本發(fā)明涉及一種能使稻屬植株快速脫病脫毒的扦插育苗方法，屬植物脫毒技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

稻屬，禾本科，約25種，分布于熱帶地區(qū)，分為栽培稻和野生稻兩種。野生稻是栽培稻(o.satival.)和非洲栽培稻(o.glaberrimasteud.)以外的所有野生種類的總稱。

長期的人工選擇使我國栽培稻的遺傳背景非常狹窄，狹窄的遺傳背景再加上近年來全球人口的增長，耕地面積的減少、全球氣候變化等因素使水稻生產(chǎn)容易受到病蟲害和環(huán)境污染的影響，導(dǎo)致水稻產(chǎn)量和品質(zhì)嚴重下降。野生稻長期生存在野外抗逆性較強，是天然的基因庫，也是適應(yīng)未來環(huán)境變化培育抗病高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻新材料的基礎(chǔ)。對野生稻有利基因的挖掘和利用已成為熱點，近年來許多科研工作者已通過傳統(tǒng)的雜交和回交的方法，將許多aa基因組野生稻的優(yōu)良基因轉(zhuǎn)移到栽培稻中，但由于非aa基因組野生稻與栽培稻的雜交率極低，且雜種后代大多不育，很難獲得雜交種子，一旦獲得雜交植株，為保存獲得的雜交植株常進行留樁的方法，但反復(fù)留樁導(dǎo)致雜交植株易染病，生長較弱致使利用非aa基因組野生稻的有利基因受到了阻礙。因此，對重要雜交材料的復(fù)壯快繁以及野生稻優(yōu)良種質(zhì)資源的保存已成為當(dāng)今世界亟待解決的問題。

若用種子進行生苗繁育需要大量的種子，野生稻與雜交稻的種子具有落粒性，種子收集較困難，野生稻與栽培稻遠緣雜交后代大多不育，并且雜交種子還存在著分離。水稻扦插育苗是利用植物細胞的全能性，避開有性繁殖基因重組過程，保持群體純度，減少生物學(xué)混雜。趙洪濤等，2012年在《水稻雄性不育系扦插繁殖與種子》里的研究表明扦插繁殖植株比種子繁殖植株的生長發(fā)育期大幅提前，具有矮化、短穗、有效穗多、植株緊湊長勢好的特點。近年來，一些學(xué)者采取稻屬帶節(jié)莖段扦插的方法來實現(xiàn)野生稻種質(zhì)資源保存和雜交水稻的復(fù)壯快繁。但常規(guī)的扦插方法易在培養(yǎng)早期常出現(xiàn)大面積真菌污染，在培養(yǎng)過程中有時還會出現(xiàn)內(nèi)生細菌的再次污染，造成了材料的損失。

本發(fā)明提供的一種能使稻屬植株快速脫病脫毒的扦插育苗方法，經(jīng)文獻檢索，未見與本發(fā)明相同技術(shù)的公開報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，而提供一種能使稻屬植株快速脫病脫毒的扦插育苗方法。該方法能使染病植株快速脫毒，減少重要稻屬種質(zhì)資源的損失，提高野生稻和雜交水稻扦插育苗的出芽率和成活率，具有潛在的生態(tài)效益和社會效益。

本發(fā)明的能使稻屬植株快速脫病脫毒的扦插育苗方法，包括：野外取材、莖稈脫病脫毒滅菌處理、莖稈扦插的預(yù)處理、莖稈的扦插、及莖稈的復(fù)壯培養(yǎng)步驟，具體如下：

a.野外取材：在晴天早晨露水未干時用剪刀剪取帶病或生長狀態(tài)瘦弱的稻屬植株上的帶節(jié)莖稈，取材后立即放入盛有清水的桶中，以避免莖稈失水；再按照不同株系用保鮮膜包裹莖稈，置于冰袋中保鮮帶回實驗室；

b.莖稈脫病脫毒滅菌處理：帶回實驗室的稻屬莖稈在流動的自來水下沖洗10分鐘，將表面的泥漿和污垢徹底沖洗干凈后，用體積百分比為75％的酒精棉球擦拭莖稈，并用剪刀將莖稈剪成5cm或7cm的段，莖稈生物學(xué)下方剪成斜口，生物學(xué)上段剪成平口，每段有1個結(jié)節(jié)；在無菌操作臺用鑷子剝離表面帶病或發(fā)霉葉鞘，保留無病葉鞘，用體積百分比為75％的酒精浸泡20秒，表面滅活后用無菌蒸餾水沖洗5次或6次；用體積百分比為6％的次氯酸鈉溶液表面滅活3分鐘，搖動滅菌瓶，最后用無菌蒸餾水清洗10次或12次；

c.莖稈扦插的預(yù)處理：在無菌操作臺中將用無菌蒸餾水配制好的質(zhì)量體積比為3％的瓊脂糖倒入培養(yǎng)瓶中，瓊脂糖厚度3cm，待瓊脂糖凝固后，將滅菌處理好的莖稈段斜口端向下插入瓊脂糖中固定，根據(jù)莖稈段的長度在培養(yǎng)瓶中加入深度為3cm已滅菌的自來水，用封口膜封口后置于28℃，相對濕度60％的暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待莖稈處長出1cm或2cm新芽后在無菌操作臺中將培養(yǎng)瓶中的自來水倒掉，并用已滅菌的自來水清洗培養(yǎng)瓶中莖稈3次，清洗后在培養(yǎng)瓶中再加入深度為1cm的滅菌自來水，封口膜封口后放入28℃，光照強度1600lux，光照時間為每天6:00-22:00時，空氣相對濕度60％的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天；

d.莖稈的扦插：在無菌操作臺中用滅菌的鑷子取出已出芽的莖稈插入盛有土的組培瓶中，莖稈插入土的深度為莖節(jié)剛好被土覆蓋，加土的量占整個組培瓶的1/2，并在上面鋪一層厚度為5mm珍珠巖；莖稈扦插后在組培瓶中加入10ml已滅菌的自來水，用封口膜封口后放入28℃，空氣相對濕度60％，光照強度2000lux，光照時間為每天6:00-22:00的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，適時噴水，保證土壤濕潤；上述所用自來水、組培瓶、土、自來水以及珍珠巖均經(jīng)121℃，20分鐘滅菌；

e.莖稈的復(fù)壯培養(yǎng)：莖稈扦插培養(yǎng)4-6天，待新幼芽長至5cm時每周加入ph5.8的3-5ml1/4n6液體培養(yǎng)基；待新苗長至10cm時開始煉苗，將封口的封口膜更換為保鮮膜，在組培瓶中加入滅菌自來水，加入自來水的量為超過土壤表面1cm，煉苗處理的第一天至第五天，每天用大頭針在封口的保鮮膜膜上刺出8-15個小孔，第六天將小苗移到溫室，揭開保鮮膜，按常規(guī)水肥管理進行培養(yǎng)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果是：

1、對稻種資源莖稈進行脫病脫毒處理，清除了水稻中帶有的病毒，降低了因莖稈攜帶土壤和田間水中的病菌導(dǎo)致扦插莖稈污染風(fēng)險。

2、對稻種資源脫病脫毒扦插育苗預(yù)處理，將消毒時殘留在莖稈中的次氯酸鈉排到滅了菌的自來水中，減少和降低了直接將莖稈扦插到土中殘留的次氯酸鈉對莖稈的毒害，同時也促進新芽的發(fā)出，提高了莖稈扦插的成活率。

3、對復(fù)壯稻種資源莖稈的處理后稻屬植株莖稈扦插出芽率為99％以上，幼苗的成活率達96％以上。

4、本發(fā)明方法簡單易行、成本低、扦插成活的水稻長勢較好，基本無病蟲害發(fā)生；且扦插培苗的周期短，一般為1-2個月即能進行下一步移栽，不受季節(jié)、環(huán)境因素影響，能夠大面積推廣和應(yīng)用。還能應(yīng)用于保存和快速繁殖一些稀有的稻屬品種。

具體實施方式

實施例一：云南藥用野生稻莖稈扦插復(fù)壯

本實施例以云南省西雙版納傣族自治州勐海縣取的野外生長的藥用野生稻(oryzaofficinaliswall.)為實驗材料，采用本發(fā)明方法進行扦插獲得了一批成活率較高藥用野生稻的幼苗。實施過程如下：

1)野外取材：藥用野生稻植株取材為云南省西雙版納傣族自治州勐?？h的野外，在晴天早晨7點時用剪刀剪取生長狀態(tài)瘦弱的藥用野生稻植株上的帶節(jié)莖稈，取材后立即放入盛有清水的桶中浸泡，以避免莖稈失水，再按照不同株系用保鮮膜包裹莖稈，置于冰袋中保鮮帶回實驗室；

2)莖稈脫病脫毒滅菌處理：帶回實驗室的藥用野生稻回交后代莖稈用流動的自來水下沖洗10分鐘，將表面的泥漿和污垢徹底沖洗干凈后用體積百分比為75％的酒精棉球擦拭莖稈，并用剪刀按每段保留有1個莖節(jié)的標準將莖稈剪為5cm或7cm的段，切口平滑，莖稈生物學(xué)下方要剪成斜口的，生物學(xué)上段剪為平口的。在無菌操作臺用鑷子剝離切好的水稻莖稈表面帶病或發(fā)霉葉鞘，保留無病葉鞘，用體積百分比為75％的酒精浸泡20秒表面滅活后用無菌蒸餾水沖洗5次。用體積百分比為6％的次氯酸鈉溶液表面消毒3分鐘，上下?lián)u動滅菌瓶，最后用無菌蒸餾水清洗10次；

3)莖稈扦插的預(yù)處理：在無菌操作臺中用無菌蒸餾水配制好的質(zhì)量體積比為3％的瓊脂糖倒入培養(yǎng)瓶中，厚度3cm，待瓊脂糖凝固后，將滅菌處理好的莖稈段斜口端向下插入瓊脂糖中，固定后根據(jù)莖稈段的長度在培養(yǎng)瓶中加入深度為3cm已滅菌的自來水，用封口膜封口后置于28℃，相對濕度60％的暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3天后，莖稈處長出1cm或2cm的新芽，在無菌操作臺中將培養(yǎng)瓶中滅菌自來水倒掉，并用滅菌自來水清洗莖稈3次，清洗后在培養(yǎng)瓶中加入深度為1cm的已滅菌自來水，封口膜封口后放入28℃，空氣相對濕度60％，光照強度1600lux，光照時間為每天6:00-22:00時的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，2天后統(tǒng)計處理后的出芽情況；

4)莖稈的扦插：在無菌操作臺中將預(yù)處理的莖稈用滅菌的鑷子取出后插入盛有已滅菌土壤的組培瓶中，加土的量占整個組培瓶的1/2，莖稈插入土的深度為莖節(jié)剛好被土覆蓋，并在土的上層鋪一層厚度為5mm的珍珠巖。莖稈扦插后在組培瓶中加入10ml已滅菌的自來水，然后用封口膜封住瓶口，放入28℃，空氣相對濕度60％，光照強度2000lux，光照時間為每天6:00-22:00時的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天補充滅菌的自來水以保持土壤的濕潤。上述所用自來水、組培瓶、土以及珍珠巖均經(jīng)121℃，20分鐘滅菌；

5)莖稈的復(fù)壯培養(yǎng)：莖稈扦插培養(yǎng)4天后，新幼芽長至5cm時每周加入ph5.8的3-5ml1/4n6液體培養(yǎng)基。待新苗長至10cm時開始煉苗，將封口的封口膜更換為保鮮膜，煉苗處理的第1天至第5天，每天用大頭針在封口的保鮮膜膜上刺出8個或15個小孔，第6天將小苗移到溫室培養(yǎng)，同時揭開保鮮膜，在溫室按常規(guī)溫室水稻栽培進行管理，待植株長至三葉期時，統(tǒng)計成活率。

在該實施例中脫病脫毒的藥用野生稻莖稈出芽率為99.2％，扦插后的成活率在98.6％以上，且育得的幼苗無病蟲害影響，質(zhì)量較好。

實施例二：云南藥用野生稻與栽培稻雜交后代莖稈扦插復(fù)壯

本實施例以在云南省玉溪市元江縣的田間，采集生長瘦弱的云南藥用野生稻與栽培稻hy-8雜交的后代為實驗材料，采用本發(fā)明方法進行扦插獲得了一批成活率較高藥用野生稻與栽培稻雜交后代的幼苗。

實施過程基本同實施例一，僅以下幾點不同：

1)莖稈脫病脫毒滅菌處理：帶回實驗室的云南藥用野生稻與栽培稻hy-8雜交的后代莖稈用流動的自來水沖洗10分鐘，將表面的泥漿和污垢徹底沖洗干凈后，用體積百分比為75％的酒精棉球擦拭莖稈，并用剪刀將莖稈剪成5cm或7cm的段，莖稈生物學(xué)下方要剪成斜口，生物學(xué)上段剪為平口，每段有1個結(jié)節(jié)。在無菌操作臺用鑷子剝離表面帶病或發(fā)霉葉鞘，保留無病葉鞘，用體積百分比為75％的酒精浸泡20秒，表面滅活后用無菌蒸餾水沖洗6次。用體積百分比為6％的次氯酸鈉溶液表面滅活3分鐘，上下?lián)u動滅菌瓶，最后用無菌蒸餾水清洗12次；

2)莖稈扦插的預(yù)處理：帶節(jié)莖稈扦插入用無菌蒸餾水配制好的質(zhì)量體積比為3％瓊脂糖中預(yù)處理4天，長出1cm或2cm的新芽，在無菌操作臺中將培養(yǎng)瓶中自來水倒掉，并用滅菌自來水清洗莖稈3次后加入深度為1cm的滅菌自來水。封口后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，培養(yǎng)條件與野生稻帶節(jié)莖稈培養(yǎng)條件一致，統(tǒng)計出芽情況。

3)莖稈的復(fù)壯培養(yǎng)：莖稈扦插培養(yǎng)6天，待新幼芽長至5cm時每周加入ph5.8的3-5ml1/4n6液體培養(yǎng)基。

在該實施例中，脫病脫毒的藥用野生稻與栽培稻hy-8雜交后代莖稈扦插后的出芽率為99％，成活率96.8％，且育得的幼苗質(zhì)量較好。