本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)，具體設(shè)計(jì)一種快速高效的大蒜組織培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

大蒜(alliumsativuml.)又名蒜，葫蒜，是百合科蔥屬二年生草本植物，有“植物黃金”之稱，是世界范圍內(nèi)廣受歡迎且具有重要食用和藥用價(jià)值的蔬菜、藥物和調(diào)味品，也是中國在國際市場上有較強(qiáng)競爭力的重要出口蔬菜，其精深加工產(chǎn)品走俏歐洲和北美。由于大蒜開花結(jié)實(shí)困難，采用鱗莖進(jìn)行無性繁殖，不僅用種量大、繁殖系數(shù)低，且作為常年無性繁殖的作物，還極易出現(xiàn)細(xì)菌、真菌和病毒積累，導(dǎo)致種性退化、產(chǎn)量和品質(zhì)下降，進(jìn)而影響我國大蒜產(chǎn)量的發(fā)展和大蒜產(chǎn)品的國際市場競爭優(yōu)勢。

組織培養(yǎng)技術(shù)能在短時(shí)間內(nèi)獲得大量無菌無毒的試管苗，可在一定程度可以克服大蒜用種、用地、用工大，達(dá)到恢復(fù)種性，增強(qiáng)長勢和增加產(chǎn)量的目的。雖然我國大蒜脫毒快繁研究也持續(xù)了近30年，但現(xiàn)有的組織培養(yǎng)體系普遍存在著繁殖系數(shù)不高、體外繁殖時(shí)間長和玻璃化的嚴(yán)重的問題，這都限制了大蒜組織培養(yǎng)技術(shù)的規(guī)?；瘧?yīng)用，給科研和生產(chǎn)造成巨大的損失。

玻璃化，是組織培養(yǎng)中常見的一種形態(tài)、解剖和生理紊亂，其影響因素復(fù)雜，發(fā)生機(jī)理仍不清楚。迄今為止，超過200種植物中發(fā)現(xiàn)了玻璃化的發(fā)生。大蒜玻璃化試管苗呈現(xiàn)半透明水浸狀，其組織結(jié)構(gòu)和生理功能異常，分化能力低下，難以恢復(fù)、增殖成芽和生根成苗，移栽后成活率低，后期生長差，成為植物組培脫毒快繁、基因遺傳轉(zhuǎn)化、種質(zhì)資源創(chuàng)新和次生代謝產(chǎn)物形成的嚴(yán)重障礙之一。尤其是對(duì)于規(guī)?；嚬苊缟a(chǎn)，玻璃化苗數(shù)量往往高達(dá)幾十萬甚至上百萬株，造成人力、物力、財(cái)力等資源的極大浪費(fèi)。

玻璃化影響因素十分復(fù)雜，受到外植體、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的諸多影響，直接導(dǎo)致了玻璃化防控技術(shù)的困難。使用一個(gè)或者幾個(gè)控制措施常常并不能理想的預(yù)防玻璃化的發(fā)生。已報(bào)道的對(duì)其他物種有效的方法對(duì)大蒜玻璃化的防控效果并不好。除此之外，防控玻璃化的方法常常會(huì)影響試管苗的繁殖系數(shù)。例如，降低細(xì)胞分裂素的濃度可以顯著降低玻璃化率，但是嚴(yán)重影響了繁殖系數(shù)。平衡試管苗再生和玻璃化的發(fā)生成為了一個(gè)難題。

即使嚴(yán)格控制條件，一旦某個(gè)條件控制不當(dāng)，試管苗玻璃化還時(shí)有發(fā)生，因此玻璃化的恢復(fù)顯得尤為重要，但是目前還沒有特別有效的玻璃化恢復(fù)手段，特別是低成本的玻璃化恢復(fù)手段。

為解決現(xiàn)有的大蒜再生體系中存在的玻璃化嚴(yán)重、繁殖系數(shù)低、離體培養(yǎng)時(shí)間長和快繁成本高的問題，我們建立了一個(gè)快速又高效的大蒜試管苗再生體系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種快速高效的大蒜組織培養(yǎng)方法，解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的玻璃化嚴(yán)重、繁殖系數(shù)低、離體培養(yǎng)時(shí)間長和快繁成本高等問題。

本發(fā)明的目的可以通過以下措施達(dá)到：

一種快速高效的大蒜組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

步驟(1)：取田間自然生長，抽薹后5～10天的大蒜，花莖發(fā)育相對(duì)高度即花莖高度/假莖高度為0.5～1的大蒜花序軸作外植體；

步驟(2)：將步驟(1)中的外植體完全浸沒在飽和洗衣粉溶液中表面滅菌25～35分鐘，用流水沖洗25～35分鐘，將充分洗凈的材料置于超凈工作臺(tái)，以70％～75％酒精表面消毒60～90秒，用無菌水沖洗1～3次，接著用1～2％次氯酸鈉溶液處理10～15分鐘，用無菌水沖洗2～3次；

步驟(3)：剝離花序軸外層苞葉，去除所有花序軸表面退化的花原基殘留物和膜質(zhì)苞片，去除花莖0.1～0.3mm以下部分，將無菌的花序軸縱切為2～4塊，即花序軸表面體積約為0.25～0.5mm³；

步驟(4)：將切割好的外植體接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，置于光照強(qiáng)度為50～100μmolm^-2s^-1，光照時(shí)間為12～14h·d^-1，22～28℃條件下培養(yǎng)12～25天后獲得大蒜不定芽；

步驟(5)：待花序軸分化出不定芽，一旦觀察到發(fā)生玻璃化的不定芽后，盡快將玻璃化試管芽接種到不定芽恢復(fù)培養(yǎng)基中，晴天的白天將帶有不定芽的培養(yǎng)瓶置于自然光下處理3h～10h，夜晚置于光照強(qiáng)度為100～200μmolm^-2s^-1，22～28℃的培養(yǎng)間，連續(xù)處理1～5天；所述不定芽恢復(fù)培養(yǎng)基配比為30～35g·l^-1蔗糖，7.0～8.0g·l^-1瓊脂，ph5.8～6.0；

步驟(6)：將步驟(4)或步驟(5)中獲得的正常不定芽接種到繼代生根培養(yǎng)基中，置于光照強(qiáng)度為100～200μmolm^-2s^-1，光照時(shí)間為12～14h·d-¹，22～28℃條件下培養(yǎng)15～25天后，即可獲得大量正常大蒜試管苗；

步驟(7)：步驟(6)中培養(yǎng)的試管苗，一旦發(fā)生玻璃化，盡快將玻璃化試管苗接種到試管苗恢復(fù)培養(yǎng)基中，晴天的白天將帶有不定芽的培養(yǎng)瓶置于自然光下處理3h～10h，夜晚置于光照強(qiáng)度為100～200μmolm^-2s^-1，22～28℃的培養(yǎng)間，連續(xù)處理1～5天；所述試管苗恢復(fù)培養(yǎng)基的配比為30～35g·l^-1蔗糖，7.0～8.0g·l^-1瓊脂，0.5～1g·l^-1活性炭，ph5.8～6.0。

本發(fā)明步驟(1)中取田間自然生長、抽薹后5～10天，即花莖發(fā)育相對(duì)高度(花莖高度/假莖高度)為0.5～1的大蒜花序軸作為外植體，這樣可以預(yù)防花序軸的二次發(fā)育，提高再生系數(shù)，同時(shí)避免花序軸過于幼嫩，防控玻璃化的發(fā)生，優(yōu)選抽薹后5天的花序軸。

步驟(1)采收好的大蒜花序軸當(dāng)天若沒有處理完，可以留3～5cm花莖，在保證花序軸干燥的情況下用保鮮膜密封好，存于2～6℃冰箱冷藏保存。其中：在花序軸抽薹時(shí)間期采收花序軸，留3～5cm的花莖，可以避免花序軸頂部退化的花器官吸收花莖營養(yǎng)、二次發(fā)育，影響再生系數(shù)；保證花序軸的完全干燥，可以避免細(xì)菌和真菌滋生；利用保鮮膜密封花序軸，置于2～6℃冰箱或冷庫中冷藏保存，減少花序軸的生命活動(dòng)，最大程度的保證外植體的新鮮。

本發(fā)明步驟(2)過程中優(yōu)選地要保證外植體完整，以免滅菌劑傷害花序軸內(nèi)部。

本發(fā)明步驟(2)花序軸的滅菌處理時(shí)，70～75％酒精表面消毒時(shí)間為60～90秒，1～2％次氯酸鈉溶液處理時(shí)間為10～15分鐘，以確保滅菌徹底，且不傷害花序軸；用0.1～0.2％的過氧化處理4～6分鐘，一方面可以降低污染率，還可以緩解玻璃化的發(fā)生。優(yōu)選75％酒精處理60～90秒，2％次氯酸鈉處理15分鐘。

作為本發(fā)明一種優(yōu)選方案，步驟(2)處理后的材料用0.1～0.2％的h2o2過氧化處理4～6分鐘，用無菌水沖洗3～4次，最后置于無菌濾紙上吸干表面水分，再進(jìn)行下一步步驟(3)的處理。用0.1～0.2％的h2o2預(yù)處理，可以降低玻璃化。

本發(fā)明步驟(3)中滅菌后，剝離花序軸外層苞葉，小心去除所有花序軸表面退化的花原基殘留物和膜質(zhì)苞片，防止退化花序軸再發(fā)育，影響不定芽再生；合理控制外植體和培養(yǎng)基的接觸面積，去除花序軸花莖0.1～0.3mm以下部分，將干凈的花序軸縱切為2～4塊(花序軸表面體積約為0.25～0.50mm³)，可在保證較高繁殖系數(shù)的同時(shí)，預(yù)防玻璃化的發(fā)生。優(yōu)選留外植體下部0.1mm花軸，切割為2塊或帶0.3mm花軸，切分為4塊的外植體。

本發(fā)明步驟(4)中的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選采用1/2～1倍b5培養(yǎng)基，在保證試管苗的營養(yǎng)需要的同時(shí)還可以緩解玻璃化的發(fā)生；使用1倍濃度以下1/2濃度以上的b5培養(yǎng)基濃度，不會(huì)影響不定芽的再生，工廠化生產(chǎn)中還可以用來降低成本。

作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明步驟(4)中所采用的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配比為0.1mg·l^-1萘乙酸，1～2mg·l^-16-芐基氨基嘌呤，15～30g·l^-1蔗糖，6.0～7.5g·l^-1瓊脂，ph5.8～6.0；其中：蔗糖濃度為1.5～3.0％，在保證玻璃化率和再生系數(shù)不受影響的情況下，使用15～30g·l^-1濃度的蔗糖可以降低成本；6-芐氨基嘌呤濃度為1～2mg·l^-1，花序軸在此濃度范圍下有較高的繁殖系數(shù)和較低的玻璃化率；瓊脂濃度為6.0～7.5g·l^-1，花序軸在此濃度范圍內(nèi)可獲得最多的正常不定芽。更優(yōu)選的，配比為0.1mg·l^-1萘乙酸，2mg·l^-16-芐基氨基嘌呤，30g·l^-1蔗糖，6.5g·l^-1瓊脂，ph5.8。

本發(fā)明步驟(4)中不定芽誘導(dǎo)的光照強(qiáng)度選擇為50～100μmolm^-2s^-1，可以避免光照過弱導(dǎo)致的玻璃化和光照過強(qiáng)導(dǎo)致的不定芽失綠和白化。

本發(fā)明步驟(5)發(fā)現(xiàn)玻璃化不定芽恢復(fù)的過程，通過白天自然光下處理，夜間置于光照強(qiáng)度為100～200μmolm^-2s^-1的強(qiáng)光下處理，可以加速玻璃化不定芽內(nèi)水分代謝，促進(jìn)玻璃化的恢復(fù)，恢復(fù)率達(dá)82.5％以上。

本發(fā)明步驟(6)中的繼代生根培養(yǎng)基優(yōu)選為1倍的b5培養(yǎng)基。

作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明步驟(6)中的繼代生根培養(yǎng)基的配比為30～45g·l^-1蔗糖，7.0～7.5g·l^-1瓊脂，0.5～1mg·l^-16-芐基氨基嘌呤，0.1mg·l^-1萘乙酸，0.5～1g·l^-1活性炭，ph5.8～6.0；其中：活性炭濃度為0.5～1g·l^-1，可以創(chuàng)造黑暗環(huán)境，促進(jìn)試管苗生根。更優(yōu)選的，配比為30g·l^-1蔗糖，7.0g·l^-1瓊脂，1mg·l^-16-芐基氨基嘌呤，0.1mg·l^-1萘乙酸，1g·l^-1活性炭，ph5.8～6.0。

本發(fā)明步驟(6)中光照強(qiáng)度為100～200μmolm^-2s^-1，可以保證試管苗的能力充足，預(yù)防弱光下玻璃化的發(fā)生和強(qiáng)光照下的白化情況。

本發(fā)明步驟(7)中玻璃化試管苗恢復(fù)的過程，通過白天自然光下處理，夜間置于光照強(qiáng)度為100～200μmolm^-2s^-1的強(qiáng)光下處理，可以加速玻璃化試管苗內(nèi)水分代謝，促進(jìn)玻璃化的恢復(fù)，恢復(fù)率達(dá)100％。

本發(fā)明的有益效果：

1、繁殖系數(shù)高：本發(fā)明通過花序軸器官發(fā)生途徑，通過控制玻璃化的發(fā)生和對(duì)玻璃化的恢復(fù)處理等方式，使得每花序軸的繁殖系數(shù)從以前的25.05以下增加到現(xiàn)在的52.0以上，最高可達(dá)73.0。

2、玻璃化率低：本發(fā)明通過調(diào)控外植體、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等因素，以及對(duì)玻璃化的恢復(fù)處理等，有效的防控了玻璃化的發(fā)生，大蒜不定芽的玻璃化率達(dá)5％以下，大蒜試管苗的玻璃化率為0％。

3、污染率低：本發(fā)明通過控制兩種滅菌劑的滅菌時(shí)間，在保證較高繁殖系數(shù)的同時(shí)，大大降低了大蒜試管苗的污染率。

4、操作簡單：本方法對(duì)花序軸進(jìn)行處理，和莖尖剝離等其他大蒜試管苗方法相比，操作簡單。

5、再生時(shí)間短：本發(fā)明利用不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)和繼代生根培養(yǎng)，兩次培養(yǎng)，約在35～50天內(nèi)獲得大量的再生試管苗，試管苗的再生時(shí)間縮短為愈傷組織誘導(dǎo)試管苗的1/5～1/3。

6、變異低：利用器官直接再生途徑，克服了愈傷組織途徑變異率高的問題。

7、節(jié)約成本：本發(fā)明在保證較高繁殖系數(shù)和較低玻璃化率的基礎(chǔ)上，合理調(diào)節(jié)基本培養(yǎng)基和蔗糖等濃度，縮短了培養(yǎng)時(shí)間，此外，我們還提供了玻璃化的恢復(fù)處理方案，控制了玻璃化的發(fā)生，大大降低生產(chǎn)成本。

附圖說明

圖1大蒜花序軸的預(yù)處理；

其中：a.抽薹后5天的花序軸，b.花序軸保鮮預(yù)處理，c.花序軸的滅菌處理，d.滅菌后干燥的花序軸，e.剝離花序軸外層苞片、切掉花序軸表面退化的花器官、花序軸縱切2塊，f.接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，g.誘導(dǎo)的大蒜不定芽，h.誘導(dǎo)的大蒜試管苗；

圖2活性炭對(duì)大蒜試管苗生根的影響；

圖3不同保存時(shí)間對(duì)大蒜花序軸再生的影響。

具體實(shí)施方式

通過以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。

實(shí)施例1：

供試材料為田間自然生長，自然抽薹后1天、5天、10天和15天的“二水早”花序軸，測量花序軸相對(duì)長度后選取花莖直徑一致的花序軸，剪下總苞帶1cm左右薹段，完全浸沒在飽和洗衣粉溶液中約30分鐘，用流水沖洗約30分鐘表面滅菌，將充分洗凈的材料置于超凈工作臺(tái)，以75％酒精表面消毒60秒，用無菌水沖洗1次，接著用2％次氯酸鈉溶液處理12分鐘，用無菌水沖洗4～5次，最后置于無菌濾紙上吸干表面水分。

剝離花序軸外層苞葉，去除所有花序軸表面退化的花原基殘留物和膜質(zhì)苞片，去除花莖0.3mm以下部分，將無菌的花序軸縱切為4塊；

將切割好的外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(b5培養(yǎng)基，0.1mg·l^-1萘乙酸，2mg·l^-16-芐基氨基嘌，30g·l^-1蔗糖，6.5g·l^-1瓊脂，ph5.8)，置于光照強(qiáng)度為50μmolm^-2s^-1，光照時(shí)間為12h·d^-1，25±1℃條件下培養(yǎng)20天后獲得大蒜不定芽。

統(tǒng)計(jì)每花序軸繁殖系數(shù)，玻璃化率和正常不定芽數(shù)，相關(guān)指標(biāo)的計(jì)算公式如下：

繁殖系數(shù)＝每花序軸切分?jǐn)?shù)×每外植體再生不定芽數(shù)目

玻璃化率＝玻璃化試管苗/所有外植體數(shù)目×100％

每花序軸正常不定芽數(shù)＝繁殖系數(shù)×(1-玻璃化率)

表1不同生理年齡花序軸對(duì)大蒜不定芽繁殖系數(shù)和玻璃化率的影響

表注：表中小寫字母表示差異顯著(p<0.05)

結(jié)果表明：本發(fā)明所選用的抽薹5～10天的花序軸，可同時(shí)具有較高的繁殖系數(shù)和較低的玻璃化率，特別是選用抽薹5天的花序軸；低于此范圍，則難以產(chǎn)生正常不定芽，致使繁殖系數(shù)過低，而高于此范圍，則容易導(dǎo)致玻璃化率升高。

實(shí)施例2：

參照實(shí)施例1所述方法，供試材料為田間自然生長，自然抽薹后5天“二水早”花序軸，剪下總苞帶1cm左右薹段，完全浸沒在飽和洗衣粉溶液中約30分鐘，用流水沖洗約30分鐘表面滅菌，將充分洗凈的材料置于超凈工作臺(tái)，設(shè)9個(gè)處理：

t1：75％酒精處理30秒，2％次氯酸鈉溶液處理10分鐘；

t2：75％酒精處理30秒，2％次氯酸鈉溶液處理15分鐘；

t3：75％酒精處理30秒，2％次氯酸鈉溶液處理20分鐘；

t4：75％酒精處理60秒，2％次氯酸鈉溶液處理10分鐘；

t5：75％酒精處理60秒，2％次氯酸鈉溶液處理15分鐘；

t6：75％酒精處理60秒，2％次氯酸鈉溶液處理20分鐘；

t7：75％酒精處理90秒，2％次氯酸鈉溶液處理10分鐘；

t8：75％酒精處理90秒，2％次氯酸鈉溶液處理15分鐘；

t9：75％酒精處理90秒，2％次氯酸鈉溶液處理20分鐘。

用無菌水沖洗5次，最后置于無菌濾紙上吸干表面水分。

其他處理同實(shí)驗(yàn)案例1。統(tǒng)計(jì)污染率、繁殖系數(shù)和玻璃化率，公式同上。

其中，污染率＝污染的外植體數(shù)目/外植體總數(shù)×100％，其他指標(biāo)計(jì)算方法同上。

表2不同滅菌組合對(duì)大蒜不定芽污染率、繁殖系數(shù)和玻璃化率的影響

表注：表中小寫字母表示差異顯著(p<0.05)

結(jié)果表明：采用本發(fā)明所述方案：75％酒精處理60到90秒，2％次氯酸鈉處理10到15分鐘時(shí)，可以在降低污染率和玻璃化率的同時(shí)，提高繁殖系數(shù)，特別優(yōu)選75％酒精處理60或者90秒，2％次氯酸鈉處理15分鐘；若酒精處理時(shí)間過短，則容易導(dǎo)致玻璃化率提高，若次氯酸鈉處理時(shí)間過長，則容易導(dǎo)致玻璃化率，且降低繁殖系數(shù)。

實(shí)施例3：

參照實(shí)施例1所述方法，供試材料為田間自然生長，自然抽薹后5天“二水早”花序軸，75％酒精處理60秒，2％次氯酸鈉處理15分鐘后，設(shè)置0.05％，0.10％，0.20，0.40％的過氧化氫處理5分鐘，其他處理和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法同實(shí)驗(yàn)案例1：

表3不同濃度過氧化氫對(duì)大蒜不定芽污染率、繁殖系數(shù)和玻璃化率的影響

結(jié)果表明：采用本發(fā)明所述方案，采用0.1～0.2％濃度的過氧化氫可以更進(jìn)一步預(yù)防污染，并明顯降低玻璃化率提高繁殖系數(shù)，當(dāng)?shù)陀诖藵舛葧r(shí)不僅污染率會(huì)急劇升高，且玻璃化率會(huì)顯著增加，若高于此濃度，則不僅玻璃化率升高、繁殖系數(shù)也會(huì)降低。

實(shí)施例4：

參照實(shí)施例1所述方法，供試材料為田間自然生長，自然抽薹后5天“二水早”花序軸。剝離花序軸外層苞葉，去除所有花序軸表面退化的花原基殘留物和膜質(zhì)苞片，花序軸的切割方式，設(shè)9個(gè)處理：

t1：去除花序軸0.1mm以下部分，不切割；

t2：去除花序軸0.1mm以下部分，縱切為2塊；

t3：去除花序軸0.1mm以下部分，縱切為4塊；

t4：去除花序軸0.3mm以下部分，不切割；

t5：去除花序軸0.3mm以下部分，縱切為2塊；

t6：去除花序軸0.3mm以下部分，縱切為4塊；

t7：去除花序軸0.5mm以下部分，不切割；

t8：去除花序軸0.5mm以下部分，縱切為2塊；

t9：去除花序軸0.5mm以下部分，縱切為4塊。

將切割好的外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其他處理同實(shí)施案例1。統(tǒng)計(jì)繁殖系數(shù)和玻璃化率，公式同上。

表4外植體切割方式對(duì)大蒜不定芽繁殖系數(shù)和玻璃化率的影響

表注：表中小寫字母表示差異顯著(p<0.05)

結(jié)果表明：本發(fā)明所述方案：去除花莖0.1～0.3mm以下部分，將無菌的花序軸縱切為2～4塊，可同時(shí)具有較高的繁殖系數(shù)和較低的玻璃化率，特別是留外植體下部0.1mm，切割為2塊和帶0.3mm花軸，切分為4塊的外植體；當(dāng)外植體下部所帶花莖長度常于此范圍，則會(huì)導(dǎo)致玻璃化率增加。當(dāng)外植體不進(jìn)行切割，會(huì)導(dǎo)致較低的繁殖系數(shù)；此外，發(fā)明人另外發(fā)現(xiàn)切分?jǐn)?shù)增加，會(huì)導(dǎo)致玻璃化率增加。

實(shí)施例5：

參照實(shí)施例1所述方法，供試材料為田間自然生長，自然抽薹后5天“二水早”花序軸，將無菌的花序軸縱切為2塊，設(shè)4個(gè)處理：

t1：1/2倍b5培養(yǎng)基；

t2：1倍b5培養(yǎng)基；

t3：1/2倍ms培養(yǎng)基；

t4：1倍ms培養(yǎng)基；

培養(yǎng)基成分及其他處理同實(shí)施案例1。

表5基本培養(yǎng)基種類和濃度對(duì)大蒜不定芽繁殖系數(shù)和玻璃化率的影響

表注：表中小寫字母表示差異顯著(p<0.05)

結(jié)果表明：本發(fā)明所采用的b5培養(yǎng)基上試管苗的繁殖系數(shù)顯著高于ms培養(yǎng)基，玻璃化率顯著低于ms培養(yǎng)基，說明本發(fā)明所采用的b5培養(yǎng)基更適合大蒜不定芽的誘導(dǎo)。且1/2倍b5培養(yǎng)基和1倍培養(yǎng)基之間的繁殖系數(shù)和玻璃化率差異不顯著，即適當(dāng)降低b5培養(yǎng)基的濃度不影響可獲得的正常試管苗數(shù)目，還可降低成本。

實(shí)施例6：

參照實(shí)施例1所述方法，供試材料為田間自然生長，自然抽薹后5天“二水早”花序軸，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配比為：0.1mg·l^-1萘乙酸，6-芐基氨基嘌呤，30g·l^-1蔗糖，6.5g·l^-1瓊脂，ph5.8；其中培養(yǎng)基中6-芐基氨基嘌呤的濃度設(shè)置4個(gè)處理：0.5，1，2，4mg/l。其他處理同案例1，培養(yǎng)20天后統(tǒng)計(jì)繁殖系數(shù)和玻璃化發(fā)生情況。

表6細(xì)胞分裂素濃度對(duì)大蒜不定芽繁殖系數(shù)和玻璃化率的影響

表注：表中小寫字母表示差異顯著(p<0.05)

結(jié)果表明：本發(fā)明所選用的6-芐基氨基嘌呤濃度1～2mg/l可同時(shí)具有較高的繁殖系數(shù)和較低的玻璃化率，當(dāng)?shù)陀诖朔秶鷷r(shí)，繁殖系數(shù)會(huì)降低，當(dāng)高于此范圍時(shí)，玻璃化率會(huì)急劇增加。

實(shí)施例7：

參照實(shí)施例1所述方法，供試材料為田間自然生長，自然抽薹后5天“二水早”花序軸，滅菌和切割處理聽案例1，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配比為0.1mg·l^-1萘乙酸，1～2mg·l^-16-芐基氨基嘌呤，15～30g·l^-1蔗糖，瓊脂，ph5.8～6.0，其中培養(yǎng)基中瓊脂的濃度設(shè)置4個(gè)處理：0.3，0.45，0.65，0.75mg/l。培養(yǎng)20天后統(tǒng)計(jì)繁殖系數(shù)和玻璃化發(fā)生情況。其他處理同案例1

表7瓊脂濃度對(duì)大蒜不定芽繁殖系數(shù)和玻璃化率的影響

表注：表中小寫字母表示差異顯著(p<0.05)

結(jié)果表明：選用本發(fā)明所述的6.0～7.5g·l^-1瓊脂，可以顯著降低玻璃化率，提高正常試管苗的數(shù)量，低于此范圍則會(huì)顯著提高玻璃化率。

實(shí)施例8：

參照實(shí)施例1所述方法，供試材料為田間自然生長，自然抽薹后5天“二水早”花序軸，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配比為0.1mg·l^-1萘乙酸，1～2mg·l^-16-芐基氨基嘌呤，15～30g·l^-1蔗糖，6.0～7.5g·l^-1瓊脂，所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，ph設(shè)置5個(gè)處理：5.4,5.8,6.2,6.4,6.8。培養(yǎng)20天后統(tǒng)計(jì)繁殖系數(shù)和玻璃化發(fā)生情況。其他處理同案例1。

表8ph對(duì)大蒜不定芽繁殖系數(shù)和玻璃化率的影響

表注：表中小寫字母表示差異顯著(p<0.05)

結(jié)果表明：本發(fā)明所選用的ph為5.8和6.0時(shí)，可可大大降低玻璃化率，提高繁殖系數(shù)和正常試管苗的數(shù)量；低于或高于此范圍時(shí)，玻璃化率會(huì)提高，且繁殖系數(shù)和正常試管苗數(shù)量均會(huì)下降。

實(shí)施例9：

參照實(shí)施例1所述方法，取正常不定芽，接種到繼代生根培養(yǎng)基的配比為30～45g·l^-1蔗糖，7.0～7.5g·l^-1瓊脂，0.5～1mg·l^-16-芐基氨基嘌呤，0.1mg·l^-1萘乙酸，活性炭，ph5.8～6.0，其中活性炭濃度分別設(shè)置4個(gè)處理：0.001％、0.0025％、0.005％和0.01％，統(tǒng)計(jì)試管苗生根情況。其他條件同實(shí)施案例1。

結(jié)果見圖2，本發(fā)明所采用的活性炭濃度可以顯著增加試管苗的生根率，特別是采用本發(fā)明所述的0.5～1g·l^-1活性炭，可以顯著提高生根率。

實(shí)施例10：

參照實(shí)施例1所述方法，供試材料為田間自然生長，自然抽薹后5天“二水早”、“徐州白”、“正月早”和“葡萄牙”花序軸，剪下總苞帶1cm左右薹段，完全浸沒在飽和洗衣粉溶液中約30分鐘，用流水沖洗約30分鐘表面滅菌，將充分洗凈的材料置于超凈工作臺(tái)，以75％酒精表面消毒60秒，用無菌水沖洗1次，接著用2％次氯酸鈉溶液處理10分鐘，用無菌水沖洗5次，0.1％過氧化氫處理5分鐘后，用無菌水沖洗3次，最后置于無菌濾紙上吸干表面水分；剝離花序軸外層苞葉，去除所有花序軸表面退化的花原基殘留物和膜質(zhì)苞片，去除花莖0.2mm以下部分，將無菌的花序軸縱切為2塊；將切割好的外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1/2倍b5培養(yǎng)基，0.1mg·l^-1萘乙酸，1mg·l^-16-芐基氨基嘌，15g·l^-1蔗糖，6.5g·l^-1瓊脂，ph5.8)，置于光照強(qiáng)度為100μmolm^-2s^-1，光照時(shí)間為12h·d^-1，25℃，條件下培養(yǎng)20天后統(tǒng)計(jì)獲得繁殖系數(shù)和玻璃化率。

表9不同品種在優(yōu)化條件下的不定芽和試管苗再生情況

結(jié)果表明，本實(shí)施例所述的方法四個(gè)品種的繁殖系數(shù)較高，玻璃化率都低于5％，在保證較高繁殖系數(shù)的同時(shí)，大大降低了大蒜試管苗玻璃化率；說明本發(fā)明所述方法可適用于不同品種的大蒜，即適用范圍更廣。

將獲得的正常不定芽接種到繼代生根培養(yǎng)基(1倍b5培養(yǎng)基，30g·l^-1蔗糖，6.5g·l^-1瓊脂，1mg·l^-16^-1芐基氨基嘌，0.1mg·l^-1萘乙酸，ph5.8)中，置于光照強(qiáng)度為100μmolm^-2s^-1，光照時(shí)間為12h·d^-1，25℃條件下培養(yǎng)20天后沒有發(fā)現(xiàn)玻璃化的試管苗；說明所述方法所獲得的不定芽品質(zhì)穩(wěn)定，后期不易發(fā)生玻璃化。

實(shí)施例11：

按實(shí)施案例1所述的方法，待花序軸分化出不定芽，一旦觀察到發(fā)生玻璃化的不定芽后，盡快將玻璃化試管芽接種到不定芽恢復(fù)培養(yǎng)基中，晴天的白天將帶有不定芽的培養(yǎng)瓶置于自然光下處理3h～10h，夜晚置于光照強(qiáng)度為100～200μmolm^-2s^-1，22～28℃的培養(yǎng)間，連續(xù)處理1～5天；所述不定芽恢復(fù)培養(yǎng)基配比為30～35g·l^-1蔗糖，7.0～8.0g·l^-1瓊脂，ph5.8～6.0，通過恢復(fù)處理，恢復(fù)率達(dá)82.5％以上。

同樣的，培養(yǎng)的試管苗，一旦發(fā)生玻璃化，盡快將玻璃化試管苗接種到試管苗恢復(fù)培養(yǎng)基中，晴天的白天將帶有不定芽的培養(yǎng)瓶置于自然光下處理3h～10h，夜晚置于光照強(qiáng)度為100～200μmolm^-2s^-1，22～28℃的培養(yǎng)間，連續(xù)處理1～5天；所述試管苗恢復(fù)培養(yǎng)基的配比為30～35g·l^-1蔗糖，7.0～8.0g·l^-1瓊脂，0.5～1g·l^-1活性炭，ph5.8～6.0，通過恢復(fù)處理，恢復(fù)率可達(dá)100％。

通過兩步恢復(fù)處理，可以使整個(gè)大蒜組織培養(yǎng)方法的玻璃化率總體上降低至5％以下，繁殖系可達(dá)73.0。

實(shí)施例12：

供試材料為田間自然生長，采收自然抽薹后5天的“二水早”花序軸，花序軸用保鮮膜密封保存，分別以冷藏0、10、20、40天的花序軸為外植體用于實(shí)驗(yàn)，其他處理同實(shí)施案例1，如圖1所示。統(tǒng)計(jì)花序軸再生系數(shù)。

結(jié)果見圖3(表注：表中小寫字母表示差異顯著(p<0.05))，結(jié)果表明：本實(shí)施例所述的冷藏保存方法對(duì)大蒜組培的再生能力具有很好的保護(hù)作用，保藏10天以內(nèi)對(duì)大蒜組織培養(yǎng)的再生能力沒有影響，隨著冷藏保存的時(shí)間延長，大蒜的繁殖系數(shù)降低，處理40天后的每花序軸再生系數(shù)依然較高，為32。