供一種寵物睪丸組織復(fù)蘇方法，包括：將經(jīng)凍存的離體寵物睪丸組織依次浸入上述第二方面的復(fù)蘇試劑1、復(fù)蘇試劑2中，在37±2℃各保持2分鐘以上，之后，移入上述第二方面的復(fù)蘇試劑3、復(fù)蘇試劑4中，室溫下各保持10分鐘以上。發(fā)明效果本發(fā)明的凍存復(fù)蘇試劑組可以使寵物睪丸組織短期(約一周)凍存、復(fù)蘇的活率達(dá)到80％以上，長(zhǎng)期(約三年)凍存、復(fù)蘇的活率達(dá)到55％以上，能夠很好的冷凍保存生殖力，給寵物二次選擇的機(jī)會(huì)。發(fā)明人首次將枸杞多糖引入凍存領(lǐng)域，首次將維生素E引入復(fù)蘇試劑，取得了非常顯著的效果。此外，針對(duì)精原細(xì)胞和精子中含有豐富的膽固醇的生理情況，在凍存液和復(fù)蘇液中加入膽固醇防止細(xì)胞內(nèi)的膽固醇丟失而影響細(xì)胞活性。三種物質(zhì)協(xié)同作用，取得了針對(duì)寵物睪丸組織凍存、復(fù)蘇的非常顯著的協(xié)同效果。本發(fā)明試劑成分明確，制備方便，利于大規(guī)模生產(chǎn)。一直以來，組織玻璃化凍存領(lǐng)域重點(diǎn)在于針對(duì)不同的細(xì)胞和組織，尋找毒性較小的玻璃化溶液配比方案及提高降、復(fù)溫速率的方法。本發(fā)明中通過聯(lián)用兩種細(xì)胞保護(hù)劑二甲基亞砜和丙二醇，在保證效果的同時(shí)控制細(xì)胞保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞造成的毒性。本發(fā)明凍存試劑組包含3種試劑，復(fù)蘇試劑組包含4種試劑，梯度化升高和降低枸杞多糖的濃度較一步法效果優(yōu)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1-5：寵物睪丸組織凍存試劑的制備(1)以100ml凍存試劑1制備為例：分別按照表1所示的量，量取二甲基亞砜(購自SIGMA)、丙二醇(購自SIGMA)、MEM培養(yǎng)基(購自GIBCO)放入250ml藍(lán)口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻；稱取枸杞多糖(購自斯諾特生物)、膽固醇(購自SIGMA)、聚乙烯吡咯烷酮((簡(jiǎn)稱PVP)購自SIGMA)、葡萄糖(購自SIGMA)加入上述瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經(jīng)過高壓滅菌的100ml藍(lán)口瓶(購自蜀牛)，4℃保存?zhèn)溆茫?2)以100ml凍存試劑2制備為例：分別按照表1所示的量，量取二甲基亞砜(購自SIGMA)、丙二醇(購自SIGMA)、MEM培養(yǎng)基(購自GIBCO)放入250ml藍(lán)口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻；稱取枸杞多糖(購自斯諾特生物)、膽固醇(購自SIGMA)、聚乙烯吡咯烷酮(購自SIGMA)、葡萄糖(購自SIGMA)加入上述瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經(jīng)過高壓滅菌的100ml藍(lán)口瓶(購自蜀牛)，4℃保存?zhèn)溆茫?3)以100ml凍存試劑3制備為例：分別按照表1所示的量，量取二甲基亞砜(購自SIGMA)、丙二醇(購自SIGMA)、MEM培養(yǎng)基(購自GIBCO)放入250ml藍(lán)口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻；稱取枸杞多糖(購自斯諾特生物)、膽固醇(購自SIGMA)、聚乙烯吡咯烷酮(購自SIGMA)、葡萄糖(購自SIGMA)加入上述瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經(jīng)過高壓滅菌的100ml藍(lán)口瓶(購自蜀牛)，4℃保存?zhèn)溆谩１景l(fā)明的寵物睪丸組織凍存試劑組包括三種試劑，其中的枸杞多糖濃度依次增大。表1：凍存試劑的制備實(shí)施例6-10：寵物睪丸組織復(fù)蘇試劑的制備(1)以100ml復(fù)蘇試劑1制備為例：分別按照表2所示的量，量取維生素E(油狀液體，純度標(biāo)≥98％)(購自SIGMA)、MEM培養(yǎng)基(購自GIBCO)放入250ml藍(lán)口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻；稱取枸杞多糖(購自斯諾特生物)、膽固醇(購自SIGMA)、聚乙烯吡咯烷酮(購自SIGMA)、葡萄糖(購自SIGMA)加入上述瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經(jīng)過高壓滅菌的100ml藍(lán)口瓶(購自蜀牛)，4℃保存?zhèn)溆茫?2)以100ml復(fù)蘇試劑2制備為例：分別按照表2所示的量，量取維生素E(購自SIGMA)、MEM培養(yǎng)基(購自GIBCO)放入250ml藍(lán)口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻。稱取枸杞多糖(購自斯諾特生物)、膽固醇(購自SIGMA)、聚乙烯吡咯烷酮(購自SIGMA)、葡萄糖(購自SIGMA)加入上述瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經(jīng)過高壓滅菌的100ml藍(lán)口瓶(購自蜀牛)，4℃保存?zhèn)溆茫?3)以100ml復(fù)蘇試劑3制備為例：分別按照表2所示的量，量取維生素E(購自SIGMA)、MEM培養(yǎng)基(購自GIBCO)放入250ml藍(lán)口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻；稱取枸杞多糖(購自斯諾特生物)、膽固醇(購自SIGMA)、葡萄糖(購自SIGMA)加入上述瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經(jīng)過高壓滅菌的100ml藍(lán)口瓶(購自蜀牛)，4℃保存?zhèn)溆茫?4)以100ml復(fù)蘇試劑4制備為例：分別按照表2所示的量，量取維生素E(購自SIGMA)、MEM培養(yǎng)基(購自GIBCO)放入250ml藍(lán)口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻；稱取枸杞多糖(購自斯諾特生物)、膽固醇(購自SIGMA)、葡萄糖(購自SIGMA)加入上述瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經(jīng)過高壓滅菌的100ml藍(lán)口瓶(購自蜀牛)，4℃保存?zhèn)溆?。本發(fā)明的寵物睪丸組織復(fù)蘇試劑組包括四種試劑，其中的枸杞多糖濃度依次降低。表2：復(fù)蘇試劑的制備對(duì)照例對(duì)照A組：除了凍存和復(fù)蘇試劑中均去除膽固醇外，其他條件與實(shí)施例5和實(shí)施例10相同。對(duì)照B組：在實(shí)驗(yàn)對(duì)照A組基礎(chǔ)上將枸杞多糖換成等量的蔗糖，其他條件不變。對(duì)照C組：除了將凍存和復(fù)蘇試劑中的枸杞多糖換成等量的蔗糖外，其他條件與實(shí)施例5和實(shí)施例10相同。傳統(tǒng)對(duì)照組，采用文獻(xiàn)試劑和方法凍存，簡(jiǎn)述如下：凍存試劑包括95％DMEM培養(yǎng)基，5％DMSO；復(fù)蘇試劑為DMEM培養(yǎng)基，具體操作步驟見文獻(xiàn)(于潔,萬匯涓,尹美珺,等.冷凍保存未成熟睪丸組織移植后生精細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育[J].中國男科學(xué)雜志,2008,22(12):15-18.)。表3：對(duì)照A組對(duì)照B組對(duì)照C組凍存試劑1DMSO(ml)101010丙二醇(ml)555MEM培養(yǎng)基(ml)858585枸杞多糖/蔗糖(g)6(枸杞多糖)6(蔗糖)6(蔗糖)膽固醇(g)--2.5PVP(g)0.30.30.3葡萄糖(g)555凍存試劑2DMSO(ml)121212丙二醇(ml)131313MEM培養(yǎng)基(ml)757575枸杞多糖/蔗糖(g)9(枸杞多糖)9(蔗糖)9(蔗糖)膽固醇(g)--2.5PVP(g)0.30.30.3葡萄糖(g)555凍存試劑3DMSO(ml)121212丙二醇(ml)131313MEM培養(yǎng)基(ml)757575枸杞多糖/蔗糖(g)18(枸杞多糖)18(蔗糖)18(蔗糖)膽固醇(g)--2.5PVP(g)0.30.30.3葡萄糖(g)555復(fù)蘇試劑1維生素E(ml)0.20.20.2MEM培養(yǎng)基(ml)99.899.899.8枸杞多糖/蔗糖(g)40(枸杞多糖)40(蔗糖)40(蔗糖)膽固醇(g)--2.5PVP(g)0.30.30.3葡萄糖(g)555復(fù)蘇試劑2維生素E(ml)0.20.20.2MEM培養(yǎng)基(ml)99.899.899.8枸杞多糖/蔗糖(g)30(枸杞多糖)30(蔗糖)30(蔗糖)膽固醇(g)--2.5PVP(g)0.30.30.3葡萄糖(g)555復(fù)蘇試劑3維生素E(ml)0.20.20.2MEM培養(yǎng)基(ml)99.899.899.8枸杞多糖/蔗糖(g)20(枸杞多糖)20(蔗糖)20(蔗糖)膽固醇(g)--2.5PVP(g)---葡萄糖(g)555復(fù)蘇試劑4維生素E(ml)0.20.20.2MEM培養(yǎng)基(ml)99.899.899.8枸杞多糖/蔗糖(g)10(枸杞多糖)10(蔗糖)10(蔗糖)膽固醇(g)--2.5PVP(g)---葡萄糖(g)555效果試驗(yàn)：1.寵物睪丸組織凍存、復(fù)蘇試劑的短期效果驗(yàn)證(1)睪丸組織的獲取：在寵物主、寵物醫(yī)生知情同意的情況下，分別收集6～8月齡寵物狗進(jìn)行絕育手術(shù)時(shí)切除下來的睪丸組織。20分鐘內(nèi)，剔除多余的脂肪、筋膜，修剪成1～2cm厚度的組織片，浸泡在含有10％血清(購自GIBCO)的DMEM培養(yǎng)基(購自GIBCO)中，置于冰上。(2)睪丸組織的切片：用手術(shù)刀片將睪丸組織片進(jìn)一步修剪，厚度控制在0.8～1.2mm，長(zhǎng)度控制在5～10mm，寬度控制在2～5mm。修剪操作全程在10％血清DMEM中冰上操作，于30分鐘內(nèi)完成。預(yù)留部分組織切片不進(jìn)行后續(xù)的凍存復(fù)蘇操作，用作為后續(xù)對(duì)照試驗(yàn)的未凍存組織切片(以下簡(jiǎn)稱“新鮮對(duì)照組”)。(3)睪丸組織的凍存與復(fù)蘇：隨機(jī)取出(2)中的睪丸組織切片3片，使用無菌紗布吸干凈多余水分。將組織切片浸入實(shí)施例1的凍存試劑1中，常溫10分鐘。組織切片取出后，繼續(xù)使用無菌紗布吸干凈多余水分，移入凍存試劑2中，常溫20分鐘。同樣的操作移入凍存試劑3中，常溫30分鐘。取出組織切片，放置于金屬銅網(wǎng)條上，使用無菌紗布吸干凈多余水分。立即投入事先準(zhǔn)備好的無菌液氮中，5分鐘后即可將組織切片連同銅網(wǎng)條轉(zhuǎn)入事先預(yù)冷的凍存管中，液氮存儲(chǔ)。1周后，準(zhǔn)備復(fù)蘇凍存組織，37℃水浴箱預(yù)熱實(shí)施例6的復(fù)蘇試劑1、復(fù)蘇試劑2。液氮中取出組織切片連同銅網(wǎng)條迅速置入復(fù)蘇試劑1中，輕搖，37℃2分鐘，可見組織切片從銅網(wǎng)條上脫落，將組織切片移入復(fù)蘇試劑2中，37℃5分鐘。然后依次將組織切片移入復(fù)蘇試劑3、復(fù)蘇試劑4中，室溫各10分鐘(簡(jiǎn)稱為實(shí)施例1+6)。同樣的條件下進(jìn)行實(shí)施例2+7、實(shí)施例3+8、實(shí)施例4+9、實(shí)施例5+10、對(duì)照A組、對(duì)照B組、對(duì)照C組、傳統(tǒng)對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)。(4)組織培養(yǎng)上清睪酮檢測(cè)及組織活性O(shè)D值：將(3)中各實(shí)施例、對(duì)照組以及(2)中的新鮮對(duì)照組的組織切片分別置入細(xì)胞培養(yǎng)6孔板1個(gè)孔中培養(yǎng)，2ml10％DMEM培養(yǎng)基，37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。收取500ul上清，使用睪酮ELISA檢測(cè)試劑盒(購自CAYMAN)檢測(cè)睪丸組織睪酮分泌量。組織切片剪成1mmX2mmX2mm大小，置入96孔板1個(gè)孔中，加入100ul10％DMEM培養(yǎng)基，每孔加入10ul增強(qiáng)型CCK-8溶液(購自碧云天)，37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)。使用多功能酶標(biāo)儀，選取450nm波長(zhǎng)，讀取OD值。各實(shí)驗(yàn)分別重復(fù)三次，取平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，表4反映凍存1周后復(fù)蘇組織睪酮分泌功能情況以及短期凍存復(fù)蘇后組織活性O(shè)D值。無論上清睪酮分泌情況還是組織活性O(shè)D值，實(shí)施例凍存復(fù)蘇后的結(jié)果都接近新鮮對(duì)照組，并且各實(shí)施例結(jié)果均優(yōu)于對(duì)照A組、對(duì)照B組、對(duì)照C組以及傳統(tǒng)對(duì)照組，說明本發(fā)明的枸杞多糖、膽固醇、維生素E協(xié)同作用，對(duì)凍存復(fù)蘇活率的提高具有顯著效果。表4：凍存、復(fù)蘇試劑的短期效果注：實(shí)施例1+6表示實(shí)施例1的凍存試劑+實(shí)施例6的復(fù)蘇試劑組合使用，下同。此外，本發(fā)明采用同樣的方法收集6～8月齡寵物貓進(jìn)行絕育手術(shù)時(shí)切除下來的睪丸組織，進(jìn)行了上述(1)-(4)的凍存和復(fù)蘇試驗(yàn)，冷凍試劑為實(shí)施例5，復(fù)蘇試劑為實(shí)施例10，結(jié)果顯示睪酮分泌量位12.1nmol/L，組織活性O(shè)D值為1.61。2.寵物睪丸組織凍存、復(fù)蘇試劑的長(zhǎng)期效果驗(yàn)證(1)睪丸組織的獲?。涸趯櫸镏?、寵物醫(yī)生知情同意的情況下，分別收集6～8月齡寵物狗進(jìn)行絕育手術(shù)時(shí)切除下來的睪丸組織。20分鐘內(nèi)，剔除多余的脂肪、筋膜，修剪成1～2cm厚度的組織片，浸泡在含有10％血清(購自GIBCO)的DMEM培養(yǎng)基(購自GIBCO)中，置于冰上。(2)睪丸組織的切片：用手術(shù)刀片將睪丸組織片進(jìn)一步修剪，厚度控制在0.8～1.2mm，長(zhǎng)度控制在5～10mm，寬度控制在2～5mm。修剪操作全程在10％血清DMEM中冰上操作，于30分鐘內(nèi)完成。(3)睪丸組織的凍存與復(fù)蘇：取出(2)中的睪丸組織切片18片，隨機(jī)分成6組，每組3片，使用無菌紗布吸干凈多余水分。取5組組織切片分別浸入5組實(shí)施例的凍存試劑1中，常溫10分鐘。組織切片取出后，繼續(xù)使用無菌紗布吸干凈多余水分，移入凍存試劑2中，常溫20分鐘。同樣的操作移入凍存試劑3中，常溫30分鐘。取出組織切片，放置于金屬銅網(wǎng)條上，使用無菌紗布吸干凈多余水分。立即投入事先準(zhǔn)備好的無菌液氮中，5分鐘后即可將組織切片連同銅網(wǎng)條轉(zhuǎn)入事先預(yù)冷的凍存管中，液氮存儲(chǔ)。設(shè)置不同的時(shí)間點(diǎn)復(fù)蘇組織，時(shí)間點(diǎn)設(shè)置為0.5年、1年、2年、3年。準(zhǔn)備復(fù)蘇凍存組織時(shí)，37℃水浴箱預(yù)熱復(fù)蘇試劑1、復(fù)蘇試劑2。液氮中取出組織片連同銅網(wǎng)條迅速置入復(fù)蘇試劑1中，輕搖，37℃2分鐘，可見組織切片從銅網(wǎng)條上脫落，將組織片切移入復(fù)蘇試劑2中，37℃5分鐘。然后依次將組織切片移入復(fù)蘇試劑3、復(fù)蘇試劑4中，室溫各10分鐘。取1組組織切片進(jìn)行傳統(tǒng)對(duì)照組的試驗(yàn)，采用文獻(xiàn)試劑和方法凍存，簡(jiǎn)述如下：凍存試劑包括95％DMEM培養(yǎng)基，5％DMSO；復(fù)蘇試劑為DMEM培養(yǎng)基，具體操作步驟見文獻(xiàn)(于潔,萬匯涓,尹美珺,等.冷凍保存未成熟睪丸組織移植后生精細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育[J].中國男科學(xué)雜志,2008,22(12):15-18.)。(4)組織培養(yǎng)上清睪酮檢測(cè)及組織活性O(shè)D值：將各實(shí)施例和傳統(tǒng)對(duì)照組的組織切片分別置入細(xì)胞培養(yǎng)6孔板1個(gè)孔中培養(yǎng)，2ml10％DMEM培養(yǎng)基，37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。收取500ul上清，使用睪酮ELISA檢測(cè)試劑盒(購自CAYMAN)檢測(cè)睪丸組織睪酮分泌量。組織切片剪成1mm×2mm×2mm大小，置入96孔板1個(gè)孔中加入100ul10％DMEM培養(yǎng)基，每孔加入10ul增強(qiáng)型CCK-8溶液(購自碧云天)，37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)。使用多功能酶標(biāo)儀，選取450nm波長(zhǎng)，讀取OD值。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)設(shè)置3個(gè)組織樣品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示，表5反映凍存0.5、1、2、3年后復(fù)蘇組織睪酮分泌功能情況以及長(zhǎng)期凍存復(fù)蘇后組織活性O(shè)D值。由表5可知本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組效果在長(zhǎng)期保存條件下遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)對(duì)照組，組織存儲(chǔ)于液氮后保存效果較為穩(wěn)定。表5：凍存、復(fù)蘇試劑的長(zhǎng)期效果以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3