本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)及栽培技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種葵花組培育苗方法。

背景技術(shù)：

向日葵(helianthusanuusl.)是菊科(compositae)向日葵屬(helianthus)栽培種,起源于北美西南部，向日葵大約在16世紀(jì)末或17世紀(jì)初傳入我國(guó)，長(zhǎng)期以來(lái)，向日葵在我國(guó)只是零星種植主要作為干果食用，20世紀(jì)90年代以來(lái)逐步成為我國(guó)人民的飲食結(jié)構(gòu)中是食用油的主要來(lái)源之一，19世紀(jì)80年代初，葵花開始在歐洲被用作為觀賞植物，目前已有100多年的栽培歷史，從上世紀(jì)80年代初，人們開始進(jìn)行向日葵組織培養(yǎng)研究，直到現(xiàn)在，向日葵離體培養(yǎng)植株再生仍然十分困難，即使能再生重復(fù)性也特別差，向日葵的再生途徑主要通過器官發(fā)生和胚胎發(fā)生而產(chǎn)生，向日葵的器官培養(yǎng)從子葉開始到下胚軸、真葉、莖尖等都不同程度的得到了再生植株，這幾種外植體中子葉、下胚軸、莖尖較易誘導(dǎo)出再生植株，但是總體上誘導(dǎo)出芽的頻率不高，一般在2．5％～12％，而且受各種因素影響，芽不易長(zhǎng)成植株。向日葵胚胎培養(yǎng)可以克服遠(yuǎn)緣雜交的不親和性、縮短雜交育種世代周期、加快育種進(jìn)程。

《華北農(nóng)學(xué)報(bào)》1993年第8卷第2期中《向日葵未成熟胚培養(yǎng)中不定芽的發(fā)生》一文中對(duì)向日葵未成熟胚不定芽發(fā)生進(jìn)行了研究表明，自交系、雜交一代和保持系的再生頻率高于普通品種?！秲?nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》2003年第18卷第5期中《向日葵未成熟胚組織培養(yǎng)及再生芽的研究》一文中對(duì)未成熟胚的萌動(dòng)、愈傷組織的誘導(dǎo)、分化及再生苗的培養(yǎng)和移栽等方面進(jìn)行了研究表明，授粉后10-12天的胚分化成苗率可達(dá)73％以上。

江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所從2011年開始從事葵花新品種選育研究，經(jīng)過多年的選育，目前已經(jīng)培育出多個(gè)具有不同特色的觀賞葵花新品系，實(shí)踐表明單瓣多頭葵花容易通過種子繁殖培育性狀穩(wěn)定的自交系，但是對(duì)于重瓣多頭葵花（黃色單瓣多頭葵花、紫色重瓣多頭葵花、白色重瓣多頭葵花），應(yīng)用種子繁殖，種子結(jié)實(shí)率低，后代性狀穩(wěn)定困難，分離嚴(yán)重。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為克服重瓣多頭葵花品種（黃色重瓣多頭葵花、紫色重瓣多頭葵花、白色重瓣多頭葵花）應(yīng)用種子繁殖困難，種子結(jié)實(shí)率低，后代性狀難以穩(wěn)定，分離嚴(yán)重的問題，提出一種以腋芽作為外植體培育向日葵組培苗的方法，并建立了葵花離體培養(yǎng)再生體系。

為解決上述問題，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種葵花組培育苗方法，以葵花的腋芽為外植體，通過組織培養(yǎng)培育葵花苗。

優(yōu)選地，所述組培育苗方法包括以下步驟：

a.外植體的選擇：采集頂花以下葉腋中的腋芽，腋芽的大小不超過1cm；

b.外植體準(zhǔn)備：將外植體洗凈并消毒滅菌，然后切取5mm左右大小腋芽的頂部作為外植體接種于分化培養(yǎng)基上；

c.誘導(dǎo)和分化：外植體繼續(xù)培養(yǎng)直接分化成不定芽；

d.壯苗培養(yǎng)：不定芽生長(zhǎng)到2～3cm時(shí)轉(zhuǎn)移至壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)；

e.生根培養(yǎng)：不定芽生長(zhǎng)到4～5cm時(shí)轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)；

f.組培苗馴化：組培苗長(zhǎng)大發(fā)生4～5片葉子，5～6條白色粗壯的幼根長(zhǎng)達(dá)約1～2cm時(shí)，出瓶鍛煉移栽。

優(yōu)選地，所述組培育苗方法，步驟a所述頂花選自具有觀賞價(jià)值的分枝多的品種。

優(yōu)選地，所述組培育苗方法，步驟a所述腋芽選自頂花即將開放或者已經(jīng)開放，容易辨別出花型一致、腋芽生長(zhǎng)慢、其它性狀一致的植株。

優(yōu)選地，所述組培育苗方法，

所述步驟b中，外植體用洗潔凈洗滌，然后用清水沖洗0.5h,在超凈工作臺(tái)上，先用70%的乙醇浸泡30～60s，然后用10%的過氧化氫或3%的次氯酸鈉溶液消毒15～20min，用無(wú)菌水清洗3～4次；所述分化培養(yǎng)基為：ms+0.6～1.5mg/l6-ba+0.03mg/lnaa培養(yǎng)基；其中，6-ba濃度為1.2mg/l為最優(yōu)，分化率達(dá)到83.5%以上；

所述步驟c中，外植體在培養(yǎng)25～30天直接分化成不定芽，繼續(xù)培養(yǎng)10～15天當(dāng)不定芽生長(zhǎng)到2～3cm時(shí)轉(zhuǎn)移至壯苗培養(yǎng)基；所述外植體的培養(yǎng)條件為：在溫度25～28℃，光照1600lx，日光燈每天光照12h的組織培養(yǎng)室中培養(yǎng)，固體培養(yǎng)基含7.5g/l瓊脂，滅菌前調(diào)ph為5.8～6.0；

所述步驟d中，所述壯苗培養(yǎng)基為：ms+0.3～0.8mg/l6-ba+0.03mg/lnaa培養(yǎng)基；其中，6-ba濃度為0.6mg/l為最優(yōu)；培養(yǎng)周期為25～30天；

所述步驟e中，所述生根培養(yǎng)基為：1/2ms+0.5mg/liba培養(yǎng)基；培養(yǎng)周期為25～30天；

所述步驟f中，因較長(zhǎng)的根在清洗過程中容易折傷損壞，降低移栽的成活率，因此移栽前先在室內(nèi)陽(yáng)光充足條件下先進(jìn)行不完全開瓶鍛煉1天，待組培瓶蓋水珠干透，再完全開瓶鍛煉2天；開瓶時(shí)間不宜超過3天，因?yàn)楸┞对诳諝庵械沫傊囵B(yǎng)基無(wú)疑是細(xì)菌等微生物的溫床，容易感染侵害植株，降低組培苗的成活率。

優(yōu)選地，所述組培育苗方法步驟f所述的移栽包括以下步驟：經(jīng)過馴化鍛煉的小苗逐漸適應(yīng)外界條件，用塑料鑷子從培養(yǎng)瓶中小心取出幼苗，盡量不要傷到幼根。如果培養(yǎng)基太干，可用自來(lái)水浸泡1～2min后再取出。取出后的組培苗用0.1%高錳酸鉀浸泡1～2min進(jìn)行消毒處理，清除組培苗上老化的葉片，再使用脫脂棉在自來(lái)水下輕揉幼根。將根部瓊脂沖洗干凈，以防瓊脂殘留物導(dǎo)致雜菌滋生感染植株。移栽要提前將栽培基質(zhì)澆透水。在裝好的草炭土+珍珠巖混合基質(zhì)中用玻璃棒打個(gè)小孔洞，將組培苗地下部分五分之四處種植到濕潤(rùn)基質(zhì)中，注意的是種植深度過深或淺都會(huì)影響株型，不利于植株的固定生長(zhǎng)和呼吸作用。最后澆水灌透，將移栽苗放到清潔、干凈﹑陽(yáng)光充足﹑通氣良好的溫室或塑料大棚中。

優(yōu)選地，所述組培育苗方法中，所述移栽基質(zhì)選用以徹底消毒，疏松，透水性良好的珍珠巖、河沙或蛭石加草炭土。

優(yōu)選地，所述組培育苗方法中，移栽后，培植溫度維持在20～25℃，濕度為75%～85%，同時(shí)要進(jìn)行短期的30%遮陰措施處理，促進(jìn)地下部分生根。當(dāng)植物愈傷組織形成的根已經(jīng)長(zhǎng)出根毛，功能性新根已慢慢長(zhǎng)出，提高了吸水能力，可以直接在葉面噴灑施以薄肥。

葵花苗期病害主要是灰霉病和根腐病和莖腐病等，容易引起死苗、爛苗，嚴(yán)重時(shí)易造成巨大的損失；優(yōu)選地，可對(duì)其進(jìn)行有效的防治：

1)加強(qiáng)苗床管理，防止苗床內(nèi)濕度過大，控制澆水,苗床里空氣相對(duì)濕度在60～70%；夜間溫室內(nèi)適當(dāng)加溫；苗床溫度控制在25～30°c；增加光照強(qiáng)度，并通風(fēng)換氣；

2)藥劑處理，發(fā)病前噴施70%百菌清500倍液或50%多菌靈500倍液或200倍等量式波爾多液防治，發(fā)病后用70％甲基托布津藥液或稀釋1000倍的50％代森銨藥液進(jìn)行噴治或噴灑，或采用50％代森鋅800～1000倍液噴治或澆灌。

優(yōu)選地，所述組培育苗方法中，穴盤育苗的葵花苗可移栽到大田，移栽方法為：將移栽苗水澆透，連同基質(zhì)一起挖出，輕拿握住泥土團(tuán)，把苗根輕放入大田事先開好的穴中，填充壓實(shí)好土壤。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：

本發(fā)明提出一種以腋芽作為外植體培育向日葵組培苗的方法，相比于選用子葉、下胚軸、莖尖作為外植體，誘導(dǎo)出芽的頻率高，達(dá)到68%以上，可以直接從外植體誘導(dǎo)出不定芽，每個(gè)外植體一次可以增值3～5倍；

繁殖速度快：由于本發(fā)明選用多分枝品種作為組培材料，每個(gè)單株一次可以采集15～20個(gè)腋芽，有些單株可能更多，可以極大的提高組培繁殖速度，縮短建立離體培養(yǎng)再生體系的時(shí)間；

組培苗純度高：由于選取頂花即將開放或已經(jīng)開放的植株的腋芽作為外植體，可以有效的提高組培苗的純度，快速建立純合離體培養(yǎng)再生體系，克服重瓣葵花應(yīng)用種子繁殖困難，種子結(jié)實(shí)率低，后代性狀不易穩(wěn)定，分離嚴(yán)重的問題；

由于向日葵是異花授粉植物，在后代中容易產(chǎn)生各種觀賞價(jià)值高的葵花變異株，本發(fā)明對(duì)于葵花特異種植資源的保存具有重要意義。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明專利組培適用葵花品種1——黃色普通葵花(單瓣)；

圖2本發(fā)明專利組培適用葵花品種2——紫芯普通葵花(單瓣)；

圖3本發(fā)明專利組培適用葵花品種3——白色觀賞葵（單瓣）；

圖4本發(fā)明專利組培適用葵花品種4——黃色菊葵花(重瓣)；

圖5本發(fā)明專利組培適用葵花品種5——黃色菊葵花(重瓣)；

圖6本發(fā)明專利組培適用葵花品種6——黃色菊葵花（重瓣）；

圖7本發(fā)明專利組培適用葵花品種7——黃色菊葵花（重瓣）

圖8本發(fā)明專利組培適用葵花品種8——彩色觀賞葵（重瓣）；

圖9本發(fā)明專利組培適用葵花品種9——彩色觀賞葵（重瓣）；

圖10本發(fā)明專利組培適用葵花品種10——白色菊葵花（重瓣）；

圖11本發(fā)明專利組培適用葵花品種11——白色菊葵花（重瓣）；

圖12本發(fā)明外植體腋芽的采集；

圖13本發(fā)明外植體接種到培養(yǎng)基；

圖14外植體上芽的分化（一）；

圖15外植體上芽的分化（二）；

圖16不定芽的分化（一）；

圖17不定芽的分化（二）；

圖18生根培養(yǎng)（一）；

圖19生根培養(yǎng)（二）。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

葵花品種選擇——選擇具有觀賞價(jià)值的分枝多的品種，例如圖1-11。

外植體的選擇——選取頂花即將開放或者已經(jīng)開放，容易辨別出花型一致、腋芽生長(zhǎng)慢、其它性狀一致的植株，采集頂花以下各個(gè)葉腋中的腋芽（參見圖12），腋芽的大小不超過1cm。

外植體準(zhǔn)備——采集好的外植體用洗潔凈洗滌，然后用清水沖洗0.5h,之后在超凈工作臺(tái)上，先用70%的乙醇浸泡30～60s，然后用10%的過氧化氫或3%的次氯酸鈉溶液消毒15～20min，用無(wú)菌水清洗3～4次。然后切取5mm左右大小腋芽的頂部作為外植體接種于分化培養(yǎng)基上（參見圖13），分化培養(yǎng)基為：ms+0.6～1.5mg/l6-ba+0.03mg/lnaa培養(yǎng)基；其中，6-ba濃度為1.2mg/l為最優(yōu)，分化率達(dá)到83.5%以上。

誘導(dǎo)和分化——外植體培養(yǎng)25～30天直接分化成不定芽，外植體上芽的分化參見圖14-15，繼續(xù)培養(yǎng)10-15天當(dāng)不定芽生長(zhǎng)到2～3cm時(shí)轉(zhuǎn)移至壯苗培養(yǎng)基；培養(yǎng)的條件為：溫度25～28c，光照1600lx，日光燈每天光照12h的組織培養(yǎng)室中培養(yǎng)固體培養(yǎng)基含7.5g/l瓊脂，滅菌前調(diào)ph為5.8～6.0。

壯苗培養(yǎng)——當(dāng)不定芽生長(zhǎng)到2～3cm時(shí)，將不定芽轉(zhuǎn)移至壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)25-30天；不定芽的分化參見圖16-17；壯苗培養(yǎng)基為：ms+0.3～0.8mg/l6-ba+0.03mg/lnaa培養(yǎng)基；其中，6-ba濃度為0.6mg/l為最優(yōu)。

生根培養(yǎng)——不定芽生長(zhǎng)到4-5cm時(shí)轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)25-30天；生根培養(yǎng)參見圖18-19；生根培養(yǎng)基為：1/2ms+0.5mg/liba培養(yǎng)基。

組培苗馴化——當(dāng)葵花組培苗長(zhǎng)大發(fā)生4～5片葉子，5～6條白色粗壯的幼根長(zhǎng)達(dá)約1～2cm時(shí)，選擇合適的時(shí)間便可出瓶鍛煉移栽。因較長(zhǎng)的根在清洗過程中容易折傷損壞，降低移栽的成活率，因此移栽前先在室內(nèi)陽(yáng)光充足條件下先進(jìn)行不完全開瓶鍛煉1天，待組培瓶蓋水珠干透，再完全開瓶鍛煉2天；開瓶時(shí)間不宜超過3天，因?yàn)楸┞对诳諝庵械沫傊囵B(yǎng)基無(wú)疑是細(xì)菌等微生物的溫床，容易感染侵害植株，降低組培苗的成活率。

移栽前準(zhǔn)備——經(jīng)過馴化鍛煉的小苗逐漸適應(yīng)外界條件，用塑料鑷子從培養(yǎng)瓶中小心取出幼苗，盡量不要傷到幼根。如果培養(yǎng)基太干，可用自來(lái)水浸泡1～2min后再取出。取出后的組培苗用0.1%高錳酸鉀浸泡1～2min進(jìn)行消毒處理，清除組培苗上老化的葉片，再使用脫脂棉在自來(lái)水下輕揉幼根。將根部瓊脂沖洗干凈，以防瓊脂殘留物導(dǎo)致雜菌滋生感染植株。

移栽基質(zhì)——育苗栽培基質(zhì)要求通氣空隙度大，選用以徹底消毒，疏松，透水性良好的珍珠巖，河沙或蛭石加草炭土等為宜。

移栽——移栽要提前將栽培基質(zhì)澆透水。在裝好的草炭土+珍珠巖混合基質(zhì)中用玻璃棒打個(gè)小孔洞，將組培苗地下部分五分之四處種植到濕潤(rùn)基質(zhì)中，注意的是種植深度過深或淺都會(huì)影響株型，不利于植株的固定生長(zhǎng)和呼吸作用。最后澆水灌透，將移栽苗放到清潔、干凈﹑陽(yáng)光充足﹑通氣良好的溫室或塑料大棚中。

移栽后管理——溫度宜維持在20～25℃左右，濕度為75%～85%左右，同時(shí)要進(jìn)行短期的30%遮陰措施處理，促進(jìn)地下部分生根。當(dāng)植物愈傷組織形成的根已經(jīng)長(zhǎng)出根毛，功能性新根已慢慢長(zhǎng)出，提高了吸水能力，可以直接在葉面噴灑施以薄肥。

移栽后病害防治——葵花苗期病害主要是灰霉病和根腐病和莖腐病等，容易引起死苗、爛苗，嚴(yán)重時(shí)易造成巨大的損失。有效的防治措施主要有：(1)防止苗床內(nèi)濕度過大，控制澆水,苗床里空氣相對(duì)濕度在60～70%；夜間溫室內(nèi)適當(dāng)加溫；苗床溫度控制在25～30°c；增加光照強(qiáng)度，并通風(fēng)換氣；幼苗的光合和呼吸作用旺盛，則生長(zhǎng)健壯，抗病能力隨之增強(qiáng)。(2)藥劑處理，發(fā)病前可噴施70%百菌清500倍液或50%多菌靈500倍液或200倍等量式波爾多液防治，發(fā)病后或用70％甲基托布津藥液或稀釋1000倍的50％代森銨藥液進(jìn)行噴治或噴灑50％代森鋅800～1000倍液噴治或澆灌均可。

二次移栽——穴盤育苗的葵花苗，即可移栽到大田，移栽時(shí)，先將移栽苗水澆透，將移栽苗連同基質(zhì)一起挖出，輕拿握住泥土團(tuán)，把苗根輕放入大田事先開好的穴中，填充壓實(shí)好土壤。

需要說(shuō)明的是上述實(shí)施例僅僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并沒有用來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，在上述基礎(chǔ)上做出的等同替換或者替代均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。