本發(fā)明涉及一種凍存試劑及細胞凍存方法，具體涉及一種人類誘導(dǎo)性多能干細胞專用的凍存試劑，以及利用該凍存試劑凍存人類誘導(dǎo)性多能干細胞的方法，屬于細胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

人類誘導(dǎo)性多能干細胞是當(dāng)前干細胞研究的熱點和焦點。它可以分化成體內(nèi)所有的細胞，進而形成身體的所有組織和器官。因此，多能干細胞的研究不僅具有重要的理論意義，而且在器官再生、修復(fù)和疾病治療方面極具應(yīng)用價值。

在多能干細胞的研究過程中，經(jīng)常會涉及到細胞凍存。細胞凍存的過程會顯著改變細胞的熱力學(xué)、化學(xué)和物理環(huán)境，同時伴隨生物性損傷的危險。影響凍存效率的因素主要有：細胞濃度、冷凍速率以及凍存試劑。其中，凍存試劑是細胞凍存過程中的核心試劑，關(guān)系到細胞儲存質(zhì)量和復(fù)蘇后細胞數(shù)量及活性。

目前，凍存人類誘導(dǎo)性多能干細胞一般采用90％血清加10％DMSO作為凍存液，這種凍存液需要現(xiàn)用現(xiàn)配，操作繁瑣，容易造成污染，而且批次不穩(wěn)定，會造成后續(xù)細胞復(fù)蘇時細胞狀態(tài)不穩(wěn)定。

為獲得來源方便的人類誘導(dǎo)性多能干細胞，開展有效的人類誘導(dǎo)性多能干細胞移植及建立人類誘導(dǎo)性多能干細胞庫，改進人類誘導(dǎo)性多能干細胞凍存復(fù)蘇技術(shù)，研究開發(fā)一種能夠長期低溫保存人類誘導(dǎo)性多能干細胞的凍存試劑以及相應(yīng)的干細胞凍存方法對促進人類誘導(dǎo)性多能干細胞的研究和應(yīng)用具有重大意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種成分完全明確、安全可靠、在-196℃液氮環(huán)境下能夠長期安全保存人類誘導(dǎo)性多能干細胞的凍存試劑，以及利用該凍存試劑凍存人類誘導(dǎo)性多能干細胞的方法。

為了實現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

一種人類誘導(dǎo)性多能干細胞專用的凍存試劑，其特征在于，該凍存試劑的組成成分及其含量分別為：

一種人類誘導(dǎo)性多能干細胞的凍存方法，其特征在于，包括以下步驟：

Step1：將前述的凍存試劑恢復(fù)至室溫；

Step2：將經(jīng)消化后的人類誘導(dǎo)性多能干細胞加入Step1所述的凍存試劑中，重懸細胞，得到細胞懸液；

Step3：將Step2所述的細胞懸液先在4℃環(huán)境下放置1h，再在-20℃環(huán)境下放置2h，最后移入液氮中長期保存。

前述的凍存方法，其特征在于，在Step2中，前述細胞懸液中細胞濃度為5×10⁶個細胞/ml-8×10⁶個細胞/ml。

本發(fā)明的有益之處在于：

(1)凍存試劑成分完全明確，便于質(zhì)量控制；

(2)使用重組人白蛋白取代動物成分的胎牛血清，凍存試劑避免含動物血清成分，安全可靠，適于臨床應(yīng)用；

(3)配方中的重組人表皮生長蛋白、b-巰基乙醇、海藻糖可以很好的保護細胞在低溫環(huán)境下處于休眠狀態(tài)，細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生冰晶，從而保持細胞的活性，有效防止出現(xiàn)細胞分化，并且凍存細胞的復(fù)蘇率可達到96％以上；

(4)凍存試劑屬于即用型，使用起來十分方便；

(5)凍存方法簡單易操作。

附圖說明

圖1是每代復(fù)蘇后的細胞的復(fù)蘇率統(tǒng)計圖；

圖2是復(fù)蘇后的P3代人類誘導(dǎo)性多能干細胞的生長狀態(tài)圖；

圖3是凍存不同時間后的細胞的復(fù)蘇率統(tǒng)計圖；

圖4(a)是SSEA4免疫熒光染色圖；

圖4(b)是SSEA4免疫熒光染色后細胞核染色圖；

圖5(a)是TRA-1-81免疫熒光染色圖；

圖5(b)是TRA-1-81免疫熒光染色后細胞核染色圖；

圖6(a)是TRA-1-60免疫熒光染色圖；

圖6(b)是TRA-1-60免疫熒光染色后細胞核染色圖；

圖7(a)是NANOG免疫熒光染色圖；

圖7(b)是NANOG免疫熒光染色后細胞核染色圖。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作具體的介紹。

一、配制凍存試劑

每100ml凍存試劑中含有以下組分：

整個配方成分完全明確，便于質(zhì)量控制，并且避免含動物血清成分，安全可靠，適于臨床應(yīng)用。

配制方法：取DMEM-F12培養(yǎng)基，依次加入海藻糖、重組人白蛋白、重組人表皮生長蛋白、b-巰基乙醇和二甲基亞砜，混合均勻即得。

在本發(fā)明的配方中：

重組人白蛋白取代了動物成分的胎牛血清，避免了動物成分的存在，更加安全，同時也能讓細胞獲得足夠的養(yǎng)分；

重組人表皮生長蛋白、b-巰基乙醇和海藻糖可以很好的保護細胞在低溫環(huán)境下處于休眠狀態(tài)，細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生冰晶，從而保持細胞的活性，有效防止出現(xiàn)細胞分化。

本配方通過研究人類誘導(dǎo)性多能干細胞的培養(yǎng)條件，優(yōu)選出幾種重要成分，通過組合使用這些成分配制出的凍存試劑，更加適合人類誘導(dǎo)性多能干細胞不受低溫環(huán)境的影響，復(fù)蘇后細胞活性依然很高，而其他細胞的培養(yǎng)條件與人類誘導(dǎo)性多能干細胞有很大的差異，所以該凍存試劑僅限于人類誘導(dǎo)性多能干細胞。

二、凍存細胞

將經(jīng)消化后的人類誘導(dǎo)性多能干細胞計數(shù)后，用本發(fā)明的凍存試劑進行細胞重懸，細胞密度為5×10⁶個細胞/ml-8×10⁶個細胞/ml，重懸后用1.8ml的凍存管盛裝細胞懸液，盛裝量為1ml/管，然后各實驗室按照自己的降溫方法將細胞懸液降溫冷凍，最后再移入液氮中進行長期保存即可。

本發(fā)明的細胞凍存試劑屬于即用型試劑，使用起來十分方便。

三、檢驗凍存結(jié)果

1、細胞復(fù)蘇率試驗

(1)細胞傳代4代的細胞復(fù)蘇率(每代凍存時間4周)

從P2代開始連續(xù)凍存復(fù)蘇至P4代，每代復(fù)蘇后的細胞的復(fù)蘇率如圖1所示。

其中，復(fù)蘇后的P3代人類誘導(dǎo)性多能干細胞的生長狀態(tài)如圖2所示。

(2)凍存不同時間后的細胞復(fù)蘇率

選取P3代細胞進行凍存，依次在凍存后的第2周、第1個月、第6個月、第12個月后進行細胞復(fù)蘇，觀察并記錄細胞復(fù)蘇率，記錄的結(jié)果如圖3所示。

結(jié)論：本發(fā)明的凍存試劑可以維持人類誘導(dǎo)性多能干細胞在-196℃液氮環(huán)境下長期安全保存。

2、復(fù)蘇后的細胞抗原表達情況

免疫熒光染色復(fù)蘇后的細胞抗原的表達：stage-specific embryonic antigen-4(SSEA4)、tumour rejection antigen(TRA)-1-81、TRA-1-60和nuclear transcription factors Nanog homeobox(NANOG)。細胞核用4’，6-diamidino-2-phenylindole(藍色)染色，比例尺為100um。染色結(jié)果如圖4(a)、圖4(b)、圖5(a)、圖5(b)、圖6(a)、圖6(b)、圖7(a)和圖7(b)所示。

結(jié)論：復(fù)蘇后的細胞仍然高度表達SSEA4、TRA-1-81、TRA-1-60、NANOG等抗原，這說明復(fù)蘇后的人類誘導(dǎo)性多能干細胞未出現(xiàn)分化，依然保持很好的未分化狀態(tài)。

綜上所述，本發(fā)明的凍存試劑可以維持人類誘導(dǎo)性多能干細胞在-196℃液氮環(huán)境下長期安全保存，有效防止出現(xiàn)細胞分化，并且凍存細胞的復(fù)蘇率可達到96％以上，這對促進人類誘導(dǎo)性多能干細胞的研究和應(yīng)用具有重大意義。

需要說明的是，上述實施例不以任何形式限制本發(fā)明，凡采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。