本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大烏嘴金針菜的提純復(fù)壯方法。

背景技術(shù)：

金針菜又名“黃花菜”，屬百合科萱草屬植物，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，與香菇、木耳、冬筍，同為素菜中的珍品。主要分布在江蘇、湖南、湖北、四川等地，宿遷是江蘇省金針菜主要產(chǎn)地之一，尤以“大烏嘴”花蕾長(zhǎng)而粗壯，色澤黃亮，肉質(zhì)緊實(shí)，口感甜香脆，品質(zhì)優(yōu)而聞名中外；然而，由于一直采用傳統(tǒng)的栽培技術(shù)，忽視了大烏嘴的提純復(fù)壯工作，導(dǎo)致其混雜嚴(yán)重、種性退化、品質(zhì)和產(chǎn)量下降；針對(duì)這一問(wèn)題，本發(fā)明提供一種大烏嘴金針菜組培快繁方法，包括外植體的建立、啟動(dòng)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗和移栽等步驟。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)背景技術(shù)中的不足，提供一種大烏嘴金針菜的提純復(fù)壯方法，目的在于：促使大烏嘴金針菜能在短期內(nèi)進(jìn)行快速繁殖，在繁殖的過(guò)程中保持大烏嘴金針菜的原種性、穩(wěn)定性及一致性。

本發(fā)明的目的是通過(guò)如下途徑實(shí)現(xiàn)的：

一種大烏嘴金針菜的提純復(fù)壯方法，包括如下步驟：

（1）金針菜母株選擇

選擇環(huán)境：需在連續(xù)晴天為3天以上的上午，無(wú)大風(fēng)和空氣污染的情況下；

對(duì)母株的形態(tài)要求：具有典型性狀，無(wú)病害，形態(tài)健壯；

取株要求：離根部5cm處挖出整株，輕輕抖落根部泥土，減少植株表面附帶的微生物和害蟲(chóng)；

（2）外植體剝?nèi)?/p>

剝?nèi)ネ鈱尤~片，用刀片切取莖尖作為外植體，注意刀口要平整，切割次數(shù)盡量少，一般大小約為0.5cm*0.5cm*0.5cm；

（3）對(duì)外植體進(jìn)行消毒

將莖尖放入大燒杯中，用水搖晃沖洗3次后，加入質(zhì)量濃度3%洗衣粉或洗潔精溶液，再放在水龍頭下，流水沖洗2小時(shí)后用鑷子夾取，之后再用無(wú)菌水沖洗3次，然后放入3%的山農(nóng)一號(hào)殺滅劑，滅菌18小時(shí)；

（4）初代培養(yǎng)

在無(wú)菌濾紙上將表面滅菌處理后的外植體擦干，切除外表皮，之后放入初代培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；3天后觀察有無(wú)污染，7～15天后，幼芽生出；所述初代培養(yǎng)基包括ms4.74g/l+蔗糖20g/l+瓊脂粉8g/l，ph5.8～6.0；

（5）增殖培養(yǎng)

將初代培養(yǎng)生出的幼芽切割掉，留下莖尖部分接入到增殖培養(yǎng)基1中進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)周期為45～60天，誘導(dǎo)出愈傷組織，然后再放入增殖培養(yǎng)基2中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為45～60天，誘導(dǎo)出新芽；所述增殖培養(yǎng)基1包括ms4.74g/l+6-ba3.0mg／l+naa0.3～0.5mg／l+蔗糖20g/l+瓊脂粉8g/l，ph5.8～6.0；所述增殖培養(yǎng)基2包括ms4.74g/l+6-ba3.0mg／l+naa0.1～0.2mg／l+蔗糖20g/l+瓊脂粉8g/l，ph5.8～6.0；

（6）壯苗培養(yǎng)

將經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)基2培養(yǎng)后的幼芽上的愈傷去除后，接入壯苗培養(yǎng)基中，培養(yǎng)周期為20～30天后，幼苗高度可達(dá)2～5cm；所述壯苗培養(yǎng)基包括ms4.74g/l+蔗糖20g/l+瓊脂粉8g/l，ph5.8～6.0；

（7）生根培養(yǎng)

將經(jīng)過(guò)壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)后的幼苗中生長(zhǎng)健壯、葉色正常、葉片舒展、適于生根的無(wú)根苗，接種在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)20～30天后幼苗基部長(zhǎng)出數(shù)根新根；所述生根培養(yǎng)基包括1/2ms39.3g/l+naa0.2mg/l（或者iba0.2mg/l）+蔗糖20g/l+瓊脂粉8g/l,ph5.8～6.0；

（8）組培苗煉苗移栽

①組培苗選取標(biāo)準(zhǔn)

幼苗基部長(zhǎng)出3條以上、長(zhǎng)1～3cm的新根，長(zhǎng)勢(shì)好、色白健壯，基本無(wú)愈傷組織，苗高一般3～5cm，葉片數(shù)一般不少于3片，作為組培苗；

②組培苗煉苗

將選取的組培苗，進(jìn)行煉苗處理，先旋松瓶蓋1～3天，然后打開(kāi)瓶蓋2～4天，之后煉苗3～7天；

③移瓶

用手指或鑷子輕輕取出瓶中的組培苗，放入清水內(nèi)洗去瓊脂，并將其進(jìn)行分級(jí)等待移栽，冬季水溫為20℃～25℃；

④組培苗定植

將經(jīng)過(guò)移瓶清洗的組培苗放入混合基質(zhì)的穴盤中，首先用竹簽在混合基質(zhì)的穴盤每個(gè)穴位上打下能容納根系的孔，然后再把組培苗逐一放入每個(gè)穴位的孔中，最后覆土壓實(shí)，分類，分日期擺放整齊；

所述混合基質(zhì)包括泥碳土、珍珠巖和蛭石，三者的體積比為3：1：1，此時(shí)組培苗成了穴盤苗；

（9）穴盤苗煉苗

將穴盤苗放在溫室大棚中，先用遮陽(yáng)網(wǎng)覆蓋，第一天上午8：00-10:00進(jìn)行采光、通風(fēng)，然后每日逐漸增加采光和通風(fēng)時(shí)間，7天后，待穴盤苗長(zhǎng)出新根后，進(jìn)行正常的管理，溫度保持在15～25℃，相對(duì)濕度保持在60～80%，移栽第4周～8周，每周噴施葉面肥一次，氮:磷:鉀=15:15:15，濃度為1000倍，移栽8周后，視穴盤苗生長(zhǎng)情況，濃度逐漸增加；培育2～3個(gè)月，穴盤苗長(zhǎng)至10～15cm，苗健壯、挺拔和新鮮，葉片在8片葉以上。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、成本低、能有效的促使大烏嘴金針菜在短期內(nèi)進(jìn)行快速繁殖，在繁殖的過(guò)程中保持大烏嘴金針菜的原種性、穩(wěn)定性及一致性，采用本發(fā)明的方式進(jìn)行組織培養(yǎng)，在穴盤中培育2～3個(gè)月后，穴盤苗長(zhǎng)至10～15cm，苗健壯、挺拔和新鮮，葉片在8片葉以上，形態(tài)完整，葉片大小協(xié)調(diào)，葉色具原品種特性，有光澤，具有完整而發(fā)達(dá)的根系，根系充滿穴盤孔，能輕易拔出而基質(zhì)不散，同一批次90%以上的苗高達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，并且無(wú)病蟲(chóng)害，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)反復(fù)研究表明，本發(fā)明重復(fù)利用率高，適合宿遷地區(qū)大面積區(qū)域種植。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。

實(shí)施例

準(zhǔn)備工作，購(gòu)買濟(jì)南普朗特生物科技有限公司生產(chǎn)的山農(nóng)一號(hào)（iii型），許可證號(hào)：201300720；購(gòu)買上海雨涵生物科技有限公司生產(chǎn)的ms培養(yǎng)基，編號(hào)為a0025-500g；購(gòu)買濟(jì)南普朗特生物科技有限公司生產(chǎn)的1/2ms干粉培養(yǎng)基，許可號(hào)：20120805；制作初代培養(yǎng)基：稱取ms4.74g/l+蔗糖20g/l+瓊脂粉8g/l溶于蒸餾水中，調(diào)節(jié)ph5.8～6.0；制作增殖培養(yǎng)基1：在制作完成的初代培養(yǎng)基中+6-ba3.0mg／l+naa0.3～0.5mg／l，制作增殖培養(yǎng)基2：在制作完成的初代培養(yǎng)基中+6-ba3.0mg／l+naa0.1～0.2mg／l；制作壯苗培養(yǎng)基：與初代培養(yǎng)基相同；制作生根培養(yǎng)基：1/2ms39.3g/l+naa0.2mg/l或iba0.2mg/l+蔗糖20g/l+瓊脂粉8g/l溶于蒸餾水中，調(diào)節(jié)ph5.8～6.0；所述一種大烏嘴金針菜的提純復(fù)壯方法，包括如下步驟：（1）金針菜母株選擇：需在連續(xù)晴天為3天以上的上午，無(wú)大風(fēng)和空氣污染的情況下；母株具有典型性狀，無(wú)病害，形態(tài)健壯；離根部5cm處挖出整株，輕輕抖落根部泥土，減少植株表面附帶的微生物和害蟲(chóng)；（2）外植體剝?nèi)。簞內(nèi)ネ鈱尤~片，用刀片割去根系2-5cm，直接剝?nèi)∏o尖做外植體，一般大小約為0.5cm*0.5cm*0.5cm；（3）外植體消毒:將莖尖放入大燒杯中，用水搖晃沖洗3次后，加入質(zhì)量濃度3%洗衣粉或洗潔精溶液，流水沖洗2小時(shí)后用鑷子夾取，之后再用無(wú)菌水沖洗3次，然后放入3%的山農(nóng)一號(hào)殺滅劑，滅菌18小時(shí)；所述山農(nóng)一號(hào)是一種殺滅劑，可以直接從市場(chǎng)中買到；（4）初代培養(yǎng)，用無(wú)菌濾紙將滅菌處理后的外植體表面擦干，在不銹鋼托盤上切割掉外表層，之后放入初代培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；3天后檢查有無(wú)污染，初代培養(yǎng)7～15天后，幼芽生出；（5）增殖培養(yǎng)：將初代培養(yǎng)生出的幼芽切除，留下莖尖部分接種到增殖培養(yǎng)基1中進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)周期為45～60天，誘導(dǎo)出愈傷組織，然后再放入增殖培養(yǎng)基2中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為45～60天，誘導(dǎo)出新芽；（6）壯苗培養(yǎng)：將經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)后的新芽上的愈傷切除后，接入壯苗培養(yǎng)基中，培養(yǎng)周期為20～30天后，幼苗高度可達(dá)2～5cm；（7）生根培養(yǎng)：選取經(jīng)過(guò)壯苗培養(yǎng)后的幼苗中生長(zhǎng)健壯、葉色正常、葉片舒展、適于生根的無(wú)根苗，接種在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)20～30天后幼苗基部長(zhǎng)出數(shù)根新根；（8）組培苗煉苗移栽：①組培苗選取標(biāo)準(zhǔn)：幼苗基部長(zhǎng)出3條以上、長(zhǎng)1～3cm的新根，長(zhǎng)勢(shì)好、色白健壯，根長(zhǎng)適中，基本無(wú)愈傷組織，苗高一般3～5cm，葉片數(shù)一般不少于3片；②煉苗：將選取的組培苗，先旋松瓶蓋1～3天，然后打開(kāi)瓶蓋2～4天，之后煉苗3～7天；③移瓶：用手指或鑷子輕輕取出瓶中的組培苗，放入清水內(nèi)洗去瓊脂，并將其進(jìn)行分級(jí)等待移栽，冬季水溫為20℃～25℃；④定植：將經(jīng)過(guò)移瓶清洗的組培苗移入混合基質(zhì)的穴盤中，首先用竹簽在混合基質(zhì)的穴盤每穴中間打下能容納根系的孔，然后再把組培苗逐一放入孔中，最后覆土壓實(shí)，分類，分日期擺放整齊；所述混合基質(zhì)包括泥碳土、珍珠巖和蛭石，三者之間的比例為3：1：1，此時(shí)完成組培苗向穴盤苗轉(zhuǎn)化；（9）穴盤苗煉苗：將穴盤苗放在溫室大棚中，先用遮陽(yáng)網(wǎng)覆蓋，第一天上午8：00-10：00進(jìn)行采光、通風(fēng)，然后每日逐漸增加采光和通風(fēng)時(shí)間，7天后，待穴盤苗長(zhǎng)出新根后，進(jìn)行正常的管理，溫度保持在15～25℃，相對(duì)濕度保持在60～80%，移栽第4周～8周，每周噴施葉面肥（氮:磷:鉀=15:15:15，濃度為1000倍）一次，移栽8周后，視穴盤苗生長(zhǎng)情況，濃度逐漸增加；培育2～3個(gè)月，穴盤苗長(zhǎng)至10～15cm，苗健壯、挺拔和新鮮，葉片在8片葉以上。

說(shuō)明書(shū)中ms是指上海雨涵生物科技有限公司生產(chǎn)的ms培養(yǎng)基，編號(hào)為a0025-500g；6-ba是指6-芐氨基腺嘌呤；naa是指萘乙酸；iba是指吲哚丁酸。