本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種紅錐無菌外植體制備及初始芽誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
紅錐( Castanopsis hystrix A .DC )隸屬殼斗科( Fagaceae )栲屬( Castanopsis )，成年樹高可達(dá)30m，胸徑1m以上，是我國南亞熱帶和亞熱帶植被常綠闊葉林的優(yōu)勢組成樹種，屬華南地區(qū)重要的鄉(xiāng)土闊葉珍貴用材和高效多用途生態(tài)公益林樹種。紅錐天然分布于東經(jīng)95°20′～118°00′，北緯18°30′～25°00′，主產(chǎn)地集中于廣東、廣西、福建南部，其周邊分布在海南、云南南部、貴州東南部以及湖南、江西等省南部。
紅錐具有生長快、材質(zhì)優(yōu)、適應(yīng)廣、效益高等優(yōu)良特性。其主干通直，材質(zhì)堅硬，呈紅色，色澤和紋理美觀，耐腐蝕性強(qiáng)，不開裂、不變形、易加工，是優(yōu)質(zhì)珍貴用材，可供建筑、造船、高檔家具、木制地板、軍工用品、體育器材等用。種子富含淀粉，可用于炒食、飼料和釀酒，種實、殼斗均富含單寧，可提制栲膠。紅錐林萌芽力強(qiáng)，萌條生長迅速，一次造林可采伐10次以上，合理經(jīng)營可獲利上百年。紅錐枝葉濃密，較耐蔭蔽，混生性能好，可作為用材和水源涵養(yǎng)林進(jìn)行純林種植，亦可為殘次林改造，生態(tài)公益林改造的混交造林。目前我國多個省如廣東、廣西、福建等將紅錐推選為當(dāng)?shù)貐^(qū)經(jīng)濟(jì)價值高、發(fā)展前途大的優(yōu)良樹種進(jìn)行推廣，造林面積大，推廣應(yīng)用前景廣。
目前紅錐人工林栽培所用苗木多采用混采種子育苗，導(dǎo)致苗木及其造林后的林分個體分化大，參差不齊，進(jìn)而影響到人工林的造林質(zhì)量、產(chǎn)量及經(jīng)濟(jì)效益。通過科技工作者近十幾年的研究，已選育出一批紅錐優(yōu)良單株，但由于所選優(yōu)株數(shù)量有限，加之樹齡年輕，結(jié)實率低，所收獲種子遠(yuǎn)不能滿足造林需求。前期研究表明，紅錐優(yōu)樹無論采用嫁接還是扦插進(jìn)行繁殖，繁殖率低，同時存在程度不同的偏冠現(xiàn)象，所繁育苗木難以用于生產(chǎn)。以紅錐優(yōu)樹萌枝進(jìn)行組培研究雖有報道，但仍存在出芽慢，無菌系建立困難等問題，難以用于生產(chǎn)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對現(xiàn)有紅錐組織培養(yǎng)中外植體消毒困難、褐化、初始芽發(fā)生率低、芽苗活性差等的技術(shù)問題，提供一種紅錐無菌外植體制備及初始芽誘導(dǎo)的方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種紅錐無菌外植體制備及初始芽誘導(dǎo)方法，包括外植體準(zhǔn)備、外植體消毒處理以及初始芽誘導(dǎo)工序，采集紅錐當(dāng)年生嫩枝作為外植體，進(jìn)行消毒處理后，獲得的無菌外植體接種于初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在適宜環(huán)境中培養(yǎng)20-30天后，獲得生長快、活力旺盛的紅錐初始芽，其操作步驟如下：
（1）外植體準(zhǔn)備：
在至少連續(xù)3天晴朗的氣候里，采集紅錐的樹冠外圍生長健壯的當(dāng)年生嫩枝作為外植體；
（2）外植體消毒處理：
將外植體用無菌水沖洗干凈后，置于體積濃度為0.1-0.3 %的廣譜殺菌劑中浸泡20-30 min，取出外植體將其置于體積濃度為70 %酒精中浸泡1-2 min，再移入體積濃度為5-8 %的氯化汞溶液中浸泡10-20 min，取出放于體積濃度為10-25 %的雙氧水和2-5滴吐溫的混合液中攪拌浸泡20-30 min后，最后用無菌水洗3-4次，每次沖洗3-5 min；將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)，備用；
將步驟（2）得到的外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：改良1/2MS培養(yǎng)基 + IBA 0.5-1.5 mg·L-1 + MT 1.0-3.0 mg·L-1 + 6-BA 1.0-3.0 mg·L-1 + 葡萄糖30 g·L-1 + 瓊脂3.5 g·L-1 + 0.1-0.3 %廣譜殺菌劑；初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)周期為：20-30天，置于溫度：20±3℃，光照培養(yǎng)時間為：16 h，光照強(qiáng)度為：≤1000 lx的環(huán)境中進(jìn)行初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得生長健壯、活力旺盛的紅錐初始芽。初始芽萌動率在90%以上。
以上所述的改良MS培養(yǎng)基的組成為：KNO3 1350 mg·L-1；NH4NO3 650 mg·L-1；CaCl2·2H2O 180 mg·L-1；MgSO4·7H2O 380 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 460 mg·L-1；KH2PO4220 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.5 mg·L-1；維生素B6 0.6 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。
優(yōu)選的，以上適宜條件為：溫度：20±3℃，光照培養(yǎng)時間為：12 h，光照強(qiáng)度為：≤1000 lx。
對比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果如下：
1、本發(fā)明選取當(dāng)年紅錐生嫩枝為組培繁殖材料，外植體的萌芽條幼態(tài)化程度高，極大地提高了外植體的有效性，從而成功建立一種紅錐莖段組培方法，本方法對加快紅錐優(yōu)質(zhì)壯苗的生產(chǎn)，促進(jìn)國家硬木用材快速發(fā)展，調(diào)整林業(yè)品種結(jié)構(gòu)具有重大意義。
2、本發(fā)明依次采用一定的濃度及消毒時間的廣譜殺菌劑、酒精、氯化汞、雙氧水和吐溫相配合的消毒處理的方式，無菌外植體獲取率高，達(dá)到90%以上。
3、本發(fā)明使用優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式，外植體褐化少，初始芽發(fā)生率高，芽苗伸長快、活力旺盛，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。
實施例1：
在至少連續(xù)3天晴朗的氣候里，采集紅錐的樹冠外圍生長健壯的當(dāng)年生嫩枝作為外植體。將外植體用無菌水沖洗干凈后，置于體積濃度為0.1 %的廣譜殺菌劑中浸泡30 min，取出外植體將其置于體積濃度為70 %酒精中浸泡1 min，再移入體積濃度為5 %的氯化汞溶液中浸泡20 min，取出放于體積濃度為10 %的雙氧水和2滴吐溫的混合液中攪拌浸泡30 min后，最后用無菌水洗3次，每次沖洗5 min；將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-2.0cm長的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)，備用；將消毒處理后得到的外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：改良1/2MS培養(yǎng)基 + IBA 0.5 mg·L-1 + MT 1.0 mg·L-1 + 6-BA 1.0mg·L-1 + 葡萄糖30 g·L-1 + 瓊脂3.5 g·L-1 + 0.1 %廣譜殺菌劑；初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)周期為：20-35天，置于溫度：20±3℃，光照培養(yǎng)時間為：12 h，光照強(qiáng)度為：≤1000 lx的環(huán)境中進(jìn)行初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得生長健壯、活力旺盛的紅錐初始芽，初始芽萌動率95%。
所述的改良MS培養(yǎng)基的組成為：KNO3 1350 mg·L-1；NH4NO3 650 mg·L-1；CaCl2·2H2O 180 mg·L-1；MgSO4·7H2O 380 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 460 mg·L-1；KH2PO4 220 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.5 mg·L-1；維生素B6 0.6 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。
實施例2：
在至少連續(xù)3天晴朗的氣候里，采集紅錐的樹冠外圍生長健壯的當(dāng)年生嫩枝作為外植體。將外植體用無菌水沖洗干凈后，置于體積濃度為0.2 %的廣譜殺菌劑中浸泡25 min，取出外植體將其置于體積濃度為70 %酒精中浸泡2 min，再移入體積濃度為6 %的氯化汞溶液中浸泡15 min，取出放于體積濃度為15 %的雙氧水和4滴吐溫的混合液中攪拌浸泡25 min后，最后用無菌水洗3次，每次沖洗5 min；將外植體裁成帶至少1個腋芽，2.0-2.5 cm長的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)，備用；將消毒處理后得到的外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：改良1/2MS培養(yǎng)基 + IBA 1.5 mg·L-1 + MT 2.0 mg·L-1 + 6-BA 2.0 mg·L-1 + 葡萄糖30 g·L-1 + 瓊脂3.5 g·L-1 + 0.1-0.3 %廣譜殺菌劑；初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)周期為：20-25天，置于溫度：20±3℃，光照培養(yǎng)時間為：12 h，光照強(qiáng)度為：≤1000 lx的環(huán)境中進(jìn)行初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得生長健壯、活力旺盛的紅錐初始芽，初始芽萌動率96%。
所述的改良MS培養(yǎng)基的組成為：KNO3 1350 mg·L-1；NH4NO3 650 mg·L-1；CaCl2·2H2O 180 mg·L-1；MgSO4·7H2O 380 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 460 mg·L-1；KH2PO4 220 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.5 mg·L-1；維生素B6 0.6 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。
實施例3：
在至少連續(xù)3天晴朗的氣候里，采集紅錐的樹冠外圍生長健壯的當(dāng)年生嫩枝作為外植體。將外植體用無菌水沖洗干凈后，置于體積濃度為0.3 %的廣譜殺菌劑中浸泡20 min，取出外植體將其置于體積濃度為70 %酒精中浸泡2 min，再移入體積濃度為8 %的氯化汞溶液中浸泡10 min，取出放于體積濃度為25 %的雙氧水和5滴吐溫的混合液中攪拌浸泡20 min后，最后用無菌水洗4次，每次沖洗3 min；將外植體裁成帶至少1個腋芽，2.5-3cm長的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)，備用；將消毒處理后得到的外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：改良1/2MS培養(yǎng)基 + IBA 1.0 mg·L-1 + MT 3.0 mg·L-1 + 6-BA 3.0 mg·L-1 + 葡萄糖30 g·L-1 + 瓊脂3.5 g·L-1 + 0.3 %廣譜殺菌劑；初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)周期為：25-30天，置于溫度：20±3℃，光照培養(yǎng)時間為：12 h，光照強(qiáng)度為：≤1000 lx的環(huán)境中進(jìn)行初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得生長健壯、活力旺盛的紅錐初始芽，初始芽萌動率94%。
所述的改良MS培養(yǎng)基的組成為：KNO3 1350 mg·L-1；NH4NO3 650 mg·L-1；CaCl2·2H2O 180 mg·L-1；MgSO4·7H2O 380 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 460 mg·L-1；KH2PO4 220 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.5 mg·L-1；維生素B6 0.6 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。