本發(fā)明涉及一種梭子蟹用誘抗素的制備及應(yīng)用，具體為采用誘抗素誘導(dǎo)梭子蟹成為多倍體水產(chǎn)動物的方法。

背景技術(shù)：

三疣梭子蟹的漁汛一年有春秋兩次，漁期長，產(chǎn)量高，體大肉多，味鮮美，營養(yǎng)豐富，尤其是卵巢和肝臟。卵巢可供作上等調(diào)味品。肉多，脂膏肥滿，味鮮美，營養(yǎng)豐富。每百克蟹內(nèi)含蛋白質(zhì)14克、脂肪2．6克。鮮食以蒸食為主，還可鹽漬加工“槍蟹”、蟹醬，蟹卵經(jīng)漂洗曬干即成為“蟹籽”，均是海味品中之上品。肉除鮮食外，還可制作罐頭,暢銷國內(nèi)外。殼可作藥材用，又可提取甲殼質(zhì)，廣泛用于多種工業(yè)。黃海和東海年產(chǎn)量各有1～2萬噸上下。為中國最重要的海產(chǎn)蟹，經(jīng)濟意義重大。近似種南海和東海還有遠(yuǎn)海梭子蟹和紅星梭子蟹，在南海為常見經(jīng)濟種。是中國重要的出口暢銷品之一，出口輸往國別和地區(qū)：日本，香港、澳門。出口口岸：遼寧、河北、天津、山東、江蘇、浙江、福建。

實踐證明,三倍體水產(chǎn)動物具有生長迅速、肉質(zhì)改善及生物基因污染風(fēng)險降低等優(yōu)勢一個普遍特征是性腺發(fā)育受阻。近年來,養(yǎng)殖蟹類特別是養(yǎng)殖的梭子蟹個體小型化、性早熟等現(xiàn)象比較突出,三倍體性腺的不育性有望解決其性早熟問題,從而培育大規(guī)格的梭子蟹,提高養(yǎng)殖產(chǎn)量和經(jīng)濟效益，與二倍體群體相比,放養(yǎng)后68~106d,三倍體群體在殼長、殼寬、體質(zhì)量上都表現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢(P<0.01),并且其營養(yǎng)組成與二倍體蟹存在差異。三倍體幼蟹蟹體氨基酸總量高于正常二倍體幼蟹,必需氨基酸中蘇氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、精氨酸、異亮氨酸、組氨酸和賴氨酸的含量高于二倍體,而關(guān)于三倍體蟹類生產(chǎn)性狀的研究較少因此開展蟹類的多倍體誘導(dǎo)研究十分必要并具有重要的研究和生產(chǎn)意義。

已有的誘抗素：通過化學(xué)試劑抑制極體釋放或第一次細(xì)胞分裂產(chǎn)生三倍體或四倍體的方法。常用的多倍體誘抗素主要有細(xì)胞松弛素B(CB)、6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)、咖啡因、秋水仙素等。目前,細(xì)胞松弛素B因價格高且對人體及生物具有較大的生物毒性,目前應(yīng)用已不多。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種高效制備多倍體三疣梭子蟹的方法。使得所需的梭子蟹產(chǎn)品品質(zhì)更加完美。

梭子蟹的養(yǎng)殖：池塘的整理，池塘整理主要是清除池底過多的淤泥，翻松曝曬池底，另外還要維修塘堤、閘門、水渠等配套設(shè)施；設(shè)置障礙物，為了便于蟹苗休息和隱藏,當(dāng)整修好池塘后，還要在池底放上水泥管、瓦片、竹筒等障礙物；進水并繁殖餌料生物，清塘半個月以后，就可以開閘進水，為了防止一些有害生物進入池子，可以用60-80目的篩絹網(wǎng)過濾海水，池水深度一般保持在60-80公分，池塘進水后，要施用化肥來培育餌料生物，一般N肥在1.5-2㎏/畝，P肥為0.3-0.5㎏/畝，并且要保持池水的透明度在20-30公分左右。

為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)。本發(fā)明提供了一種三疣梭子蟹誘抗素的制備方法及用量比例。

本發(fā)明所用梭子蟹用誘抗素：利用細(xì)胞松弛素B(CB)3-5份、6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)1-3份和氯化鉀(KCl)2-4份。誘導(dǎo)蟹三倍體和四倍體的方法,分別利用上述誘抗素處理抱卵蟹,在囊胚期檢測的最高三倍體率分別為47-49%,51-52%和75-77%,四倍體最高誘導(dǎo)率依次是48-50%,53-55%和78-80%。并且使用KCl對抱卵蟹誘導(dǎo)處理獲得的溞狀幼體最高三倍體誘導(dǎo)率為85.3%,最高四倍體誘導(dǎo)率27.3%。該研究克服了以往三倍體誘導(dǎo)中離體培養(yǎng)的困難,首次獲得了蟹三倍體溞狀幼體,并極大提高了溞狀幼體階段四倍體誘導(dǎo)率。

誘抗素參數(shù)優(yōu)化：本發(fā)明者利用KCl誘導(dǎo)蟹三倍體的關(guān)鍵參數(shù)進行了優(yōu)化,優(yōu)化的結(jié)果為:10-15℃,將產(chǎn)卵后1.5-2h孵化膜形成并舉起作為中華絨螯蟹三倍體誘導(dǎo)起始點的形態(tài)學(xué)標(biāo)記,以4-6g/L的KCl溶液處理4h,獲得了最高為100%的離體卵三倍體誘導(dǎo)率。另外,對三疣梭子蟹的三倍體誘導(dǎo)進行了嘗試,利用6-DMAP和KCl處理獲得。

利用免疫熒光組織化學(xué)方法研究細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)在多倍體誘導(dǎo)處理前后的變化可以闡明其工作機理。本發(fā)明者曾利用其他的技術(shù)手段進行了研究以期闡明利用誘導(dǎo)蟹多倍體的工作機理,但由于其受精卵卵徑大、卵黃顆粒多,再加上外被堅韌的卵膜阻止了免疫抗體進入卵內(nèi)與細(xì)胞骨架的結(jié)合,故此前在這方面的研究進展緩慢。有了KCl誘導(dǎo)多倍體工作機理的闡明可以加快蟹類多倍體育種的進程。以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對其限制，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的精神和范圍。

現(xiàn)把梭子蟹用誘抗素的有關(guān)技術(shù)簡要介紹如下：梭子蟹的養(yǎng)殖→已有的誘抗素→本發(fā)明所用梭子蟹用誘抗素→誘抗素參數(shù)優(yōu)化。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚。下面將結(jié)合本發(fā)明的實施例對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。

基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1

梭子蟹的養(yǎng)殖：池塘的整理，池塘整理主要是清除池底過多的淤泥，翻松曝曬池底，另外還要維修塘堤、閘門、水渠等配套設(shè)施；設(shè)置障礙物，為了便于蟹苗休息和隱藏,當(dāng)整修好池塘后，還要在池底放上水泥管、瓦片、竹筒等障礙物；進水并繁殖餌料生物，清塘半個月以后，就可以開閘進水，為了防止一些有害生物進入池子，可以用60目的篩絹網(wǎng)過濾海水，池水深度一般保持在60公分，池塘進水后，要施用化肥來培育餌料生物，一般N肥在1.5㎏/畝，P肥為0.3㎏/畝，并且要保持池水的透明度在20公分左右。利用細(xì)胞松弛素B(CB)3份、6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)1份和氯化鉀(KCl)2份。誘導(dǎo)蟹三倍體和四倍體的方法,分別利用上述誘抗素處理抱卵蟹,在囊胚期檢測的最高三倍體率分別為47%,51%和75%,四倍體最高誘導(dǎo)率依次是48%,53%和78%。

實施例2

梭子蟹的養(yǎng)殖：池塘的整理，池塘整理主要是清除池底過多的淤泥，翻松曝曬池底，另外還要維修塘堤、閘門、水渠等配套設(shè)施；設(shè)置障礙物，為了便于蟹苗休息和隱藏,當(dāng)整修好池塘后，還要在池底放上水泥管、瓦片、竹筒等障礙物；進水并繁殖餌料生物，清塘半個月以后，就可以開閘進水，為了防止一些有害生物進入池子，可以用80目的篩絹網(wǎng)過濾海水，池水深度一般保持在80公分，池塘進水后，要施用化肥來培育餌料生物，一般N肥在2㎏/畝，P肥為0.5㎏/畝，并且要保持池水的透明度在30公分左右。利用細(xì)胞松弛素B(CB)5份、6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)3份和氯化鉀(KCl)4份。誘導(dǎo)蟹三倍體和四倍體的方法,分別利用上述誘抗素處理抱卵蟹,在囊胚期檢測的最高三倍體率分別為49%,52%和77%,四倍體最高誘導(dǎo)率依次是50%,55%和80%。

實施例3

梭子蟹的養(yǎng)殖：池塘的整理，池塘整理主要是清除池底過多的淤泥，翻松曝曬池底，另外還要維修塘堤、閘門、水渠等配套設(shè)施；設(shè)置障礙物，為了便于蟹苗休息和隱藏,當(dāng)整修好池塘后，還要在池底放上水泥管、瓦片、竹筒等障礙物；進水并繁殖餌料生物，清塘半個月以后，就可以開閘進水，為了防止一些有害生物進入池子，可以用70目的篩絹網(wǎng)過濾海水，池水深度一般保持在70公分，池塘進水后，要施用化肥來培育餌料生物，一般N肥在1.8㎏/畝，P肥為0.4㎏/畝，并且要保持池水的透明度在25公分左右。利用細(xì)胞松弛素B(CB)4份、6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)2份和氯化鉀(KCl)3份。誘導(dǎo)蟹三倍體和四倍體的方法,分別利用上述誘抗素處理抱卵蟹,在囊胚期檢測的最高三倍體率分別為48%，51.2%和76%，四倍體最高誘導(dǎo)率依次是49%，54%和79%。

雖然本發(fā)明已以實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明的保護范圍，任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的構(gòu)思和范圍內(nèi)所做的更動和潤飾，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。