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一種利用誘導(dǎo)劑提高棉花黃萎病抗性的方法與流程

文檔序號:11667264閱讀:403來源:國知局
一種利用誘導(dǎo)劑提高棉花黃萎病抗性的方法與流程

本發(fā)明涉及一種提高棉花黃萎病抗性的方法,具體地說是涉及一種利用誘導(dǎo)劑提高棉花黃萎病抗性的方法。



背景技術(shù):

棉花是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物,是國防、紡織、化工等行業(yè)的主要原料之一。然而,棉花的病蟲害一直限制棉花種植業(yè)的發(fā)展,特別是黃萎病,素有棉花“癌癥”之稱,對棉花的產(chǎn)量和質(zhì)量造成重大負(fù)面影響。

目前提高棉花黃萎病抗性的方法有很多,其中利用枯草桿菌或者芽孢桿菌等微生物制劑合并化學(xué)制劑噴施可提高抗病性,但是大量使用農(nóng)藥對環(huán)境造成污染,破壞農(nóng)田的生態(tài)平衡。專利cn1397166a公開了利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%乙酰水楊酸與20%硼砂混合后與水配成1:1000的溶液進(jìn)行棉花葉面噴施,利用中醫(yī)的方法對已經(jīng)感病的棉花植株進(jìn)行治療。然而,棉花的黃萎病菌從根部接菌,到植株葉片表現(xiàn)出枯萎、枯黃等可見的癥狀一般需要10天左右的時間,在這期間,大量致病毒素已經(jīng)通過維管束擴(kuò)散至整株。

此外,利用抗病相關(guān)基因?qū)γ藁ㄟM(jìn)行轉(zhuǎn)化也是提高棉花黃萎病抗性的一種方法,但是棉花轉(zhuǎn)基因具有基因型限制,現(xiàn)今沒有通過轉(zhuǎn)抗病基因提高黃萎病抗性的棉花品種用于生產(chǎn)。水楊酸(sa)是一種小分子酚類物質(zhì),廣泛存在于植物的葉片和繁殖器官中,其在棉花抗逆、低溫出苗、種衣劑等方面應(yīng)用廣泛,但尚未有將水楊酸作為誘導(dǎo)劑提高棉花抗病性,并提出精確誘導(dǎo)時間、噴施時間的相關(guān)報道。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的就是提供一種利用誘導(dǎo)劑提高棉花黃萎病抗性的方法,以解決現(xiàn)有體高棉花黃萎病抗性的方法污染環(huán)境、僅針對感病植株等問題。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:

一種利用誘導(dǎo)劑提高棉花黃萎病抗性的方法,采用濃度為0.5~10mmol/l的水楊酸溶液為誘導(dǎo)劑,所述sa溶液與黃萎病誘導(dǎo)的npr1抗病表達(dá)模式一致,在出現(xiàn)黃萎病的前三天采用sa溶液噴施棉花葉片,以獲得較佳黃萎病抗性。

所述誘導(dǎo)劑為0.5mmol/l的水楊酸溶液。

在第一次噴施sa溶液之后,每隔3~5天再噴施一次sa溶液,以維持棉苗體內(nèi)的抗病水平。

本發(fā)明采用水楊酸作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)變化產(chǎn)生抗黃萎病抗性,經(jīng)水楊酸處理后減少了病原菌對棉苗的傷害,并且在第一次噴施處理sa后,每隔3~5天再噴施一次sa溶液,可維持棉苗體內(nèi)的抗病水平。在田間黃萎病爆發(fā)高峰的6月20日與8月20日前10~15天噴施sa溶液,為提高抗病性的較佳時間。

本發(fā)明提高棉花黃萎病抗性的方法簡單、成本低廉,提高棉花黃萎病抗性的效果良好,具有一定的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是npr1.1基因在不同濃度水楊酸溶液處理下的表達(dá)情況柱狀圖。

圖2是npr1.1基因在黃萎病菌接菌處理下的表達(dá)情況柱狀圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述,下述實施例僅作為說明,并不以任何方式限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述實施例均實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。

1.材料的來源

供試棉花種子為冀228,種子由河北省農(nóng)林科學(xué)院棉花研究所提供。

2.棉苗培育

選取大小基本一致的飽滿的脫絨種子,37度溫水浸泡過夜,露白后,放置于雙層濾紙上,在種子盒中發(fā)芽1天。選取發(fā)芽長度一致的種子,播種于塑料營養(yǎng)缽,基質(zhì)為蛭石。澆灌hoagland營養(yǎng)液,置于人工氣候箱中培養(yǎng),溫度28℃/18℃,相對濕度70%,光照16h/黑暗8h條件下培養(yǎng)3周。實驗設(shè)0、0.5mmol/l、2mmol/l三個水楊酸(sa)處理濃度。每個處理播種20盆,每盆播5粒,待棉苗三葉期時,供sa噴灑處理。

3.孢子懸浮液的制備

將河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供的vlx2-1保存于-70℃的黃萎病菌孢子液涂于pda平板上,在25℃條件下暗培養(yǎng)活化一周。用接種針取活化后的邊緣菌塊并用滅菌水震蕩懸浮,然后取1ml菌液平鋪到新的pda平板上。五天后用滅菌水從平板上洗下孢子,并將濃度調(diào)至105spores/ml。

4.sa與黃萎病菌誘導(dǎo)下抗病相關(guān)基因的表達(dá)模式分析

分別采用0、0.5、2、5、10mmol/l水楊酸(sa)噴施三葉期的棉苗,在經(jīng)噴施處理后0h、1h、2h、24h、48h、96h、120h提取葉片rna,反轉(zhuǎn)錄后對gbnpr1.1基因進(jìn)行熒光定量pcr檢測。上述處理均設(shè)置三次重復(fù)。

圖1示出了npr1.1基因在不同濃度sa處理下的表達(dá)情況。圖1中的結(jié)果表明,sa噴施濃度0.5mmol/l與2mmol/l時,與對照相比均提高了gbnpr1.1的表達(dá)量,但兩種處理濃度間差異不顯著,gbnpr1.1基因的表達(dá)量隨處理時間延長逐漸增加,96h表達(dá)量達(dá)到峰值,120h后基因的表達(dá)量有所下降。由此可見,sa與黃萎病菌對gbnpr1.1基因的誘導(dǎo)表達(dá)模式相似。

5.噴施處理

將棉花種子發(fā)芽,種植于25℃溫室內(nèi),在光照16h/黑暗8h條件下培養(yǎng)3周,取濃度為0.5mmol/l的sa溶液均勻噴施在棉花葉片上,以葉片上形成均勻的液滴不滴落為宜。

6.接菌處理

經(jīng)0.5mmol/l的sa溶液噴施處理3天后,小心拔出幼苗,將根部浸入孢子懸浮液1min,在光照16h/黑暗8h條件下培養(yǎng),保持土壤濕度在50%以上。每次噴施100棵長勢基本一致的棉苗,重復(fù)3次。間隔5天重復(fù)噴施1次,連續(xù)調(diào)查20天。以不噴灑sa溶液,但采用黃萎病菌接菌的為對照ck。

7.噴施效果確定

在接菌后10天左右開始調(diào)查各個接種單株的病級,以后每2天重新調(diào)查一次,棉花黃萎病鑒定分級標(biāo)準(zhǔn)如表1所示,根據(jù)調(diào)查結(jié)果計算各單株的病情指數(shù)(di)。

表1棉花黃萎病鑒定分級標(biāo)準(zhǔn)

病情指數(shù)的計算公式為:

∑病情指數(shù)(di)=σ(發(fā)病級數(shù)×該級株數(shù))÷(最高發(fā)病級數(shù)×調(diào)查總株數(shù))×100

表2示出了接菌20天發(fā)病指數(shù)的調(diào)查結(jié)果。從表2中可以看出,噴施sa的棉苗平均病情指數(shù)為18.5,病指達(dá)到抗病水平,未噴施sa的棉苗平均病情指數(shù)為38.5,病指為感病。

表2接菌后20天發(fā)病指數(shù)調(diào)查結(jié)果

圖2示出了npr1.1基因在黃萎病菌接菌處理下的表達(dá)情況。采用熒光定量pcr技術(shù),檢測噴施不同濃度的水楊酸溶液后,npr的表達(dá)量在96h前呈現(xiàn)上升趨勢,在96h達(dá)到最高。因此,96h為較佳處理時間。

綜上,在接種黃萎病菌前3天噴施0.5mmol/l的sa溶液為誘導(dǎo)棉花獲得較佳抗性的時間。由于5天后抗病基因的表達(dá)量逐漸下降,為維持較高的抗病性,建議之后可以每隔5天噴施一次有利于維持植物體內(nèi)較高的抗病水平,對第一次的誘導(dǎo)效果起到加強(qiáng)作用。在此基礎(chǔ)上,在田間黃萎病爆發(fā)高峰的6月20日與8月20日前10~15天為噴施sa提高抗病性的較佳時間。由此引申,間隔3-5天追加噴施sa,也是對保持棉花自身的系統(tǒng)獲得抗性是有利的。

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