本發(fā)明涉及一種無花果種苗組織培養(yǎng)方法，屬于無花果組培快繁技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
無花果(學(xué)名：ficuscarical.)，別稱映日果、奶漿果、蜜果、樹地瓜、天仙果、明目果、菩提圣果，是一種開花植物，隸屬于?？崎艑?，主要生長于一些熱帶和溫帶的地方，屬亞熱帶落葉小喬木。無花果有較強的耐鹽性，耐瘠薄，根系發(fā)達(dá)、管理簡單，其果營養(yǎng)豐富，具有提高免疫功能的作用，經(jīng)常食用能增強抗病能力。因此，近年來無花果在我國栽培面積迅速擴大。
無花果優(yōu)良品種之一布蘭瑞克，原產(chǎn)法國，是夏秋果兼用品種。該品種果較大，果肉淡粉紅色，含糖量16-17％，風(fēng)味香甜，品質(zhì)上等。深受市場歡迎，目前已經(jīng)成為我華東地區(qū)主栽品種之一。
目前生產(chǎn)上無花果的苗木繁殖多采用扦插繁殖方法，但由于此方法費時費工，且通過土壤繁殖，插條生根量少，難以滿足當(dāng)前大面積栽培及推廣無花果優(yōu)良品種的需要。組織培養(yǎng)技術(shù)在許多國家都已被廣泛應(yīng)用于果樹繁殖中，我國近年來曾有人用離體培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖無花果的報道，因外植體褐化嚴(yán)重、繁殖系數(shù)低，移栽成活率不高，均處于試驗階段。
在無花果離體快繁過程中，不同品種組織離體成功率有著較大差異，這是因為基因型往往決定著離體培養(yǎng)的成敗，不同基因型對不同激素的種類及濃度搭配要求不同?，F(xiàn)有技術(shù)中雖然報道了麥斯衣陶芬、波姬紅、青皮等品種的組織培養(yǎng)離體快繁技術(shù)，但是將其應(yīng)用于布蘭瑞克無花果，則無法達(dá)到理想的效果。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
發(fā)明目的：為了克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種無花果種苗組織培養(yǎng)方法。
技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明公開了一種無花果種苗組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)外植體準(zhǔn)備：早春無花果植株新梢萌發(fā)時，從其植株上剪取2-4cm嫩梢，然后依次進行清洗、修剪成帶腋芽莖段、防褐化處理和消毒處理，備用；
(2)初代培養(yǎng)：接種前，誘導(dǎo)培養(yǎng)基熱壓消毒滅菌，然后將步驟(1)處理所得外植體下端扦插入該培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為22-30℃，光照強度1500-2500lux，待小苗長至0.4-0.6厘米時即可切下，轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)；
(3)繼代培養(yǎng)：將步驟(2)初代培養(yǎng)后的叢生苗每4-6株切成一塊，接種到繼代培養(yǎng)基上，在溫度23-37℃，光照強度1500-2500lux，每日光照一小時條件下培養(yǎng)；
(4)生根培養(yǎng)：將步驟(3)繼代培養(yǎng)后的芽苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在溫度為23-27℃，光照強度500-2500lux，每日光照12小時，培養(yǎng)20-25天后，將形成白色短根的芽苗進行馴化培養(yǎng)；
(5)幼苗馴化：將生根培養(yǎng)后的芽苗移入馴化基質(zhì)中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為10-20℃,濕度為60-80％，遮光率為50-80％，培養(yǎng)5-7天，采用噴霧狀澆水。
優(yōu)選，所述無花果為布蘭瑞克無花果。
優(yōu)選，步驟(1)所述清洗的方法為：用洗衣粉刷洗外植體表面，再用自來水反復(fù)沖洗干凈。
優(yōu)選，步驟(1)所述修剪成帶腋芽莖段的方法為：在無菌條件下將嫩梢切成0.5cm左右的帶腋芽莖段，放入保鮮袋中備用。
優(yōu)選，步驟(1)所述防褐化處理的方法為：將裝有帶腋芽莖段的保鮮袋放入2-5℃的冰箱，預(yù)冷12-24小時后取出，擦干表面水分，置于的pvp(聚乙烯吡咯烷酮)1500mg/l液中浸泡20-30分鐘，備用。
優(yōu)選，步驟(1)所述消毒處理的方法為：將進行過防褐化處理的外植體用75％酒精浸泡4～5s，后用無菌水沖洗4～6次，然后再放入0.1％升汞溶液浸泡6～7min，在以上過程中要不斷地?fù)u動，以便外植體與溶液充分接觸，最再用無菌清水反復(fù)沖洗外植體數(shù)遍，直至將殘留升汞完全沖洗干凈，最后用無菌紙吸干外植體表面水分，備用。
優(yōu)選，步驟(2)所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的主要成分為：wpm+1.0-2.0tdzmg/l+naa0.1-0.2mg/l+0.2-0.5％活性炭，ph＝6.0。
優(yōu)選，步驟(3)所述繼代培養(yǎng)基的主要成分為：ms+6-ba1.2-1.6mg/l+naa0.1-0.2mg/l+ga30.5-1.0mg/l培養(yǎng)基上，ph值為5.8。
優(yōu)選，步驟(4)所述生根培養(yǎng)基的主要成分為：1/2ms+iba0.2--0.8mg/l+naa0.1-0.5mg/l+0.2-0.5％活性炭+蔗糖10-30g/l，ph＝5.8。
優(yōu)選，步驟(5)所述馴化基質(zhì)是由珍珠巖、石英砂和泥碳按體積比1:0.5:2混合而成的馴化基質(zhì)。
技術(shù)效果：相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的無花果離體快繁技術(shù)是通過采用植物組織培養(yǎng)方法，可以在較短時間內(nèi)獲得大量的無花果組織苗，開辟一了條新的無花果種苗繁育途徑，大大縮短了無花果種苗的繁殖周期，加快了無花果種苗無性繁殖的速度，從而能夠有效提高了無花果的生產(chǎn)效率。另外本發(fā)明的方法打破了氣候和土壤對無花果繁殖的限制，通過采用特定的組織培養(yǎng)方法，有效的解決了布蘭瑞克無花果播種繁殖慢、扦插發(fā)芽率和成活率低的問題。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發(fā)明做進一步的詳細(xì)說明。
實施例1：江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院教學(xué)組織實驗室
步驟1外植體準(zhǔn)備
外植體沖洗：早春無花果植株新梢萌發(fā)時，從布蘭瑞克無花果植株上剪取2cm嫩梢，用洗衣粉刷洗表面，再用自來水反復(fù)沖洗干凈，后最后在無菌條件下將嫩梢切成0.5cm左右的帶腋芽莖段，放入保鮮袋中備用。
外植體防褐化處理：將裝有帶腋芽莖段的保鮮袋放入2℃的冰箱，預(yù)冷15小時后取出,擦干表面水分，置于的pvp(聚乙烯吡咯烷酮)1500mg/l液中浸泡225分鐘，備用。
外植體消毒：將進行防褐化過的外植體用75％酒精浸泡4s，后用無菌水沖洗5次，然后再放入0.1％升汞溶液浸泡6min，在以上過程中要不斷地?fù)u動，以便外植體與溶液充分接觸，最再用無菌清水反復(fù)沖洗外植體數(shù)遍,直至將殘留升汞完全沖洗干凈，最后用無菌紙吸干外植體表面水分，備用。
步驟2初代培養(yǎng)
接種前，將培養(yǎng)基采用1.1kg/cm2大氣壓熱壓消毒滅菌15分鐘，培養(yǎng)基消毒后將帶腋芽莖段下端扦插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)25天，待小苗長至0.4厘米時即可切下，轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為wpm+1.5tdzmg/l+naa0.1mg/l+0.3％活性炭。ph＝6.0培養(yǎng)溫度為25℃，光照強度1500lux。
步驟3繼代培養(yǎng)
將初代培養(yǎng)后的叢生苗每6株切成一塊，接種到培養(yǎng)基ms+6-ba1.5mg/l+naa0.1mg/l+ga30.5mg/l培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基的ph值為5.8，在溫度25℃，光照強度1500lux，每日光照一小時，培養(yǎng)天后小苗分割形成單株苗，在轉(zhuǎn)苗過程中,去掉原生葉片有利于新苗分化。
步驟4生根培養(yǎng)
將擴大繁殖培養(yǎng)后的芽苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為1/2ms+iba0.5mg/l+naa0.15mg/l+0.3％活性炭+蔗糖20g/l，ph＝5.8，在溫度為25℃，光照強度1500lux，每日光照12小時，培養(yǎng)室溫度為25℃。培養(yǎng)20天后，將形成白色短根的芽苗進行馴化培養(yǎng)。
步驟5幼苗馴化
將生根培養(yǎng)后的芽苗移入珍珠巖、石英砂和泥碳按體積比1:0.5:2混合而成的馴化基質(zhì)中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為115℃，濕度為60-80％，遮光率為50％，培養(yǎng)5天，一周后，可逐漸增強日光照射，采用噴霧狀澆水，水量不宜過大，落干后再噴。
采用上述方法，可以使布蘭瑞克無花果種苗的繁殖周期從傳統(tǒng)的12個月縮短至90天左右，且種苗的繁殖系數(shù)是傳統(tǒng)繁殖方法(扦插繁殖)500倍左右；此外與現(xiàn)有無花果常規(guī)組織培養(yǎng)方法相比，本方法可以無花果組培苗繼代培養(yǎng)增殖率達(dá)28.1倍，生根率在98.2％，幼苗移栽培成活率達(dá)96.2％，外植體褐化為0.32％。
實施例2：江蘇鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所組織培養(yǎng)室
步驟1外植體準(zhǔn)備
外植體沖洗：早春無花果植株新梢萌發(fā)時，從布蘭瑞克無花果植株上剪取3cm嫩梢，用洗衣粉刷洗表面，再用自來水反復(fù)沖洗干凈，后最后在無菌條件下將嫩梢切成0.5cm左右的帶腋芽莖段，放入保鮮袋中備用。
外植體防褐化處理：將裝有帶腋芽莖段的保鮮袋放入5℃的冰箱，預(yù)冷12小時后取出，擦干表面水分，置于的pvp(聚乙烯吡咯烷酮)1500mg/l液中浸泡25分鐘，備用。
外植體消毒：將進行防褐化過的外植體用75％酒精浸泡5s，后用無菌水沖洗5次，然后再放入0.1％升汞溶液浸泡7min，在以上過程中要不斷地?fù)u動，以便外植體與溶液充分接觸，最再用無菌清水反復(fù)沖洗外植體數(shù)遍,直至將殘留升汞完全沖洗干凈，最后用無菌紙吸干外植體表面水分，備用。
步驟2初代培養(yǎng)
接種前，將培養(yǎng)基采用1.1kg/cm2大氣壓熱壓消毒滅菌20分鐘，培養(yǎng)基消毒后將帶腋芽莖段下端扦插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30天，待小苗長至0.6厘米左右時即可切下，轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為wpm+1.0tdzmg/l+naa0.1mg/l+0.3％活性炭。ph＝6.0培養(yǎng)溫度為28℃，光照強度2000lux。
步驟3繼代培養(yǎng)
將初代培養(yǎng)后的叢生苗每6株切成一塊，接種到培養(yǎng)基ms+6-ba1.5mg/l+naa0.15mg/l+ga31.0mg/l培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基的ph值為6.0，在溫度28℃，光照強度2000lux，每日光照一小時，培養(yǎng)天后小苗分割形成單株苗,在轉(zhuǎn)苗過程中，去掉原生葉片有利于新苗分化。
步驟4生根培養(yǎng)
將擴大繁殖培養(yǎng)后的芽苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為1/2ms+iba0.5mg/l+naa0.5mg/l+0.3％活性炭+蔗糖20g/l，ph＝5.8，在溫度為25℃，光照強度2000lux，每日光照12小時，培養(yǎng)室溫度為20℃。培養(yǎng)25天后，將形成白色短根的芽苗進行馴化培養(yǎng)。
步驟5幼苗馴化
將生根培養(yǎng)后的芽苗移入珍珠巖、石英砂和泥碳按體積比1:0.5:2混合而成的馴化基質(zhì)中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為15℃，濕度為70％，遮光率為65％，培養(yǎng)7天，一周后，可逐漸增強日光照射，采用噴霧狀澆水，水量不宜過大，落干后再噴。
采用上述方法，可以使布蘭瑞克無花果種苗的繁殖周期從傳統(tǒng)的12個月縮短至90天左右，且種苗的繁殖系數(shù)是傳統(tǒng)繁殖方法(扦插繁殖)500倍左右；此外與現(xiàn)有無花果常規(guī)組織培養(yǎng)方法相比，本方法可以無花果組培苗繼代培養(yǎng)增殖率達(dá)28.1倍，生根率在98.2％，幼苗移栽培成活率達(dá)96.2％，外植體褐化為0.32％。
實施例3：句容康態(tài)園藝有限公司
步驟1外植體準(zhǔn)備
外植體沖洗：早春無花果植株新梢萌發(fā)時，從布蘭瑞克無花果植株上剪取3cm嫩梢，用洗衣粉刷洗表面，再用自來水反復(fù)沖洗干凈，后最后在無菌條件下將嫩梢切成0.3cm左右的帶腋芽莖段，放入保鮮袋中備用。
外植體防褐化處理：將裝有帶腋芽莖段的保鮮袋放入2℃的冰箱，預(yù)冷15小時后取出,擦干表面水分，置于的pvp(聚乙烯吡咯烷酮)1500mg/l液中浸泡225分鐘，備用。
外植體消毒：將進行防褐化過的外植體用75％酒精浸泡5s，后用無菌水沖洗5次，然后再放入0.1％升汞溶液浸泡5min，在以上過程中要不斷地?fù)u動，以便外植體與溶液充分接觸，最再用無菌清水反復(fù)沖洗外植體數(shù)遍，直至將殘留升汞完全沖洗干凈，最后用無菌紙吸干外植體表面水分，備用。
步驟2初代培養(yǎng)
接種前，將培養(yǎng)基采用1.1kg/cm2大氣壓熱壓消毒滅菌15分鐘，培養(yǎng)基消毒后將帶腋芽莖段下端扦插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,培養(yǎng)25天，待小苗長至0.5厘米時即可切下，轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為wpm+1.5tdzmg/l+naa0.15mg/l+0.2％活性炭。ph＝5.8培養(yǎng)溫度為22℃，光照強度1500lux。
步驟3繼代培養(yǎng)
初代培養(yǎng)后的叢生苗每6株切成一塊，接種到培養(yǎng)基ms+6-ba1.5mg/l+naa0.15mg/l+ga31.0mg/l培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基的ph值為5.8，在溫度25℃，光照強度1500lux，每日光照一小時，培養(yǎng)天后小苗分割形成單株苗,在轉(zhuǎn)苗過程中，去掉原生葉片有利于新苗分化。
步驟4生根培養(yǎng)
將擴大繁殖培養(yǎng)后的芽苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為1/2ms+iba0.5mg/l+naa0.1mg/l+0.2％活性炭+蔗糖25g/l，ph＝5.8，在溫度為25℃，光照強度1500lux，每日光照12小時，培養(yǎng)室溫度為25℃。培養(yǎng)20天后，將形成白色短根的芽苗進行馴化培養(yǎng)。
步驟5幼苗馴化
將生根培養(yǎng)后的芽苗移入珍珠巖、石英砂和泥碳按體積比1:0.5:2混合而成的馴化基質(zhì)中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為15℃，濕度為80％，遮光率為65％，培養(yǎng)5天，一周后，可逐漸增強日光照射，采用噴霧狀澆水，水量不宜過大,落干后再噴。
采用上述方法，可以使布蘭瑞克無花果種苗的繁殖周期從傳統(tǒng)的12個月縮短至90天左右，且種苗的繁殖系數(shù)是傳統(tǒng)繁殖方法(扦插繁殖)500倍左右；此外與現(xiàn)有無花果常規(guī)組織培養(yǎng)方法相比，本方法可以無花果組培苗繼代培養(yǎng)增殖率達(dá)28.1倍，生根率在98.2％，幼苗移栽培成活率達(dá)96.2％，外植體褐化為0.32％)
對比例：
采用現(xiàn)有技術(shù)中其他品種的組織培養(yǎng)方法(吳欽林，波姬紅無花果莖段離體快繁技術(shù)研究，安徽家農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，08；李金風(fēng)，糜林等，麥斯衣陶芬無花果離體快速增殖方法，專利申請?zhí)枺?01310177190.x)對布蘭瑞克無花果進行組織培養(yǎng)，其繼代增殖率僅為12.1倍，生根率85.1％，幼苗移栽成活率82.2％，外植體褐化率：12.5％。