本發(fā)明屬于生物防治技術(shù)，具體涉及一種利用嗜線蟲桿菌與線蟲共生的原理，通過非離體培養(yǎng)與離體培養(yǎng)相互結(jié)合，穩(wěn)定生產(chǎn)小卷蛾斯氏線蟲f3代的新方法。
背景技術(shù)：
小卷蛾斯氏線蟲是一種以昆蟲為寄主的昆蟲病原線蟲。處于侵入期的昆蟲病原線蟲能自主尋找寄主，侵入寄主的線蟲從腸道中釋放昆蟲致病桿菌，桿菌在寄主中大量繁殖導(dǎo)致寄主迅速死亡。國(guó)際上常用于防治害蟲的昆蟲病原線蟲主要屬于斯氏線蟲屬和異小桿線蟲屬。斯氏線蟲有10個(gè)種，異小桿線蟲有3個(gè)種。在工業(yè)化國(guó)家生物農(nóng)藥市場(chǎng)上，市場(chǎng)份額僅次于蘇云金芽孢桿菌，占第二位。這類線蟲對(duì)土棲性害蟲和鉆蛀性害蟲有較強(qiáng)的殺滅作用。昆蟲病原線蟲可規(guī)?；囵B(yǎng)，且使用方便，對(duì)人畜安全，不污染環(huán)境，在美國(guó)是免注冊(cè)產(chǎn)品。我國(guó)已開發(fā)了不少殺蟲線蟲品種，目前處于中試推廣應(yīng)用階段，均無(wú)注冊(cè)成產(chǎn)品。
產(chǎn)業(yè)化昆蟲病原線蟲，需要高效，穩(wěn)定的病原線蟲培養(yǎng)方法。在美國(guó)、德國(guó)等生物農(nóng)藥發(fā)達(dá)的國(guó)家一般采用液體法培養(yǎng)昆蟲病原線蟲。而我國(guó)昆蟲病原線蟲產(chǎn)業(yè)化起步較晚，從事昆蟲病原線蟲產(chǎn)業(yè)化的企業(yè)采用都是固體培養(yǎng)和非離體培養(yǎng)。以上兩種方法各有其局限性，使用非離體培養(yǎng)法，經(jīng)過多代培養(yǎng)后培養(yǎng)基（蟲子尸體）易發(fā)霉，并且易染蠅蛆。采用離體培養(yǎng)法，經(jīng)多代培養(yǎng)后線蟲質(zhì)量退化，加上培養(yǎng)周期過長(zhǎng)原生嗜線蟲桿菌易轉(zhuǎn)變成次生桿菌。以上等等原因嚴(yán)重限制了昆蟲病原線蟲的的規(guī)?；囵B(yǎng)和影響了線蟲的品質(zhì)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服原來技術(shù)上培養(yǎng)周期28天導(dǎo)致嗜線蟲桿菌轉(zhuǎn)變?yōu)榇紊鷹U菌這一技術(shù)難題，本發(fā)明提供了一種利用嗜線蟲桿菌與線蟲共生的原理，通過非離體培養(yǎng)與離體培養(yǎng)相互結(jié)合，穩(wěn)定生產(chǎn)小卷蛾斯氏線蟲f3代的新方法。選取健康的大蠟螟末齡幼蟲，接種小卷蛾斯氏線蟲，一天后待大蠟螟死亡，挑選出來集中于通氣、恒溫、恒濕環(huán)境下培養(yǎng)10天，得到的線蟲為f0代。再將f0代線蟲接種到培養(yǎng)了2天嗜線蟲桿菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)10天得到繁殖后的線蟲作為f1代。最后將f1代接種于擴(kuò)大海綿培養(yǎng)基中，培養(yǎng)14天得到大量的f3代作為商品線蟲。本方法所生產(chǎn)的商品線蟲都是f3代線蟲，生產(chǎn)周期短，保證嗜線蟲桿菌不轉(zhuǎn)變成次生桿菌，從而保證品質(zhì)穩(wěn)定。
具體實(shí)施方式：
下面列舉了實(shí)例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明：
實(shí)施例1選取健康的大蠟螟末齡幼蟲1000條，將帶小卷蛾斯氏線蟲的海綿放入去離子水中，攪拌多次，將海綿挑出，顯微鏡檢測(cè)線蟲密度100萬(wàn)尾/ml，對(duì)1000條大蠟螟體表進(jìn)行接種。一天后待大蠟螟死亡，挑選一天死亡的大蠟螟，在恒溫25攝氏度下、90%濕度下恒濕環(huán)境下培養(yǎng)10天，得到的線蟲為f0代。將f0代從大蠟螟尸體內(nèi)用無(wú)菌去離子水浸出線蟲，再將線蟲用無(wú)菌生理鹽水清洗3-5次，離心分離。將去雜菌的f0代50萬(wàn)尾線蟲接種到培養(yǎng)了2天嗜線蟲桿菌的15mm營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿營(yíng)養(yǎng)蛋白胨10%，酵母膏5%，瓊脂2%，將培養(yǎng)皿用錫箔紙封嚴(yán)，培養(yǎng)10天得到繁殖后的線蟲作為f1代250萬(wàn)尾。選取無(wú)雜菌的f1代作種用線蟲，含雜菌的培養(yǎng)皿直接去除。最后將f1代接種于擴(kuò)大海綿培養(yǎng)基中，海綿培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)為蟲粉60%，速溶豆粉40%，蔗糖5%，豬油5%。培養(yǎng)14天繁殖2代，得到大量的f3代作為商品線蟲2.5億尾。
附圖1生產(chǎn)小卷蛾斯氏線蟲流程圖對(duì)照?qǐng)D。