本發(fā)明屬于水果病蟲(chóng)害防治領(lǐng)域，具體涉及植物多酚在制備防治柑橘采后綠霉病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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柑橘綠霉病是柑橘采后果實(shí)最主要的病害，其造成的損失約占總損失的90％以上。目前生產(chǎn)上主要使用噻菌靈、抑霉唑等化學(xué)殺菌劑防治柑橘綠霉病，然而長(zhǎng)期使用這些藥劑常會(huì)引發(fā)病菌的抗藥性問(wèn)題，致使防治效果逐漸下降，甚至失效。此外，長(zhǎng)期大量使用化學(xué)殺菌劑，容易對(duì)環(huán)境和人類健康造成危害。

單寧是一類高等植物產(chǎn)生的天然多酚類物質(zhì)。已有研究表明，單寧對(duì)多種病原細(xì)菌、真菌具有較好的抑菌活性。本發(fā)明創(chuàng)造將豐富柑橘綠霉病的防治手段，降低對(duì)化學(xué)殺菌劑的依賴，提高柑橘果實(shí)的食用安全性，增加單寧的經(jīng)濟(jì)附加值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種單寧在制備抗指狀青霉菌Penicillium digitatum藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單寧對(duì)柑橘綠霉病菌指狀青霉菌Penicillium digitatum具有很好的抑制作用，其最小抑菌濃度MIC為1mg/ml。并且單寧能夠抑制指狀青霉菌Penicillium digitatum的萌發(fā)，對(duì)柑橘綠霉病的發(fā)生有很好的防治效果。

因此，本發(fā)明提供了單寧在制備抗指狀青霉菌Penicillium digitatum藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明第二個(gè)目的是提供單寧在制備防治柑橘綠霉病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種防治柑橘采后綠霉病的方法，其特征在于，包括以下步驟：

選無(wú)傷和無(wú)病蟲(chóng)斑痕的柑橘果實(shí)，將其浸泡于200～800μg/ml的單寧水溶液中1～3min，然后置于陰涼通風(fēng)處自然晾干，單果套袋包裝貯藏。

所述的200～800μg/ml的單寧水溶液是將單寧溶于水中，配置成相應(yīng)濃度即可。

優(yōu)選，是將柑橘果實(shí)浸泡于500μg/ml的單寧水溶液中2min。500μg/ml單寧對(duì)柑橘綠霉病的抑制率為70.3％，其處理的柑橘綠霉病發(fā)病率僅為2.3％。而清水對(duì)照處理的柑橘綠霉病發(fā)病率為7.6％。

本發(fā)明所采用的單寧是一種天然多酚類化合物，其對(duì)柑橘綠霉病菌指狀青霉菌Penicillium digitatum的孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)都具有較好的抑制作用，能夠顯著降低柑橘果實(shí)采后綠霉病的發(fā)生，有效延長(zhǎng)了柑橘果實(shí)的貯藏期，并且不影響柑橘果實(shí)品質(zhì)，在柑橘果實(shí)防腐保鮮領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的保藏處理方法簡(jiǎn)單，操作容易。

附圖說(shuō)明：

圖1是不同濃度單寧對(duì)柑橘綠霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果；

圖2是不同濃度單寧對(duì)柑橘綠霉病菌孢子萌發(fā)的影響；

圖3是接種后單寧處理對(duì)柑橘綠霉病菌防治效果；

圖4是單寧處理對(duì)柑橘果實(shí)病斑柑橘綠霉病菌DNA含量的影響；

圖5是單寧對(duì)柑橘綠霉病菌細(xì)胞壁完整性的影響。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：

一、實(shí)驗(yàn)材料和方法

實(shí)驗(yàn)材料：

將柑橘綠霉病菌菌株P(guān)enicillium digitatum接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA，馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1L)斜面上，25℃培養(yǎng)7d，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

單寧購(gòu)自天津市福晨化學(xué)試劑廠。

實(shí)驗(yàn)方法：

1、菌落生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)

將柑橘綠霉病菌Penicillium digitatum的孢子懸浮液(5μl 1×10⁶spores/ml)接種于含200、400、600、800和1000μg/ml單寧的PDA平板上，加入等量無(wú)菌水作為對(duì)照，25℃培養(yǎng)7d。十字交叉法測(cè)定菌落直徑。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。抑制率(％)＝(水對(duì)照菌落直徑-單寧處理菌落直徑)/水對(duì)照菌落直徑×100％。

將柑橘綠霉病菌Penicillium digitatum孢子懸浮液(5μl 1×10⁶spores/ml)接種于含200、400、600、800和1000μg/ml單寧的PDA平板上，加入等量無(wú)菌水作為對(duì)照，25℃培養(yǎng)培養(yǎng)3d。觀察柑橘綠霉病菌Penicillium digitatum的生長(zhǎng)情況，導(dǎo)致柑橘綠霉病菌Penicillium digitatum菌絲不能生長(zhǎng)的最低單寧濃度，即為單寧對(duì)柑橘綠霉病菌生長(zhǎng)的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，每個(gè)濃度設(shè)置三個(gè)重復(fù)。

2、孢子萌發(fā)抑制試驗(yàn)

將柑橘綠霉病菌Penicillium digitatum的孢子懸浮液(10μl 1×10⁴spores/ml)分別接種于含200、400和600μg/ml單寧的PDA培養(yǎng)基平板上，加入等量無(wú)菌水作為對(duì)照。25℃培養(yǎng)12h，顯微鏡觀察統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)情況。當(dāng)芽管長(zhǎng)度大于兩倍孢子長(zhǎng)度時(shí)視為孢子萌發(fā)。孢子萌發(fā)率(％)＝萌發(fā)孢子數(shù)/(萌發(fā)孢子數(shù)+未萌發(fā)孢子數(shù))×100％。每個(gè)處理至少觀察100個(gè)孢子。

3、接種試驗(yàn)

選無(wú)傷和無(wú)病蟲(chóng)斑痕的椪柑果實(shí)。用2％次氯酸鈉溶液浸泡椪柑果實(shí)5min，清水沖洗三次，晾干。用接種針在椪柑果實(shí)赤道面位置上扎一個(gè)傷口。將柑橘綠霉病菌Penicillium digitatum孢子懸浮液(10μl 1×10⁵spores/ml)接種于椪柑傷口處，接種果實(shí)于室溫下放置2h，然后在含500μg/ml單寧的水溶液中浸泡2min，等體積的清水浸果做對(duì)照。自然晾干，裝入塑料盒中，噴水保濕，室溫貯藏。貯藏7d觀察發(fā)病率。每個(gè)處理重復(fù)三次，每個(gè)重復(fù)處理10個(gè)果實(shí)。

用手術(shù)刀刮取傷口處病斑，測(cè)定病斑重量。采用CTAB法提取病斑處總DNA。取適量的病斑樣品，加入1ml CTAB，65℃溫浴1h，10000g，離心10min。取上清，加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)，震蕩混勻。10000g，離心1min。取上清，加入等體積異戊醇沉淀。10000g，離心10min。加入1ml 75％乙醇漂洗。10000g，離心10min。棄上清，晾干。加入50μl水溶解DNA，-20℃保存。

將柑橘綠霉病菌Penicillium digitatum孢子懸浮液(500μl 1×10⁶spores/ml)接種于100ml PDB培養(yǎng)基中，25℃，180rpm振蕩培養(yǎng)3d，無(wú)菌紗布過(guò)濾收集菌絲，液氮研磨，采用CTAB法提取柑橘綠霉病菌Penicillium digitatum菌絲基因組DNA，Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度。將柑橘綠霉病菌Penicillium digitatum菌絲基因組DNA用ddH₂O稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。使用Premix Ex Taq^TM Ⅱ熒光定量試劑盒，以標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，以Actin-F(CGTTCGTGACATCAAGGA)和Actin-R(ATACCGCCAGACTCAAGA)為引物，在480II熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR。10μl熒光定量PCR體系：模板1μl，熒光定量PCR上、下游引物各0.4μl，Premix Ex TaqⅡ5μl，ddH₂O 3.2μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性30s，95℃5s，60℃30s，循環(huán)40次。60-95℃程序升溫檢測(cè)融解曲線。根據(jù)熒光值的變化，建立柑橘綠霉病菌Penicillium digitatum Actin基因絕對(duì)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)重復(fù)3次。

依照上述方法對(duì)病斑處柑橘綠霉病菌的DNA進(jìn)行熒光定量PCR，每個(gè)DNA樣品做三個(gè)重復(fù)。根據(jù)起始拷貝數(shù)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算病斑處柑橘綠霉病菌DNA的含量。

4、機(jī)理研究

將柑橘綠霉病菌Penicillium digitatum孢子懸浮液(5μl 1×10⁶spores/ml)接種于含250μg/ml單寧和0.15‰SDS的PDA平板上，以不加單寧和SDS作為對(duì)照，25℃培養(yǎng)7d。十字交叉法測(cè)定菌落直徑并計(jì)算菌落生長(zhǎng)抑制率。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、單寧明顯抑制柑橘綠霉病菌菌絲生長(zhǎng)

圖1為不同濃度單寧對(duì)柑橘綠霉病菌Penicillium digitatum菌絲生長(zhǎng)的抑制效果。與無(wú)菌水對(duì)照相比，400μg/ml單寧對(duì)柑橘綠霉病菌Penicillium digitatum菌絲生長(zhǎng)的抑制率為40.8±2.6％。600μg/ml單寧對(duì)柑橘綠霉病菌Penicillium digitatum菌絲生長(zhǎng)的抑制率為67.2±4.0％。當(dāng)PDA培養(yǎng)基中單寧的終濃度達(dá)到800μg/ml時(shí)，抑制率高達(dá)83.9±2.0％。

MIC實(shí)驗(yàn)表明，單寧對(duì)柑橘綠霉病菌Penicillium digitatum生長(zhǎng)的最小抑菌濃度MIC為1mg/ml。

2、單寧抑制柑橘綠霉病菌孢子的萌發(fā)

柑橘綠霉病菌Penicillium digitatum孢子在不含單寧的PDA培養(yǎng)基上的萌發(fā)率為92％。而柑橘綠霉病菌Penicillium digitatum孢子在含400μg/ml單寧的PDA培養(yǎng)基上的萌發(fā)率為45％，相應(yīng)的孢子萌發(fā)抑制率為51％。當(dāng)PDA培養(yǎng)基中單寧的終濃度達(dá)到600μg/ml時(shí)，柑橘綠霉病菌的孢子都沒(méi)有萌發(fā)(圖2)。并且，孢子膨大變形。

3、單寧明顯降低柑橘綠霉病菌在柑橘果實(shí)傷口處的侵染

將柑橘綠霉病菌Penicillium digitatum孢子懸浮液分別接種于柑橘果實(shí)上，接種2h，用500μg/ml單寧水溶液浸果處理。室溫保濕培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。接種2d，接種柑橘綠霉病菌后浸水處理的柑橘果實(shí)傷口處出現(xiàn)明顯的水漬狀，而接種柑橘綠霉病菌Penicillium digitatum后單寧浸泡處理的柑橘果實(shí)傷口處并沒(méi)有上述癥狀。接種7d，單寧處理的柑橘果實(shí)病斑較小，病斑直徑僅為對(duì)照(接種后浸水處理)的60％左右(圖3)。

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)病斑處柑橘綠霉病菌DNA的含量。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y＝-3.0716X+22.954，其回歸系數(shù)R²＝0.995。溶解曲線表現(xiàn)為單一的峰。根據(jù)起始拷貝數(shù)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算病斑處柑橘綠霉病菌DNA的含量。接種7d，接種柑橘綠霉病菌后浸水處理的柑橘果實(shí)傷口處柑橘綠霉病菌基因組DNA含量高達(dá)205.83±7.44μg，而500μg/ml單寧對(duì)人工接種柑橘綠霉病菌的抑制率為90.5％，其對(duì)應(yīng)的柑橘綠霉病菌基因組DNA含量為19.58±1.72μg(圖4)。

4、單寧對(duì)柑橘綠霉病菌抑菌機(jī)理的研究

利用SDS脅迫，研究單寧對(duì)柑橘綠霉病菌Penicillium digitatum細(xì)胞壁完整性的影響(圖5)。在不添加單寧時(shí)，0.15‰SDS對(duì)柑橘綠霉病菌菌落生長(zhǎng)的抑制率僅為29.3％。當(dāng)添加250μg/ml單寧時(shí)，0.15‰SDS對(duì)柑橘綠霉病菌菌落生長(zhǎng)的抑制率高達(dá)58.9％。結(jié)果表明，單寧破壞了柑橘綠霉病菌細(xì)胞壁的完整性，導(dǎo)致柑橘綠霉病菌對(duì)SDS的敏感性更高。表明單寧通過(guò)破壞細(xì)胞壁的完整性，抑制柑橘綠霉病菌的生長(zhǎng)。

綜上所述，單寧通過(guò)破壞柑橘綠霉病菌細(xì)胞壁完整性，引起胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外滲，實(shí)現(xiàn)對(duì)菌落生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制作用。離體接種實(shí)驗(yàn)和貯藏實(shí)驗(yàn)表明500μg/ml單寧對(duì)柑橘綠霉病的發(fā)生有很好的防治效果。

實(shí)施例2

選無(wú)傷和無(wú)病蟲(chóng)斑痕的砂糖橘果實(shí)。采前一個(gè)月未噴施農(nóng)藥。將其浸泡于500μg/ml的單寧水溶液中2min，置于陰涼通風(fēng)處自然晾干，裝入塑料盒中，室溫貯藏。貯藏7d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。每個(gè)處理重復(fù)三次，每個(gè)重復(fù)處理100個(gè)果實(shí)。所述的500μg/ml的單寧水溶液是將500微克的單寧置于1ml水中，混合均勻后得到500μg/ml的單寧水溶液。貯藏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，清水對(duì)照處理的柑橘綠霉病發(fā)病率為7.6％。500μg/ml單寧水溶液對(duì)柑橘綠霉病的抑制率為70.3％，其處理的柑橘綠霉病發(fā)病率僅為2.3％。

實(shí)施例3

選擇成熟度達(dá)到商業(yè)要求的柑橘果實(shí)，將其浸泡于200μg/ml的單寧水溶液中3min，置于陰涼通風(fēng)處自然晾干，單果套袋包裝，貯藏。貯藏7d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。每個(gè)處理重復(fù)三次，每個(gè)重復(fù)處理100個(gè)果實(shí)。所述的200μg/ml的單寧水溶液是將200微克的單寧置于1ml水中，混合均勻后得到200μg/ml的單寧水溶液。貯藏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明。200μg/ml單寧對(duì)柑橘綠霉病的抑制率較好，其處理的柑橘綠霉病發(fā)病率較低。

實(shí)施例4

選擇成熟度達(dá)到商業(yè)要求的柑橘果實(shí)，將其浸泡于800μg/ml的單寧水溶液中1min，置于陰涼通風(fēng)處自然晾干，單果套袋包裝，貯藏。貯藏7d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。每個(gè)處理重復(fù)三次，每個(gè)重復(fù)處理100個(gè)果實(shí)。所述的800μg/ml的單寧水溶液是將800微克的單寧置于1ml水中，混合均勻后得到800μg/ml的單寧水溶液。800μg/ml單寧對(duì)柑橘綠霉病的抑制率較好，其處理的柑橘綠霉病發(fā)病率較低。