本發(fā)明涉及亞氨基噻唑烷類化合物的新用途，具體地說，涉及2，3-二取代亞氨基噻唑烷類化合物的新用途。
背景技術(shù)：
在植物病害的綜合治理中，化學(xué)藥劑能夠有效地抑制病原物的生長、繁殖和侵染以及誘導(dǎo)寄主抗病性，從而控制病害的發(fā)生流行和為害。在世界范圍內(nèi)，每年使用化學(xué)藥劑可挽回15％～30％農(nóng)作物產(chǎn)量損失。與其它防治措施相比，化學(xué)防治具有防治范圍廣、見效快、成本低、使用方便，甚至多病兼治等優(yōu)點(diǎn)，因而化學(xué)防治已成為保護(hù)農(nóng)作物生產(chǎn)和健康不可缺少的重要措施。但是，隨著化學(xué)殺菌劑的廣泛、單獨(dú)和過量使用，許多病原菌如：水稻惡苗病菌、小麥赤霉病菌、油菜菌核病菌、蘋果炭疽病菌、黃瓜黑星病菌、番茄葉霉病菌、柑桔青霉菌等已相繼產(chǎn)生了抗藥性，并且抗藥性水平不斷升高，嚴(yán)重威脅到了化學(xué)防治的有效性。
在現(xiàn)有化學(xué)殺菌劑中，植物病原菌對苯并咪唑類殺菌劑的抗性最為突出，田間灰霉病菌(Botrytis cinerea)對多菌靈的中、高抗菌株的抗藥性倍數(shù)已達(dá)到262.7倍及1000倍以上，抗藥性頻率達(dá)到80％以上；小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)對多菌靈的抗藥性水平可穩(wěn)定遺傳，且抗性菌株適合度高，在田間逐漸成為優(yōu)勢種群。部分地區(qū)田間小麥白粉病菌(Erysiphe graminis f.sp.tritici)對三唑酮的敏感性已下降幾倍至幾十倍。部分地區(qū)地黃瓜和葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)已對甲霜胺普遍發(fā)生高度抗藥性。甲霜靈在歐洲防治黃瓜霜霉病(Pseudoperonospora cubensis)一年后，該病害對甲霜靈的抗藥性水平高達(dá)500倍。大量使用二甲酰亞胺殺菌劑(如：速克靈、農(nóng)利靈、菌核凈和異菌脲等)防治草莓灰霉病，兩年即產(chǎn)生抗藥性，防效明顯降低，造成大量爛果，甚至在田間鏈核盤菌(Monilinia fructicola)、核盤菌(Sclerotinia homoeocarpa)和白腐小核菌(Sclerotium cepivorum)等重要的植物病原真菌已出現(xiàn)既抗苯并咪唑類殺菌劑又抗二甲酰亞胺類殺菌劑的雙抗菌株。
綜上，農(nóng)用殺菌劑的抗藥性已經(jīng)成為農(nóng)藥工業(yè)所面臨的最突出的問題。研究和開發(fā)具有防病效果優(yōu)異、作用機(jī)制新穎、用量少且防效高或不易產(chǎn)生抗性的新藥劑，尤其是能夠降低現(xiàn)已產(chǎn)生抗性殺菌藥劑選擇壓力的新藥劑，是有效控制植物病害和延長現(xiàn)有殺菌劑使用壽命的重要措施。通過交替、輪換或復(fù)配使用，來減輕自然抗藥菌株對殺菌劑的抗藥風(fēng)險(xiǎn)，延緩或克服抗藥性的發(fā)生和發(fā)展。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
式I所示的2，3-二取代亞氨基噻唑烷類化合物為已知化合物(Phosphorus，Sulfur，and Silicon&the Related Elements，2006，181，2851-2861)。現(xiàn)該類已知化合物主要用于檢測油菜菌核病菌(CN 103571910A)。隨著研究的深入，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)：式I所示的2，3-二取代亞氨基噻唑烷類化合物不僅可以用于檢測油菜菌核病菌，而且對植物病原菌的草酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶-草酰乙酸酶的活力具有明顯的抑制作用(換而言之，其能抑制植物病原菌合成草酸(致病因子))。
此外，本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)：式I所示的2，3-二取代亞氨基噻唑烷類化合物可作為苯并咪唑類殺菌劑(如″多菌靈″(Carbendazim)等)、二甲酰亞胺類殺菌劑(如″異菌脲″(Iprodione)等)、麥角甾醇生物合成抑制劑(如″三唑醇″(Triadimenol)等)等農(nóng)用殺菌劑的增效劑。
式I中，R1～R5分別獨(dú)立選自：氫(H)，鹵素(F、Cl、Br或I)，甲基(CH3)或三氟甲基(CF3)中一種，且R1～R5不同時(shí)為H。
因此，本發(fā)明的目的在于，揭示式I所示的2，3-二取代亞氨基噻唑烷類化合物的新用途：
(1)式I所示的2，3-二取代亞氨基噻唑烷類化合物作為抑制植物病原菌中草酰乙酸酶活力的抑制劑的用途；或，式I所示的2，3-二取代亞氨基噻唑烷類化合物作為抑制植物病原菌合成草酸的抑制劑的應(yīng)用；和，
(2)式I所示的2，3-二取代亞氨基噻唑烷類化合物作為苯并咪唑類殺菌劑、二甲酰亞胺類殺菌劑和麥角甾醇生物合成抑制劑的增效劑的應(yīng)用。
附圖說明
圖1.為″氯噻唑烷″對植物病原菌中草酰乙酸酶活力抑制的柱狀圖。
具體實(shí)施方式
術(shù)語說明：本文中所述″氯噻唑烷″是式I中，R1，R2，R4和R5為H，R3為Cl的化合物(即3-(2-吡啶基)甲基-2-(4-氯苯基)亞氨基噻唑烷)的簡稱。
下面以氯噻唑烷為例，分別測定其對植物病原菌中草酰乙酸酶活力抑制活性，對植物病原菌草酸分泌的抑制活性，對植物病原菌的抑菌活性及對苯并咪唑類殺菌劑、二甲酰亞胺類殺菌劑和麥角甾醇生物合成抑制劑的增效效果。
其中，采用Wadley分析模型計(jì)算增效藥劑對目標(biāo)殺菌劑的增效比，Wadley分析模型的參考文獻(xiàn)分別為Wadley(1967)和Tak等(2016)。在該模型中，A和B為兩種殺菌藥劑，a和b是A和B兩殺菌組分在混劑中含量的比值，EC50為殺菌藥劑對植物病原菌生長的抑制中濃度，SR值為增效比。
計(jì)算公式為：EC50(理論值)＝(a+b)/[(a/EC50A)+(b/EC50B)]；
SR值＝EC50(理論值)/EC50(實(shí)測值)。
其中：SR≤0.5，表示拮抗作用；SR＝0.5-1.5，表示相加作用；SR≥1.5，表示增效作用。具體參見：(1)Wadley F M，Experimental statistics in entomology，Graduate School Press，USDA，Washington，DC.1967.和(2)Tak JH，Jovel E，Isman MB.Comparative and synergistic activity of Rosmarinus officinalis L.essential oil constituents against the larvae and an ovarian cell line of the cabbage looper，Trichoplusia ni(Lepidoptera：Noctuidae).Pest Manag.Sci.2016，72(3)，474-480。
實(shí)施例1
氯噻唑烷抑制植物病原菌(以油菜菌核病菌為例)中草酰乙酸酶活力的測定：
將油菜菌核病菌的菌碟(直徑6mm)接入含50μg/mL的氯噻唑烷的Watanabe培養(yǎng)基搖瓶中，置于25℃、180rpm條件下恒溫培養(yǎng)至2、4、6、8、10天，收集菌絲，用雙蒸水沖洗3次，雙層紗布過濾后，將菌絲放入已預(yù)冷的研缽中，加入2mL的0.1mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.0，含有1mmol/L的EDTA，1mmol/L的PMSF，1mmol/L的DTT)和適量石英砂在冰浴下勻漿，于4℃下14,000g離心30min，收集上清液作為粗酶。酶活力的測定反應(yīng)液包括0.1mL的粗酶液、0.1mL的1.0mmol/L草酰乙酸、0.05mL的0.3mmol/LMnCl2和2.8mL的0.1mol/L咪唑緩沖液(pH7.6)，加入草酰乙酸啟動反應(yīng)，反應(yīng)液在35℃水浴30min，而后在100℃下7min終止反應(yīng)，然后在波長340nm處測定每分鐘吸光度的降低值，連續(xù)記錄3min內(nèi)的OD值，計(jì)算酶活力。酶活力計(jì)算公式為U/mg＝(E255×3)/(0.0011×Ew)，式中：E255表示255nm處每分鐘內(nèi)吸光度的降低值，Ew表示酶液中含有的酶的含量(mg)，0.0011表示340nm處1μmoL的NADH的吸光度(參見圖1)。
實(shí)驗(yàn)表明：在培養(yǎng)至第8天時(shí)，對照組中草酰乙酸酶活力增強(qiáng)至348.68pkat/mg蛋白，而50μg/mL氯噻唑烷處理中草酰乙酸酶活力均約為110pkat/mg蛋白。即，到第8天時(shí)，草酰乙酸酶活力的抑制率為68％(參見圖1)。因此，氯噻唑烷對油菜菌核病菌中草酰乙酸酶的活力具有明顯的抑制作用。
實(shí)施例2
氯噻唑烷抑制植物病原菌(以油菜菌核病菌為例)草酸分泌的測定：
分別將油菜菌核病菌的菌碟(直徑6mm)接種于50mL含50μg/mL PMAS的PSB培養(yǎng)基搖瓶中，置于25℃、180rpm條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔1d收集0.2mL濾液，然后加入0.15mL溴酚藍(lán)溶液(1mmol/L)、0.099mL硫酸溶液(1.0mol/L)、0.176mL重鉻酸鉀溶液(100mmol/L)和2.5mL雙蒸水，搖勻。在60℃水浴中反應(yīng)10min后，加入0.6mL氫氧化鈉溶液(1.0mol/L)終止反應(yīng)，在波長為600nm處讀取OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算草酸的含量，具體結(jié)果見表1(不同處理時(shí)間中氯噻唑烷對油菜菌核病菌草酸分泌的影響)。
表1
實(shí)施例3
氯噻唑烷抑制植物病原菌活性的測定：
用融化的PSA培養(yǎng)基將氯噻唑烷母液稀釋成1.563、3.125、6.25、12.5、25、50和100μg/ml系列濃度，并在直徑為9.0cm的培養(yǎng)皿中制成含藥平板。在供試病原菌的菌落邊緣打取直徑為6.0mm菌碟，接種于含藥平板中央，置于25℃恒溫培養(yǎng)48h時(shí)，采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算氯噻唑烷對病原菌生長的抑制率(％)，采用最小二乘法計(jì)算氯噻唑烷抑制病原菌生長的EC50值，具體結(jié)果見表2.(氯噻唑烷對18種植物病原菌活性抑制數(shù)據(jù))。
表2.
續(xù)表2
由表2可知，氯噻唑烷對18種植物病原菌都具有一定程度的抑菌活性，其中對番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌等生長的抑制中濃度最小，作用48h時(shí)的EC50值分別為13.37和17.83μg/ml。氯噻唑烷對小麥赤霉病菌生長的抑制作用最弱，EC50值分別為41.16μg/ml。
實(shí)施例4
氯噻唑烷對苯并咪唑類殺菌劑的增效效果的測定(以油菜菌核病菌SS01為測試菌株)：
以油菜菌核病菌SS01為測試菌株，以廣泛應(yīng)用的苯并咪唑類殺菌劑的典型代表一″多菌靈″(Carbendazim)為殺菌劑。用融化的PSA培養(yǎng)基分別將多菌靈母液、氯噻唑烷母液、多菌靈+氯噻唑烷(1∶1，質(zhì)量比，下同)母液稀釋成0.098、0.196、0.392、0.784、1.563、3.125、6.25、12.5、25和50μg/ml系列濃度，并在直徑為9.0cm的培養(yǎng)皿中制成含藥平板。在油菜菌核病菌SS01(室內(nèi)長期保存的敏感菌株)的菌落邊緣打取直徑為6.0mm菌碟，接種于含藥平板中央，置于25℃恒溫培養(yǎng)48h時(shí)，采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算殺菌樣品抑制油菜菌核病菌SS01生長的EC50值。結(jié)果見表3.(多菌靈、氯噻唑烷、多菌靈+氯噻唑烷(1∶1)對油菜菌核病菌SS01的抑菌活性數(shù)據(jù))。
表3.
由表3可知，多菌靈+氯噻唑烷(1∶1)混合物對油菜菌核病菌SS01的抑菌活性顯著高于多菌靈或氯噻唑烷，所述混合物的增效系數(shù)達(dá)3.56，說明氯噻唑烷對多菌靈抑制油菜菌核病菌敏感菌株SS01具有增效作用。
實(shí)施例5
氯噻唑烷對苯并咪唑類殺菌劑的增效效果的測定(以油菜菌核病菌田間抗性菌株Hm25為測試菌株)：
以油菜菌核病菌田間抗性菌株Hm25為測試菌株，以廣泛應(yīng)用的苯并咪唑類殺菌劑的典型代表-″多菌靈″(Carbendazim)為殺菌劑。用融化的PSA培養(yǎng)基分別將多菌靈母液、氯噻唑烷母液、多菌靈+氯噻唑烷(1∶1)母液稀釋成系列濃度，其中多菌靈單劑濃度為25、50、100、200和400μg/ml；氯噻唑烷單劑濃度為6.125、6.25、12.5、25、50μg/ml；多菌靈+氯噻唑烷(1∶1)混合物濃度為6.25、12.5、25、50和100μg/ml。然后在直徑為9.0cm的培養(yǎng)皿中制成含藥平板。在油菜菌核病菌Hm25(采自上海市郊油菜田，經(jīng)室內(nèi)分離后獲得的抗性菌株)的菌落邊緣打取直徑為6.0mm菌碟，接種于含藥平板中央，置于25℃恒溫培養(yǎng)48h時(shí)，采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算殺菌樣品抑制油菜菌核病菌田間抗性菌株Hm25生長的EC50值。結(jié)果見表4(多菌靈、氯噻唑烷、多菌靈+氯噻唑烷(1∶1)對油菜菌核病菌田間抗性菌株Hm25的抑菌活性數(shù)據(jù))。
表4.
由表4可知，多菌靈+氯噻唑烷(1∶1)混合物對油菜菌核病菌田間抗性菌株Hm25生長的抑制中濃度(EC50)顯著低于多菌靈、稍高于氯噻唑烷，所述混合物的增效系數(shù)為1.64，說明氯噻唑烷對多菌靈抑制油菜菌核病菌田間抗性菌株Hm25同樣具有增效作用。
實(shí)施例6
氯噻唑烷對苯并咪唑類殺菌劑的增效效果的測定(以番茄灰霉病菌為測試菌種)：
用融化的PSA培養(yǎng)基分別將多菌靈母液、氯噻唑烷母液、多菌靈+氯噻唑烷(1∶1)母液稀釋成系列濃度，其中多菌靈單劑濃度為0.016、0.031、0.062、0.125、0.25、0.5、1.0和2.0μg/ml；氯噻唑烷單劑濃度為6.125、6.25、12.5、25、50μg/ml；多菌靈+氯噻唑烷(1∶1)混合物的濃度為0.016、0.031、0.062、0.125、0.25、0.5、1.0和2.0μg/ml。然后在直徑為9.0cm的培養(yǎng)皿中制成含藥平板。在番茄灰霉病菌的菌落邊緣打取直徑為6.0mm菌碟，接種于含藥平板中央，置于25℃恒溫培養(yǎng)48h時(shí)，采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算殺菌樣品抑制番茄灰霉病菌生長的EC50值。結(jié)果見表5(多菌靈、氯噻唑烷、多菌靈+氯噻唑烷(1∶1)對番茄灰霉病菌的抑菌活性數(shù)據(jù))。
表5.
由表5可知，多菌靈+氯噻唑烷(1∶1)混合物對番茄灰霉病菌的抑菌活性顯著高于多菌靈或氯噻唑烷，所述混合物的增效系數(shù)達(dá)2.76，說明氯噻唑烷對多菌靈抑制番茄灰霉病菌具有增效效果。
實(shí)施例7
氯噻唑烷對二甲酰亞胺類殺菌劑的增效效果的測定(以油菜菌核病菌SS01和油菜菌核病菌田間抗性菌株Hm25為測試菌株)：
以油菜菌核病菌SS01為測試菌株，以廣泛應(yīng)用的二甲酰亞胺類殺菌劑的典型代表-″異菌脲″(Iprodione)為殺菌劑。用融化的PSA培養(yǎng)基分別將異菌脲母液、氯噻唑烷母液、異菌脲+氯噻唑烷(1∶1)母液稀釋成系列濃度，其中異菌脲單劑濃度為0.032、0.064、0.127、0.313、0.625、1.25和2.5μg/ml；氯噻唑烷單劑濃度為6.125、6.25、12.5、25、50μg/ml；異菌脲+氯噻唑烷(1∶1)混合物的濃度為0.032、0.064、0.127、0.313、0.625、1.25和2.5μg/ml。然后在直徑為9.0cm的培養(yǎng)皿中制成含藥平板。在油菜菌核病菌SS01的菌落邊緣打取直徑為6.0mm菌碟，接種于含藥平板中央，置于25℃恒溫培養(yǎng)48h時(shí)，采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算殺菌樣品抑制油菜菌核病菌SS01生長的EC50值，結(jié)果見表6a(異菌脲+氯噻唑烷(1∶1)混劑對油菜菌核病菌SS01的抑菌活性數(shù)據(jù))。
表6a.
以油菜菌核病菌田間抗性菌株Hm25替換油菜菌核病菌SS01，重復(fù)上述步驟。計(jì)算殺菌樣品抑制油菜菌核病菌田間抗性菌株Hm25生長的EC50值，結(jié)果見表6b(異菌脲+氯噻唑烷(1∶1)混合物對油菜菌核病菌田間抗性菌株Hm25的抑菌活性數(shù)據(jù))。
表6b.
由表6a可知，異菌脲+氯噻唑烷(1∶1)混合物對油菜菌核病菌SS01生長的抑制中濃度(EC50)顯著低于異菌脲和氯噻唑烷，所述混合物的增效系數(shù)為2.41，說明氯噻唑烷對異菌脲抑制油菜菌核病菌SS01生長具有增效作用。
同樣，由表6b可知，異菌脲+氯噻唑烷(1∶1)混合物對油菜菌核病菌Hm25生長的抑制中濃度(EC50)等于異菌脲，而顯著低于氯噻唑烷，所述混合物的增效系數(shù)為2.05，說明氯噻唑烷對異菌脲抑制油菜菌核病菌Hm25同樣具有增效作用。
實(shí)施例8
氯噻唑烷對麥角甾醇生物合成抑制劑的增效效果的測定(以油菜菌核病菌SS01和油菜菌核病菌田間抗性菌株Hm25為測試菌株)：
以油菜菌核病菌SS01為測試菌株，以廣泛應(yīng)用的麥角甾醇生物合成抑制劑的商品化品種一三唑醇(Triadimenol)為例。用融化的PSA培養(yǎng)基分別將三唑醇母液、氯噻唑烷母液、三唑醇+氯噻唑烷(1∶1)母液稀釋成系列濃度，其中三唑醇單劑濃度為0.032、0.064、0.127、0.313、0.625、1.25和2.5μg/ml；氯噻唑烷單劑濃度為6.125、6.25、12.5、25、50μg/ml；三唑醇+氯噻唑烷(1∶1)混合物的濃度為0.032、0.064、0.127、0.313、0.625、1.25和2.5μg/ml。然后在直徑為9.0cm的培養(yǎng)皿中制成含藥平板。在油菜菌核病菌的菌落邊緣打取直徑為6.0mm菌碟，接種于含藥平板中央，置于25℃恒溫培養(yǎng)48h時(shí)，采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算供試藥劑抑制油菜菌核病菌多菌靈敏感菌株生長的EC50值，結(jié)果見表7a(三唑醇+氯噻唑烷(1∶1)混合物對油菜菌核病菌SS01的抑菌活性數(shù)據(jù))。
表7a.
以油菜菌核病菌田間抗性菌株Hm25替換油菜菌核病菌SS01，重復(fù)上述步驟。計(jì)算殺菌樣品抑制油菜菌核病菌田間抗性菌株Hm25生長的EC50值，結(jié)果見表7b(三唑醇+氯噻唑烷(1∶1)混合物對油菜菌核病菌田間抗性菌株Hm25的抑菌活性數(shù)據(jù))。
表7b.
由表7a可知，三唑醇+氯噻唑烷(1∶1)混合物對油菜菌核病菌SS01生長的抑制中濃度(EC50)低于三唑醇和氯噻唑烷，所述混合物的增效系數(shù)為3.27，說明氯噻唑烷對異菌脲抑制油菜菌核病菌SS01生長具有增效作用。
同樣，由表7b可知，三唑醇+氯噻唑烷(1∶1)混合物對油菜菌核病菌Hm25生長的抑制中濃度(EC50)高于異菌脲、顯著低于氯噻唑烷，混合物的增效系數(shù)為0.68，說明氯噻唑烷對三唑醇抑制油菜菌核病菌Hm25具有相加作用。
以上以氯噻唑烷為例，說明了本發(fā)明所述2，3-二取代亞氨基噻唑烷類化合物(式I所示化合物)對植物病原菌中草酰乙酸酶活力具有抑制作用，能抑制植物病原菌的草酸分泌，對植物病原菌具有抑菌活性，可作為苯并咪唑類殺菌劑、二甲酰亞胺類殺菌劑和麥角甾醇生物合成抑制劑的增效劑。式I中所包含的其它化合物具有同樣功效，限于篇幅，恕不在此一一贅述。