本發(fā)明屬于植物繁殖技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種赤皮青岡嫩枝組培繁殖方法。
背景技術(shù)：
赤皮青岡(Cyclobalanopsis gilva (Blume) Oerst),屬殼斗科青岡屬(Cyclobalanopsis Oerst)植物，為常綠喬木，高達(dá)30米，樹皮暗褐色，耐貧瘠，在我國廣泛分布于浙江、湖南等省。赤皮青岡心材呈深紅褐色，邊材呈黃褐色，紋理直，質(zhì)堅(jiān)重，強(qiáng)韌有彈性，氣干密度0.85-0.91克/立方厘米，用途廣泛，經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高，是我國珍貴的硬材樹種之一。由于大量砍伐，已淪為瀕危樹種。一方面，赤皮青岡種子屬于頑拗性種子，其萌發(fā)時(shí)間很長，發(fā)芽率較低，且容易遭蟲害，不易保存，存活率很低，有性繁殖速度慢；另一方面,有性繁殖不能保證林木的優(yōu)良特性，然而，組織培養(yǎng)能通過無性繁殖，遺傳樹種的優(yōu)良特性，能在短時(shí)間內(nèi)快速繁殖獲得大量優(yōu)質(zhì)的組培苗，為優(yōu)質(zhì)種源推廣提供可能。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對赤皮青岡組織培養(yǎng)過程中芽增殖系數(shù)低，生長緩慢等問題,提供一種生長效果好、擴(kuò)繁快的赤皮青岡嫩枝組培繁殖方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種赤皮青岡嫩枝組培繁殖方法，包括外植體選擇、外植體處理、初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯芽培養(yǎng)和生根培養(yǎng)工序，采集半木質(zhì)化、生長健壯的當(dāng)年生赤皮青岡嫩枝作為外植體，對外植體進(jìn)行修剪、滅菌消毒處理后接種于初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中獲取初始芽，再將初始芽接種于增殖培養(yǎng)基中經(jīng)過3-4個(gè)周期增殖培養(yǎng)，形成叢生芽，將叢生芽接入壯芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后將高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，具體操作步驟如下：
（1）外植體選擇：采集半木質(zhì)化、生長健壯的當(dāng)年生赤皮青岡嫩枝作為外植體；
（2）外植體處理：將外植體置于自來水下沖洗10-15 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時(shí)間15-20 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個(gè)腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)，備用；
（3）初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)30-35 d，初始芽萌發(fā)、生長；
（4）增殖培養(yǎng)：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，35-40 d轉(zhuǎn)接一次，循環(huán)往復(fù)，經(jīng)3-4個(gè)周期的培養(yǎng)，形成叢生芽；
（5）壯芽培養(yǎng)：將步驟（4）得到的叢生芽進(jìn)行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)35-40 d，形成壯芽；
（6）生根培養(yǎng)：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根；余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復(fù)步驟（5），循環(huán)往復(fù)，獲得大量壯芽。
以上所述的初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 4.0-6.0 mg/L+NAA 2.0-3.0 mg/L+KT 1.0-2.0 mg/L+ZT 1.5-2.0 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+蔗糖25 g/L。
以上所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 6.0-8.0 mg/L+NAA 2.0-3.0 mg/L+ZT 0.5-1.0mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L。
以上所述的壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 3.0-4.0 mg/L+NAA 1.0-1.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+蔗糖 25 g/L。
以上所述的生根培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.5-2.5 mg/L+NAA 1.0-1.5 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+蔗糖 30 g/L。
以上所述改良WPM培養(yǎng)基的組分和體積重量比為：NH4NO3 370mg/L，CaCl2·2H2O 82 mg/L，MgSO4·7H20 270 mg/L，KH2PO4 170 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.025 mg/L，Na2·EDTA 37.4 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇200 mg/L，煙酸0.5 mg/L，鹽酸吡哆醇0.5 mg/L，鹽酸硫胺素1.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
以上步驟（3）所述的初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的培育控制條件為：光培養(yǎng)、光照500-1000 lx，培養(yǎng)溫度20±1℃；步驟（4）所述的增殖培養(yǎng)、步驟（5）所述的壯芽培養(yǎng)、步驟（6）所述的生根培養(yǎng)的培育控制條件均為：光培養(yǎng)，光照2500-4000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃。
相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果如下：
1、本發(fā)明以赤皮青岡當(dāng)年生嫩枝作為外植體，經(jīng)過初始芽培養(yǎng)基培養(yǎng)，初始芽萌動(dòng)率90%以上；經(jīng)過3-4個(gè)周期增殖培養(yǎng)，形成叢生芽，芽增殖系數(shù)5/30d-7/30d，再將叢生芽接入壯芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后將高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，從而縮短了赤皮青岡的育苗周期，節(jié)省育苗材料，克服了傳統(tǒng)育苗方法中存在的育苗所需材料多、周期長等問題，大大降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率。
2、本發(fā)明將高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，余下小芽叢繼續(xù)增殖培養(yǎng)，使得材料能夠多次繼代，實(shí)現(xiàn)大量增殖，規(guī)?；a(chǎn)壯芽，實(shí)現(xiàn)黃樟油素型樟樹的擴(kuò)繁。
3、本發(fā)明對WPM基本培養(yǎng)基進(jìn)行了改良，同時(shí)重點(diǎn)調(diào)整了與赤皮青岡出芽壯芽相關(guān)元素，使得培養(yǎng)基更科學(xué)，更有針對性，更易促使赤皮青岡芽誘導(dǎo)的發(fā)生、增殖和壯芽，效果顯著。
4、本發(fā)明操作過程簡便，培養(yǎng)周期短，繼代芽產(chǎn)量大,并且質(zhì)量優(yōu)，增殖系數(shù)達(dá)到5以上的組培苗產(chǎn)業(yè)化技術(shù)要求，具有很好的經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益和社會效益。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1：
（1）外植體選擇：采集半木質(zhì)化、生長健壯的當(dāng)年生赤皮青岡嫩枝作為外植體；
（2）外植體處理：將外植體置于自來水下沖洗10 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時(shí)間15 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個(gè)腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)，備用；
（3）初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)、光照500 lx，培養(yǎng)溫度20±1℃的環(huán)境中培養(yǎng)30-35 d，初始芽萌發(fā)、生長；所述的初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 4.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+ZT 1.5 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+蔗糖25 g/L；
（4）增殖培養(yǎng)：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)，光照2500 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中，35-40 d轉(zhuǎn)接一次，循環(huán)往復(fù)，經(jīng)3-4個(gè)周期的培養(yǎng)，形成叢生芽；所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 6.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L+ZT 0.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L；
（5）壯芽培養(yǎng)：將步驟（4）得到的叢生芽進(jìn)行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，置于光培養(yǎng)，光照2500 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中培養(yǎng)35-40 d，形成壯芽；所述的壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+蔗糖 25 g/L；
（6）生根培養(yǎng)：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中，余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復(fù)步驟（5），循環(huán)往復(fù)，獲得大量壯芽；生根培養(yǎng)是置于光培養(yǎng)，光照2500 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中誘導(dǎo)生根，生根率為94%；所述的生根培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+蔗糖 30 g/L。
以上所述改良WPM培養(yǎng)基的組分和體積重量比為：NH4NO3 370mg/L，CaCl2·2H2O 82 mg/L，MgSO4·7H20 270 mg/L，KH2PO4 170 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.025 mg/L，Na2·EDTA 37.4 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇200 mg/L，煙酸0.5 mg/L，鹽酸吡哆醇0.5 mg/L，鹽酸硫胺素1.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
實(shí)施例2：
（1）外植體選擇：采集半木質(zhì)化、生長健壯的當(dāng)年生赤皮青岡嫩枝作為外植體；
（2）外植體處理：將外植體置于自來水下沖洗15 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時(shí)間20 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個(gè)腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)，備用；
（3）初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)、光照1000 lx，培養(yǎng)溫度20±1℃的環(huán)境中培養(yǎng)30-35 d，初始芽萌發(fā)、生長；所述的初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 5.0 mg/L+NAA 3.0 mg/L+KT 1.5 mg/L+ZT 1.5 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+蔗糖25 g/L；
（4）增殖培養(yǎng)：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)，光照3000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中，35-40 d轉(zhuǎn)接一次，循環(huán)往復(fù)，經(jīng)3-4個(gè)周期的培養(yǎng)，形成叢生芽；所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 7.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L+ZT 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L；
（5）壯芽培養(yǎng)：將步驟（4）得到的叢生芽進(jìn)行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，置于光培養(yǎng)，光照3000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中培養(yǎng)35-40 d，形成壯芽；所述的壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 3.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+蔗糖 25 g/L；
（6）生根培養(yǎng)：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中，余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復(fù)步驟（5），循環(huán)往復(fù)，獲得大量壯芽；生根培養(yǎng)是置于光培養(yǎng)，光照3000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中誘導(dǎo)生根，生根率為92%；所述的生根培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+蔗糖 30 g/L。
以上所述改良WPM培養(yǎng)基的組分和體積重量比為：NH4NO3 370mg/L，CaCl2·2H2O 82 mg/L，MgSO4·7H20 270 mg/L，KH2PO4 170 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.025 mg/L，Na2·EDTA 37.4 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇200 mg/L，煙酸0.5 mg/L，鹽酸吡哆醇0.5 mg/L，鹽酸硫胺素1.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
實(shí)施例3：
（1）外植體選擇：采集半木質(zhì)化、生長健壯的當(dāng)年生赤皮青岡嫩枝作為外植體；
（2）外植體處理：將外植體置于自來水下沖洗15 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時(shí)間20 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個(gè)腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)，備用；
（3）初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)、光照1000 lx，培養(yǎng)溫度20±1℃的環(huán)境中培養(yǎng)30-35 d，初始芽萌發(fā)、生長；所述的初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 6.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L+KT 2.0 mg/L+ZT 2.0 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+蔗糖25 g/L；
（4）增殖培養(yǎng)：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)，光照4000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中，35-40 d轉(zhuǎn)接一次，循環(huán)往復(fù)，經(jīng)3-4個(gè)周期的培養(yǎng)，形成叢生芽；所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 8.0 mg/L+NAA 3.0 mg/L+ZT 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L；
（5）壯芽培養(yǎng)：將步驟（4）得到的叢生芽進(jìn)行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，置于光培養(yǎng)，光照4000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中培養(yǎng)35-40 d，形成壯芽；所述的壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 4.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+蔗糖 25 g/L；
（6）生根培養(yǎng)：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中，余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復(fù)步驟（5），循環(huán)往復(fù)，獲得大量壯芽；生根培養(yǎng)是置于光培養(yǎng)，光照4000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中誘導(dǎo)生根，生根率為95%；；所述的生根培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 2.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+蔗糖 30 g/L。
以上所述改良WPM培養(yǎng)基的組分和體積重量比為：NH4NO3 370mg/L，CaCl2·2H2O 82 mg/L，MgSO4·7H20 270 mg/L，KH2PO4 170 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.025 mg/L，Na2·EDTA 37.4 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇200 mg/L，煙酸0.5 mg/L，鹽酸吡哆醇0.5 mg/L，鹽酸硫胺素1.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。