本發(fā)明涉及通過組織培養(yǎng)技術(shù)的植物再生，具體涉及蘭科草本植物改良植株的培育方法。
背景技術(shù)：
鐵皮石斛dendrobiumofficina/ekimuraetmigo是傳統(tǒng)名貴珍稀中藥材，具有益胃生津、滋陰清熱等功效。野生鐵皮石斛生長緩慢、自然繁殖能力極低，由于近年來過度采挖和生態(tài)環(huán)境的不斷破壞，資源瀕臨滅絕。人工栽培鐵皮石斛已成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢。經(jīng)調(diào)查，目前其種苗來源絕大多數(shù)為種子無菌萌發(fā)獲得的試管苗，自由授粉致使鐵皮石斛栽培品系復(fù)雜，品種內(nèi)一致性差，世代之間遺傳穩(wěn)定性差。且試管苗多代繁殖變異較多、生存力低，導(dǎo)致種質(zhì)混亂，退化嚴(yán)重，藥材質(zhì)量不穩(wěn)定。研究表明栽培鐵皮石斛多糖和總生物堿含量差異主要來自遺傳變異，品種選育滯后是當(dāng)前鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。而且，試管苗經(jīng)過長期繼代，種苗長勢變差，易感病。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，炭疽病在鐵皮石斛種植區(qū)最為普遍、危害嚴(yán)重，發(fā)病率高達(dá)50％以上，且傳染性強(qiáng)，防治較為困難，嚴(yán)重影響鐵皮石斛藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量。半知菌亞門炭疽菌屬的膠孢炭疽菌(colletotrichumgloeosporioides)為鐵皮石斛炭疽病的主要致病菌，有較強(qiáng)的致病能力，因目前尚無對(duì)炭疽病等病害免疫的品種，而化學(xué)防治導(dǎo)致農(nóng)藥殘留和病原菌耐藥性等問題日益突出。因此，采用現(xiàn)代育種技術(shù)加速鐵皮石斛抗病新品種選育進(jìn)程已迫在眉睫。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種抗膠孢炭疽菌的鐵皮石斛的培育方法，該方法所培育出鐵皮石斛抗膠孢炭疽菌能力顯著增強(qiáng)。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的方案如下：
一種抗膠孢炭疽菌的鐵皮石斛的培育方法，該方法由以下步驟組成：
(1)選取鐵皮石斛飽滿、近成熟未開裂的蒴果，用體積濃度為75％酒精棉球擦拭，然后置于質(zhì)量濃度為0.1％汞溶液中消毒15min，再用無菌水沖洗4～5次；取出處理好的蒴果的種子接種于種胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于溫度為25±2℃、光照強(qiáng)度為2000lx的條件下培養(yǎng)90d，得到鐵皮石斛的原球莖；其中所述的種胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為每升含50g馬鈴薯汁的1/2ms培養(yǎng)基；
(2)將獲得的原球莖在超凈臺(tái)中加入體積濃度為0.3-0.4％的無菌ems(甲基磺酸乙酯)溶液，密閉并震蕩培養(yǎng)2-3h；接著，用質(zhì)量濃度為1％硫代硫酸鈉處理5s，再用無菌水反復(fù)漂洗后接種于原球莖培養(yǎng)基中，于溫度為25±2℃，光照強(qiáng)度為2000lx的條件培養(yǎng)45d；然后，挑選分化芽少、芽長健壯、顏色綠和無愈傷的原球莖；其中所述的原球莖培養(yǎng)基為：1/2ms+50g/l馬鈴薯汁+1g/l酸水解干酪素+0.8g/lhyponex4+2g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
(3)將經(jīng)步驟(2)培養(yǎng)的原球莖在溫度為25±2℃和光照強(qiáng)度為2000lx的條件下，依次用含50％與80％體積含量的膠孢炭疽菌粗毒素液的再生培養(yǎng)基培養(yǎng)30d；然后，剔除白化、黃化和根及葉片出現(xiàn)褐化的小苗，而將其余的小苗轉(zhuǎn)入所述再生培養(yǎng)基中繼續(xù)誘導(dǎo)分化30d；接著，將誘導(dǎo)分化后小苗移至壯苗生根培養(yǎng)基中，在溫度為25±2℃和光照強(qiáng)度為2000lx的條件下進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)60d，得到生根的壯苗；其中，
所述的再生培養(yǎng)基為：1/2ms+50.0g/l馬鈴薯汁+1.0g/l酸水解干酪素+0.8g/lhyponex4+naa1.0mg/l+6-ba0.5mg/l+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
所述的壯苗生根培養(yǎng)基為：1/2ms+50g/l馬鈴薯汁+1.0g/l酸水解干酪素+0.8g/lhyponex4+naa1.0mg/l+2g/l活性炭+30g/l蔗糖+10g/l瓊脂，ph值為5.8；
所述的膠孢炭疽菌粗毒素液由以下方法制得：
將經(jīng)過單胞純菌絲培養(yǎng)，illumina測序技術(shù)鑒定為colletotrichumgloeosporioides的膠孢炭疽菌菌株于pda培養(yǎng)基中活化，28℃連續(xù)培養(yǎng)7天；用打孔器取出3塊直徑5mm的菌餅于500ml液體改良察氏培養(yǎng)基中，在25±2℃和100-120r/min的條件下，振蕩搖床黑暗培養(yǎng)12d，濾去菌絲后，濾液經(jīng)10000rpm離心15min，取上清液無菌過濾，即得膠孢炭疽菌粗毒素液；其中所述的改良察氏培養(yǎng)基為：nano33g，k2hpo41g，kcl0.5g，feso40.01，蔗糖20g，蒸餾水1l；
(4)將經(jīng)步驟(3)培養(yǎng)的壯苗種植于田間，成活后先用解剖針在每片葉子上刺10針，然后涂抹孢子混懸液，每株接種5片葉子；20-25d后進(jìn)行病情調(diào)查，挑選健康的植株，即得抗膠孢炭疽菌的鐵皮石斛幼苗；其中
所述的膠孢炭疽菌孢子懸浮液由以下方法制得：將試管內(nèi)保存的炭疽菌，接種于pda平板培養(yǎng)基上，在28℃暗培養(yǎng)3-4天，挑取菌落邊緣菌絲，于pda平板上28℃暗培養(yǎng)10天，用滅菌的蒸餾水洗脫分生孢子，用消毒的毛筆輕刷菌落表面，過濾，收集孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使孢子的終濃度為1×106spores/ml，即得膠孢炭疽菌孢子懸浮液。
本發(fā)明所述方法培育出的鐵皮石斛具有發(fā)病率低，抗膠孢炭疽菌能力強(qiáng)的顯著效果。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1(抗膠孢炭疽菌的鐵皮石斛的培育方法).
1、準(zhǔn)備工作：
(1.1)按以下方法制備種胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基：
取1/2ms培養(yǎng)基，按每升種胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中馬鈴薯汁的含量為50g加入馬鈴薯汁混合均勻，即得。
(1.2)按以下方法制備原球莖培養(yǎng)基：
分別取1/2ms、50g/l馬鈴薯汁、1g/l酸水解干酪素、0.8g/lhyponex4、2g/l活性炭、30g/l蔗糖和10g/l1瓊脂混合均勻，加入1m氫氧化鈉或1m鹽酸調(diào)節(jié)ph值為5.8。
(1.3)按以下方法制備再生培養(yǎng)基：
分別取1/2ms、50.0g/l馬鈴薯汁、1.0g/l酸水解干酪素、0.8g/lhyponex4、naa1.0mg/l、6-ba0.5mg/l、2.0g/l活性炭、30g/l蔗糖和10g/l瓊脂混合均勻，加入1m氫氧化鈉或1m鹽酸調(diào)節(jié)ph值為5.8。
(1.4)按以下方法制備壯苗生根培養(yǎng)基：
分別取1/2ms、50g/l馬鈴薯汁、1.0g/l酸水解干酪素、0.8g/lhyponex4、naa1.0mg/l、2g/l活性炭、30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，加入1m氫氧化鈉或1m鹽酸調(diào)節(jié)ph值為5.8。
(1.5)按以下方法制備膠孢炭疽菌粗毒素液：
將經(jīng)過單胞純菌絲培養(yǎng)，illumina測序技術(shù)鑒定為colletotrichumgloeosporioides的膠孢炭疽菌菌株于pda培養(yǎng)基中活化，28℃連續(xù)培養(yǎng)7天；用打孔器取出3塊直徑5mm的菌餅于500ml液體改良察氏培養(yǎng)基中，在25±2℃和100-120r/min的條件下，振蕩搖床黑暗培養(yǎng)12d，濾去菌絲后，濾液經(jīng)10000rpm離心15min，取上清液無菌過濾，即得膠孢炭疽菌粗毒素液；其中所述的改良察氏培養(yǎng)基為：nano33g，k2hpo41g，kcl0.5g，feso40.01，蔗糖20g，蒸餾水1l。
(1.6)按以下方法制備膠孢炭疽菌孢子懸浮液：
將試管內(nèi)保存的炭疽菌，接種于pda平板培養(yǎng)基上，在28℃暗培養(yǎng)3-4天，挑取菌落邊緣菌絲，于pda平板上28℃暗培養(yǎng)10天，用滅菌的蒸餾水洗脫分生孢子，用消毒的毛筆輕刷菌落表面，過濾，收集孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使孢子的終濃度為1×106spores/ml，即得膠孢炭疽菌孢子懸浮液。
2、按以下步驟培育抗膠孢炭疽菌的鐵皮石斛
(2.1)原球莖誘導(dǎo)：
選取鐵皮石斛飽滿、近成熟未開裂的蒴果，用體積濃度為75％酒精棉球擦拭，然后置于質(zhì)量濃度為0.1％汞溶液中消毒15min，再用無菌水沖洗4～5次；取出處理好的蒴果的種子接種于種胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于溫度為25±2℃、光照強(qiáng)度為2000lx的條件下培養(yǎng)90d，得到鐵皮石斛的原球莖；
(2.2)ems誘變?cè)蚯o：
將獲得的原球莖在超凈臺(tái)中加入體積濃度為0.3％的無菌ems溶液，密閉并震蕩培養(yǎng)3h；接著，用質(zhì)量濃度為1％硫代硫酸鈉處理5s，再用無菌水反復(fù)漂洗后接種于原球莖培養(yǎng)基中，于溫度為25±2℃，光照強(qiáng)度為2000lx的條件培養(yǎng)45d；然后，挑選分化芽少、芽長健壯、顏色綠和無愈傷的原球莖；
(2.3)原球莖的分化：
將經(jīng)步驟(2)培養(yǎng)的原球莖在溫度為25±2℃和光照強(qiáng)度為2000lx的條件下，依次用含50％與80％體積含量的膠孢炭疽菌粗毒素液的再生培養(yǎng)基培養(yǎng)30d；然后，剔除白化、黃化和根及葉片出現(xiàn)褐化的小苗，而將其余的小苗轉(zhuǎn)入所述再生培養(yǎng)基中繼續(xù)誘導(dǎo)分化30d；接著，將誘導(dǎo)分化后小苗移至壯苗生根培養(yǎng)基中，在溫度為25±2℃和光照強(qiáng)度為2000lx的條件下進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)60d，得到生根的壯苗；
(2.4)采用針刺法進(jìn)行抗性篩選：
將經(jīng)步驟(3)培養(yǎng)的壯苗種植于田間，成活后先用解剖針在每片葉子上刺10針，然后涂抹孢子混懸液(即針刺法接種)，每株接種5片葉子；23d后進(jìn)行病情調(diào)查，挑選健康的植株，即得所述的抗膠孢炭疽菌的鐵皮石斛幼苗。
實(shí)施例2(不同原球莖培養(yǎng)基和再生培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果研究)
根據(jù)草本植物培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，培養(yǎng)基是培育效果的關(guān)鍵因數(shù)之一，而原球莖培養(yǎng)基和再生培養(yǎng)基又是最重要的兩種培養(yǎng)基，因此我們?cè)O(shè)計(jì)了11種原球莖培養(yǎng)基和12種再生培養(yǎng)基進(jìn)行了考察實(shí)驗(yàn)，最終確定了實(shí)施例1所述的原球莖培養(yǎng)基和再生培養(yǎng)基。具體實(shí)驗(yàn)過程如下所述：
1、原球莖培養(yǎng)基的考察實(shí)驗(yàn)
a、考察實(shí)驗(yàn)原球莖培養(yǎng)基：
原球莖培養(yǎng)基1：1/2ms+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
原球莖培養(yǎng)基2：1/2ms+50g/l馬鈴薯汁+1.0g/l酸水解干酪素+0.8g/lhyponex42.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
原球莖培養(yǎng)基3：1/2ms+0.5mg/l6-芐基腺嘌呤(6-ba)+50g/l馬鈴薯汁+1.0g/l酸水解干酪素+0.8g/lhyponex4+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
原球莖培養(yǎng)基4：1/2ms+1.0mg/l6-芐基腺嘌呤(6-ba)+50g/l馬鈴薯汁+1.0g/l酸水解干酪素+0.8g/lhyponex4+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
原球莖培養(yǎng)基5：1/2ms+50g/l馬鈴薯汁+0.8g/lhyponex4+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
原球莖培養(yǎng)基6：1/2ms+50g/l馬鈴薯汁+2.0g/l酸水解干酪素+0.8g/lhyponex4+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
原球莖培養(yǎng)基7：1/2ms+1.0g/l酸水解干酪素+0.8g/lhyponex4+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
原球莖培養(yǎng)基8：1/2ms+25g/l馬鈴薯汁+1.0g/l酸水解干酪素+0.8g/lhyponex4+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
原球莖培養(yǎng)基9：1/2ms+50g/l馬鈴薯汁+1.0g/l酸水解干酪素+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
原球莖培養(yǎng)基10：1/2ms+50g/l馬鈴薯汁+1.0g/l酸水解干酪素+0.4g/lhyponex4+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
原球莖培養(yǎng)基11：1/2ms+50g/l馬鈴薯汁+1.0g/l酸水解干酪素+1.2g/lhyponex4+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8。
上述11種原球莖培養(yǎng)基中1/2ms的配方為：按1000ml培養(yǎng)基計(jì)，硝酸鉀(kno3)950mg/l、硝酸銨(nh4no3)825mg/l、硫酸鎂(mgso4.7h2o)185mg/l、磷酸二氫鉀(kh2po4)85mg/l、氯化鈣(cacl2.2h2o)220mg/l、硫酸錳(mnso4.4h2o)22.3mg/l、硫酸鋅(znso4.4h2o)8.6mg/l、硼酸(h3bo3)6.2mg/l、碘化鉀(ki)0.83mg/l、鉬酸鈉(na2moo4.2h2o)0.25mg/l、硫酸銅(cuso4.5h2o)0.025mg/l、氯化鈷(cocl2.6h2o)0.025mg/l、硫酸亞鐵(feso4.7h2o)27.8mg/l、na2-edta37.3mg/l、甘氨酸2.0mg/l、鹽酸硫胺素0.1mg/l、鹽酸吡哆醇0.5mg/l、煙酸0.5mg/l、肌醇100mg/l。
b、考察實(shí)驗(yàn)方法
取按實(shí)施例1步驟(2.1)所培育是的原球莖2200粒，分成11組，分別在超凈臺(tái)中加入體積濃度為0.3％的無菌ems溶液，密閉并震蕩培養(yǎng)3h；接著，用質(zhì)量濃度為1％硫代硫酸鈉處理5s，再用無菌水反復(fù)漂洗后分別接種于上述11種原球莖培養(yǎng)基中，于溫度為25±2℃，光照強(qiáng)度為2000lx的條件培養(yǎng)45d；然后，觀察生長狀況并統(tǒng)計(jì)成活率，結(jié)果如下表1所示。
表1原球莖培養(yǎng)基中植物激素和添加物對(duì)ems誘變后原球莖生長的影響
由上表1可見，11種原球莖培養(yǎng)基中編號(hào)為2的效果最好，不僅成活率高達(dá)85.0％，而且原球莖分化芽少、顏色綠、芽長健壯、有根，無愈傷。
2、再生培養(yǎng)基的考察實(shí)驗(yàn)
a、考察實(shí)驗(yàn)再生培養(yǎng)基：
再生培養(yǎng)基1：1/2ms+1.0g/l酸水解干酪素+0.8g/lhyponex4+50g/l馬鈴薯汁+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
再生培養(yǎng)基2：1/2ms+0.5mg/l6-芐基腺嘌呤(6-ba)+0.5mg/l萘乙酸(naa)+1.0g/l酸水解干酪素+0.8g/lhyponex4+50g/l馬鈴薯汁+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
再生培養(yǎng)基3：1/2ms+0.5mg/l6-芐基腺嘌呤(6-ba)+1.0mg/l萘乙酸(naa)+1.0g/l酸水解干酪素+0.8g/lhyponex4+50g/l馬鈴薯汁+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
再生培養(yǎng)基4：1/2ms+1.0mg/l6-芐基腺嘌呤(6-ba)+0.5mg/l萘乙酸(naa)+1.0g/l酸水解干酪素+0.8g/lhyponex4+50g/l馬鈴薯汁+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
再生培養(yǎng)基5：1/2ms+1.0mg/l6-芐基腺嘌呤(6-ba)+1.0mg/l萘乙酸(naa)+1.0g/l酸水解干酪素+0.8g/lhyponex4+50g/l馬鈴薯汁+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
再生培養(yǎng)基6：1/2ms+1.5mg/l6-芐基腺嘌呤(6-ba)+0.5mg/l萘乙酸(naa)+0.8g/lhyponex4+50g/l馬鈴薯汁+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
再生培養(yǎng)基7：1/2ms+1.5mg/l6-芐基腺嘌呤(6-ba)+1.5mg/l萘乙酸(naa)+2.0g/l酸水解干酪素+0.8g/lhyponex4+50g/l馬鈴薯汁+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
再生培養(yǎng)基8：1/2ms+0.5mg/l6-芐基腺嘌呤(6-ba)+1.0mg/l萘乙酸(naa)+0.5g/l酸水解干酪素+0.8g/lhyponex4+50g/l馬鈴薯汁+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
再生培養(yǎng)基9：1/2ms+0.5mg/l6-芐基腺嘌呤(6-ba)+1.0mg/l萘乙酸(naa)+1.0g/l酸水解干酪素+0.8g/lhyponex4+50g/l馬鈴薯汁+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
再生培養(yǎng)基10：1/2ms+0.5mg/l6-芐基腺嘌呤(6-ba)+1.0mg/l萘乙酸(naa)+1.5g/l酸水解干酪素+0.8g/lhyponex4+50g/l馬鈴薯汁+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
再生培養(yǎng)基11：1/2ms+0.5mg/l6-芐基腺嘌呤(6-ba)+1.0mg/l萘乙酸(naa)+1.0g/l酸水解干酪素+0.4g/lhyponex4+50g/l馬鈴薯汁+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8；
再生培養(yǎng)基12：1/2ms+0.5mg/l6-芐基腺嘌呤(6-ba)+1.0mg/l萘乙酸(naa)+1.0g/l酸水解干酪素+1.2g/lhyponex4+50g/l馬鈴薯汁+2.0g/l活性炭+30g/l蔗糖和10g/l瓊脂，ph值為5.8。
上述12種再生培養(yǎng)基中的1/2ms的配方與原球莖培養(yǎng)基的考察實(shí)驗(yàn)中所述1/2ms的配方相同。
b、考察實(shí)驗(yàn)方法
取按實(shí)施例1步驟(2.2)誘變后的原球莖1200粒，分為12組，每組100粒，分別在溫度為25±2℃和光照強(qiáng)度為2000lx的條件下，依次用含50％與80％體積含量的膠孢炭疽菌粗毒素液的所述12種再生培養(yǎng)基培養(yǎng)30d進(jìn)行抗性篩選；然后，剔除白化、黃化和根及葉片出現(xiàn)褐化的小苗，而將其余的小苗轉(zhuǎn)入實(shí)施例1所述的再生培養(yǎng)基中繼續(xù)誘導(dǎo)分化30d；接著，將誘導(dǎo)分化后小苗移至實(shí)施例1所述的壯苗生根培養(yǎng)基中，在溫度為25±2℃和光照強(qiáng)度為2000lx的條件下進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)60d；最后，觀察所得到生根的壯苗生長狀況并統(tǒng)計(jì)成活率，結(jié)果如下表2所示。
表2不同再生培養(yǎng)基組分對(duì)鐵皮石斛小苗生長的影響
由上表2可見，12種再生培養(yǎng)基中編號(hào)為3的效果最好，不僅成活率高達(dá)85.0％，而且葉色綠，根多，叢生芽4-5，莖粗，長勢較為一致，株高達(dá)到4-5cm。
實(shí)施例3(抗膠孢炭疽菌效果及重復(fù)性研究)
1、實(shí)驗(yàn)方法
(1)取實(shí)施例1所述方法培育的抗膠孢炭疽菌的鐵皮石斛幼苗600株，分成實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)組3，每組200株；再取普通的鐵皮石斛幼苗(沒經(jīng)過誘變處理的)600株，分成對(duì)照組1、對(duì)照組2和對(duì)照組3，每組200株；
(2)于2011年9月，將實(shí)驗(yàn)組1和對(duì)照組1移栽至廣東省潮州市饒平縣新豐鎮(zhèn)的大田中，將實(shí)驗(yàn)組2和對(duì)照組2移栽至福建省漳州市南靖縣山城鎮(zhèn)的大田中，將實(shí)驗(yàn)組3和對(duì)照組3移栽至云南省紅河州彌勒市彌陽鎮(zhèn)的大田中；
(3)于2012年3月，分別對(duì)三地實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的鐵皮石斛先用解剖針在每片葉子上刺10針，然后涂抹孢子混懸液，每株接種5片葉子；23d后進(jìn)行病情調(diào)查，調(diào)查結(jié)果見下表1；
(4)于2013年9月，分別選擇步驟(3)中無病情的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的鐵皮石斛分別進(jìn)行異地(即交換地域)分株繁育(每組各200株)；于2014年3月，再按步驟(3)同樣的方法進(jìn)行病情調(diào)查，調(diào)查結(jié)果見下表2；
(5)于2015年9月，分別選擇步驟(4)中無病情的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的鐵皮石斛分別進(jìn)行異地(即再次交換地域)分株繁育(每組各200株)；于2016年3月，再按步驟(3)同樣的方法進(jìn)行病情調(diào)查，調(diào)查結(jié)果見下表3。
表1
表2
表3
上表1～3中的抗性級(jí)別的劃分方法如下所述：單株抗性分為0，1，2，3，4共五級(jí)：0級(jí)：無病斑；1級(jí)：輕微侵染，病斑直徑為0.2-0.3mm；2級(jí)：中度侵染，病斑直徑為0.4-0.5mm；3級(jí)：嚴(yán)重侵染，病斑直徑為0.6-0.8mm；4級(jí)：侵染非常嚴(yán)重，病斑直徑為0.8mm以上。
上表3結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組發(fā)病率比對(duì)照組降低86.5％以上，且侵染級(jí)別3級(jí)以上的比率(％)均為0，說明發(fā)病癥狀較輕，處于可控范圍，對(duì)鐵皮石斛的產(chǎn)量和質(zhì)量影響不大；實(shí)驗(yàn)組抗性級(jí)別0級(jí)的植株即抗病植株數(shù)最達(dá)190株，占試驗(yàn)總數(shù)的95.0％。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明所述培育方法的效率高，重復(fù)性好，且誘變后代易穩(wěn)定遺傳，具有較好的推廣價(jià)值。