【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及植物培育繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種組織培養(yǎng)快速繁育杉木的方法。

背景技術(shù)：

木為杉科杉木屬常綠喬木，又名刺杉，杉木是我國特有的常綠針葉樹種之一，杉木生長快，一般8-15年即可成材。杉木分布廣泛，遍及我國境內(nèi)整個(gè)亞熱帶地區(qū)，栽培區(qū)域達(dá)16個(gè)省(自治區(qū))，東至浙江，福建，西至云南，四川盆地西緣及安寧河流區(qū)域，南至廣東中部和廣西中南部，北至秦嶺南麓。杉木生長快，干形通直圓滿，又以良好的材性，美觀的木材紋理著稱，杉木材廣泛應(yīng)用于建筑，家具，器具，造船等方面，是我國重要的商品用材造林樹種。自1960年代以來，杉木良種選育研究，已培育出一大批優(yōu)良種源、家系和優(yōu)良無性系供造林使用，為我國速生豐產(chǎn)林建設(shè)作出了重要貢獻(xiàn)。但由于造林面積的迅速增加，社會(huì)上對(duì)杉木優(yōu)良種苗的需求極為迫切。杉木良種種苗的供應(yīng)不足，嚴(yán)重地制約著杉木人工林的發(fā)展。

杉木通常以種子進(jìn)行繁殖，插條進(jìn)行繁殖，作為杉木傳統(tǒng)育苗方式有許多缺陷，如苗木參差不齊，育苗成本高，分化明顯，后代變異極大等，這嚴(yán)重制約了許多優(yōu)質(zhì)品種的推廣應(yīng)用。由于杉木輪代期較長，從長遠(yuǎn)利于發(fā)展應(yīng)用組培技術(shù)加速繁育杉木優(yōu)株及優(yōu)質(zhì)后代，對(duì)發(fā)揮杉木優(yōu)株的當(dāng)代優(yōu)勢。同時(shí)組培苗的研究成功緩解杉木豐產(chǎn)林營建的良種需求，加快杉木育種進(jìn)程和提高林地效益具有重要的意義

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于，提供一種組織培養(yǎng)快速繁育杉木的方法，本發(fā)明的組織培養(yǎng)快速繁育杉木的方法在含有不同激素配比的ms培養(yǎng)基上誘導(dǎo)杉木的愈傷組織，通過誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基以及生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)，各培養(yǎng)基提供外植體在生根壯苗期間所需的因子，能夠提供生根的良好條件，促進(jìn)苗健康茁壯，獲得杉木的再生苗，其培養(yǎng)方法取材方便，成本低、操作簡單，擴(kuò)繁速度快，繁殖系數(shù)高，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益，適用于規(guī)模化生產(chǎn)。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用了如下的技術(shù)方案：

一種組織培養(yǎng)快速繁育杉木的方法，具體包括如下步驟：

(一)外植體的預(yù)處理：剪取經(jīng)過環(huán)割根部新長嫩芽枝條為外植體，將外植體剪成5-7cm的枝條，用75％酒精浸泡12-16s，然后用洋蔥汁浸泡30-50min，浸泡期間不斷用玻璃棒進(jìn)行攪拌，浸泡完成后用無菌水將外植體沖洗5-7次，然后將外植體放在超凈工作臺(tái)上待其表面水分自然風(fēng)干，切除外植體的葉片以及舊切口，然后切成1.5-2cm帶2個(gè)腋芽莖段，再用2％次氯酸鈉處理8-10min，無菌水沖洗3-5次，用濾紙吸干帶腋芽莖段，得到組織培養(yǎng)的外植體備用；

(二)培養(yǎng)基的培養(yǎng)：

(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)：將上述步驟獲得的外植體先接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)35-40天，按黑暗和光照時(shí)間比為1:8進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織分化形成不定芽；

所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有ms培養(yǎng)基+1.5mg/lkt+0.5mg/l6-ba+0.1mg/liba+200mg/lca(no3)；

(2)繼代增殖培養(yǎng)：將步驟(1)所述不定芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)35-40天，獲得繼代苗；

所述增殖培養(yǎng)基的成分為：ms+1.0mg/lkt+0.2mg/l6-ba+0.1mg/liba+200mg/lca(no3)；

(3)生根培養(yǎng)：將經(jīng)步驟(2)增殖培養(yǎng)得到的繼代苗接種到生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)15-20天后獲得生根苗，然后將生根苗轉(zhuǎn)到煉苗室進(jìn)行煉苗；

所述生根培養(yǎng)基的成分為：ms+1.0mg/labt+0.2mg/liba。

優(yōu)選地，所述組織培養(yǎng)方法還包括外植體準(zhǔn)備的步驟，具體為：選擇單株、優(yōu)株杉木作為母本，將母本進(jìn)行根部環(huán)割處理，待根部長出嫩芽后，采摘其嫩芽枝條作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，所述嫩芽枝條為4-8月份萌發(fā)的半木質(zhì)化枝條，所述嫩芽是在天氣晴好至少3-4天后進(jìn)行采摘的。

優(yōu)選地，所述組織培養(yǎng)方法還包括生根苗移栽的步驟，具體為：煉苗20-30天待根系由白色轉(zhuǎn)變成灰白色后，將生根苗進(jìn)行移栽，移栽時(shí)先將生根苗置于清水中漂洗，洗凈根部的培養(yǎng)基，晾干根系的表面水分，將生根苗栽入裝有的混合基質(zhì)容器中培養(yǎng)，所述混合基質(zhì)是由體積比為1：2的蛭石粉與椰糠混合而成。

優(yōu)選地，步驟(1)所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：培養(yǎng)溫度為23-27℃，濕度為65-80％，ph值為5.6-6.0，是先進(jìn)行暗培養(yǎng)4-5天，再轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)，其中，光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為1500-2000lux，光照時(shí)間為每天12-14h。

優(yōu)選地，步驟(2)所述繼代增殖培養(yǎng)是在溫度為25-30℃，濕度為50-75％，ph值為5.6-6.0的條件下進(jìn)行的，所述增殖培養(yǎng)光照強(qiáng)度為2000-5000lux，光照時(shí)度為12-14h/天。

優(yōu)選地，步驟(3)所述生根培養(yǎng)是在溫度為24-27℃，濕度為40-60％，ph值為5.6-6.0，光照強(qiáng)度為2000-3000lux，光照時(shí)度為12-14h/天的條件下進(jìn)行的。

綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：

1、本發(fā)明的一種組織培養(yǎng)快速繁育杉木的方法在選擇外植體時(shí)，選擇優(yōu)株杉木作為母本，通過將母本進(jìn)行根部環(huán)割，待根部長出嫩芽后，采摘其嫩芽枝條作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，進(jìn)行根部環(huán)割的好處在于：植物從根部吸收的養(yǎng)分會(huì)從根部向上流動(dòng),最后從表皮層回到根部，形成循環(huán)，如果在植物枝干部位環(huán)割，會(huì)使養(yǎng)分在環(huán)割處停留并暫時(shí)打破循環(huán)使養(yǎng)分大部分留在枝干部，根部環(huán)割的做法有利于果實(shí)、枝葉的成長，且通過再生嫩芽作為外植體可以有效的保持了優(yōu)良母本的穩(wěn)定性狀，通過組織培養(yǎng)對(duì)外植體進(jìn)行處理，與常規(guī)的扦插和壓條繁殖相比，組織培養(yǎng)能夠用較少的優(yōu)良母本，繁殖出大批量的種苗，適用于規(guī)?；a(chǎn)。

2、本發(fā)明的一種組織培養(yǎng)快速繁育杉木的方法在進(jìn)行組織培養(yǎng)前首先對(duì)外植體進(jìn)行滅菌消毒，然后在含有不同激素配比的ms培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，通過誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基以及生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)，各培養(yǎng)基提供外植體在生根壯苗期間所需的因子，能夠提供生根的良好條件，促進(jìn)苗健康茁壯，獲得杉木的再生苗，其培養(yǎng)方法取材方便，成本低、操作簡單，擴(kuò)繁速度快，繁殖系數(shù)高，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益，值得推廣。

【具體實(shí)施方式】

下面的實(shí)施例可以幫助本領(lǐng)域的技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不可以以任何方式限制本發(fā)明。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供一種組織培養(yǎng)快速繁育杉木的方法，具體包括如下步驟：

(一)外植體的準(zhǔn)備：選擇單株、優(yōu)株杉木作為母本，將母本進(jìn)行根部環(huán)割處理，待根部長出嫩芽后，采摘其嫩芽枝條作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，所述嫩芽枝條為4-8月份萌發(fā)的半木質(zhì)化枝條，所述嫩芽是在天氣晴好至少3天后進(jìn)行采摘的；

(二)外植體的預(yù)處理：剪取經(jīng)過環(huán)割根部新長嫩芽枝條為外植體，將外植體剪成5cm的枝條，用75％酒精浸泡12s，然后用洋蔥汁浸泡30min，浸泡期間不斷用玻璃棒進(jìn)行攪拌，浸泡完成后用無菌水將外植體沖洗5次，然后將外植體放在超凈工作臺(tái)上待其表面水分自然風(fēng)干，切除外植體的葉片以及舊切口，然后切成1.5cm帶2個(gè)腋芽莖段，再用2％次氯酸鈉處理8min，無菌水沖洗3次，用濾紙吸干帶腋芽莖段，得到組織培養(yǎng)的外植體備用；

(三)培養(yǎng)基的培養(yǎng)：

(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)：將上述步驟獲得的外植體先接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)35天，按黑暗和光照時(shí)間比為1:8進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織分化形成不定芽；其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為23℃，濕度為65％，ph值為5.6，是先進(jìn)行暗培養(yǎng)4天，再轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)，其中，光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為1500lux，光照時(shí)間為每天12h；誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有ms培養(yǎng)基+1.5mg/lkt+0.5mg/l6-ba+0.1mg/liba+200mg/lca(no3)；

(2)繼代增殖培養(yǎng)：將步驟(1)所述不定芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)35天，獲得繼代苗；其中，繼代增殖培養(yǎng)是在溫度為25℃，濕度為50％，ph值為5.6的條件下進(jìn)行的，所述增殖培養(yǎng)光照強(qiáng)度為2000lux，光照時(shí)度為12h/天；增殖培養(yǎng)基的成分為：ms+1.0mg/lkt+0.2mg/l6-ba+0.1mg/liba+200mg/lca(no3)；

(3)生根培養(yǎng)：將經(jīng)步驟(2)增殖培養(yǎng)得到的繼代苗接種到生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)15天后獲得生根苗，然后將生根苗轉(zhuǎn)到煉苗室進(jìn)行煉苗；其中，生根培養(yǎng)是在溫度為24℃，濕度為40％，ph值為5.6，光照強(qiáng)度為2000lux，光照時(shí)度為12h/天的條件下進(jìn)行的；生根培養(yǎng)基的成分為：ms+1.0mg/labt+0.2mg/liba；

上述三種培養(yǎng)基的制備方法是將組成培養(yǎng)基的原料混合攪拌均勻后，將其煮沸至ph值調(diào)節(jié)至5.6，然后裝入培養(yǎng)器皿中，在120℃高溫下蒸汽滅菌15min后進(jìn)行冷卻，得到培養(yǎng)基備用；

(四)生根苗移栽：煉苗20天待根系由白色轉(zhuǎn)變成灰白色后，將生根苗進(jìn)行移栽，移栽時(shí)先將生根苗置于清水中漂洗，洗凈根部的培養(yǎng)基，晾干根系的表面水分，將生根苗栽入裝有的混合基質(zhì)容器中培養(yǎng)，所述混合基質(zhì)是由體積比為1：2的蛭石粉與椰糠混合而成。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供一種組織培養(yǎng)快速繁育杉木的方法，具體包括如下步驟：

(一)外植體的準(zhǔn)備：選擇單株、優(yōu)株杉木作為母本，將母本進(jìn)行根部環(huán)割處理，待根部長出嫩芽后，采摘其嫩芽枝條作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，所述嫩芽枝條為4-8月份萌發(fā)的半木質(zhì)化枝條，所述嫩芽是在天氣晴好至少3天后進(jìn)行采摘的；

(二)外植體的預(yù)處理：剪取經(jīng)過環(huán)割根部新長嫩芽枝條為外植體，將外植體剪成6cm的枝條，用75％酒精浸泡15s，然后用洋蔥汁浸泡40min，浸泡期間不斷用玻璃棒進(jìn)行攪拌，浸泡完成后用無菌水將外植體沖洗6次，然后將外植體放在超凈工作臺(tái)上待其表面水分自然風(fēng)干，切除外植體的葉片以及舊切口，然后切成1.7cm帶2個(gè)腋芽莖段，再用2％次氯酸鈉處理9min，無菌水沖洗4次，用濾紙吸干帶腋芽莖段，得到組織培養(yǎng)的外植體備用；

(三)培養(yǎng)基的培養(yǎng)：

(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)：將上述步驟獲得的外植體先接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)38天，按黑暗和光照時(shí)間比為1:8進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織分化形成不定芽；其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為25℃，濕度為72％，ph值為5.8，是先進(jìn)行暗培養(yǎng)5天，再轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)，其中，光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為1700lux，光照時(shí)間為每天13h；誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有ms培養(yǎng)基+1.5mg/lkt+0.5mg/l6-ba+0.1mg/liba+200mg/lca(no3)；

(2)繼代增殖培養(yǎng)：將步驟(1)所述不定芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)38天，獲得繼代苗；其中，繼代增殖培養(yǎng)是在溫度為28℃，濕度為63％，ph值為5.8的條件下進(jìn)行的，所述增殖培養(yǎng)光照強(qiáng)度為3500lux，光照時(shí)度為13h/天；增殖培養(yǎng)基的成分為：ms+1.0mg/lkt+0.2mg/l6-ba+0.1mg/liba+200mg/lca(no3)；

(3)生根培養(yǎng)：將經(jīng)步驟(2)增殖培養(yǎng)得到的繼代苗接種到生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)17天后獲得生根苗，然后將生根苗轉(zhuǎn)到煉苗室進(jìn)行煉苗；其中，生根培養(yǎng)是在溫度為26℃，濕度為50％，ph值為5.8，光照強(qiáng)度為2500lux，光照時(shí)度為13h/天的條件下進(jìn)行的；生根培養(yǎng)基的成分為：ms+1.0mg/labt+0.2mg/liba；

上述三種培養(yǎng)基的制備方法是將組成培養(yǎng)基的原料混合攪拌均勻后，將其煮沸至ph值調(diào)節(jié)至5.8，然后裝入培養(yǎng)器皿中，在125℃高溫下蒸汽滅菌22min后進(jìn)行冷卻，得到培養(yǎng)基備用；

(四)生根苗移栽：煉苗25天待根系由白色轉(zhuǎn)變成灰白色后，將生根苗進(jìn)行移栽，移栽時(shí)先將生根苗置于清水中漂洗，洗凈根部的培養(yǎng)基，晾干根系的表面水分，將生根苗栽入裝有的混合基質(zhì)容器中培養(yǎng)，所述混合基質(zhì)是由體積比為1：2的蛭石粉與椰糠混合而成。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供一種組織培養(yǎng)快速繁育杉木的方法，具體包括如下步驟：

(一)外植體的準(zhǔn)備：選擇單株、優(yōu)株杉木作為母本，將母本進(jìn)行根部環(huán)割處理，待根部長出嫩芽后，采摘其嫩芽枝條作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，所述嫩芽枝條為4-8月份萌發(fā)的半木質(zhì)化枝條，所述嫩芽是在天氣晴好至少4天后進(jìn)行采摘的；

(二)外植體的預(yù)處理：剪取經(jīng)過環(huán)割根部新長嫩芽枝條為外植體，將外植體剪成7cm的枝條，用75％酒精浸泡16s，然后用洋蔥汁浸泡50min，浸泡期間不斷用玻璃棒進(jìn)行攪拌，浸泡完成后用無菌水將外植體沖洗7次，然后將外植體放在超凈工作臺(tái)上待其表面水分自然風(fēng)干，切除外植體的葉片以及舊切口，然后切成2cm帶2個(gè)腋芽莖段，再用2％次氯酸鈉處理10min，無菌水沖洗5次，用濾紙吸干帶腋芽莖段，得到組織培養(yǎng)的外植體備用；

(三)培養(yǎng)基的培養(yǎng)：

(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)：將上述步驟獲得的外植體先接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)40天，按黑暗和光照時(shí)間比為1:8進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織分化形成不定芽；其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為27℃，濕度為80％，ph值為6.0，是先進(jìn)行暗培養(yǎng)5天，再轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)，其中，光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為2000lux，光照時(shí)間為每天14h；誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有ms培養(yǎng)基+1.5mg/lkt+0.5mg/l6-ba+0.1mg/liba+200mg/lca(no3)；

(2)繼代增殖培養(yǎng)：將步驟(1)所述不定芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)40天，獲得繼代苗；其中，繼代增殖培養(yǎng)是在溫度為30℃，濕度為75％，ph值為6.0的條件下進(jìn)行的，所述增殖培養(yǎng)光照強(qiáng)度為5000lux，光照時(shí)度為14h/天；增殖培養(yǎng)基的成分為：ms+1.0mg/lkt+0.2mg/l6-ba+0.1mg/liba+200mg/lca(no3)；

(3)生根培養(yǎng)：將經(jīng)步驟(2)增殖培養(yǎng)得到的繼代苗接種到生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)20天后獲得生根苗，然后將生根苗轉(zhuǎn)到煉苗室進(jìn)行煉苗；其中，生根培養(yǎng)是在溫度為27℃，濕度為60％，ph值為6.0，光照強(qiáng)度為3000lux，光照時(shí)度為14h/天的條件下進(jìn)行的；生根培養(yǎng)基的成分為：ms+1.0mg/labt+0.2mg/liba；

上述三種培養(yǎng)基的制備方法是將組成培養(yǎng)基的原料混合攪拌均勻后，將其煮沸至ph值調(diào)節(jié)至6.0，然后裝入培養(yǎng)器皿中，在130℃高溫下蒸汽滅菌30min后進(jìn)行冷卻，得到培養(yǎng)基備用；

(四)生根苗移栽：煉苗30天待根系由白色轉(zhuǎn)變成灰白色后，將生根苗進(jìn)行移栽，移栽時(shí)先將生根苗置于清水中漂洗，洗凈根部的培養(yǎng)基，晾干根系的表面水分，將生根苗栽入裝有的混合基質(zhì)容器中培養(yǎng)，所述混合基質(zhì)是由體積比為1：2的蛭石粉與椰糠混合而成。

效果驗(yàn)證

為了進(jìn)一步說明本發(fā)明組織培養(yǎng)快速繁育杉木的方法的應(yīng)用價(jià)值，實(shí)施人分為以下四組做對(duì)比試驗(yàn)：

第一組：實(shí)施例1所述的組織培養(yǎng)方法；

第二組：實(shí)施例2所述的組織培養(yǎng)方法；

第三組：實(shí)施例3所述的組織培養(yǎng)方法；

第四組：培養(yǎng)基配方更換為ms培養(yǎng)基+2.5mg/l6-ba+0.5mg/liba-d+30g/l蔗糖，其他方式嚴(yán)格按照實(shí)施例2進(jìn)行。

s1：觀察上述四組在組培苗情況，記錄各組的生根苗數(shù)、生根率和多根率，結(jié)果見表1；

表1四組杉木組培苗情況表

根據(jù)上表可知：采用本發(fā)明的組織培養(yǎng)方法培育得到的杉木種苗，生根苗數(shù)多，生根率以及多根率高，適用于大規(guī)模種植，值得推廣。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。