本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種富硒蟬花蟲草、其培養(yǎng)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蟬花，又名蟲花、蟬草、蟬茸等，是蟬棒束孢(亦稱蟬擬青霉)寄生在某些蟬若蟲上形成的菌蟲復(fù)合體；是真菌界、子囊菌門、糞殼菌綱、肉座菌目、麥角菌科、蟲草屬真菌，為中國(guó)名貴傳統(tǒng)中藥材；主要分布于安徽、云南、福建、浙江、江西、四川等地。蟬花的許多活性和營(yíng)養(yǎng)成分與冬蟲夏草類似，有些成分的含量甚至高于冬蟲夏草。而且是目前已有報(bào)道的500余種蟲草菌中極少數(shù)可以大規(guī)模培養(yǎng)的蟲草之一。與冬蟲夏草一樣，蟬花能滋補(bǔ)人體，具有多種藥理功能，是冬蟲夏草的理想替代品。人工培養(yǎng)的蟬花的蛋白質(zhì)、氨基酸、必須氨基酸、微量元素鉀和鎂的含量均超過冬蟲夏草和蛹蟲草。多糖作為其主要的一種功效成分，具有多種藥理活性。研究表明，蟬花多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤、抗病毒、抗疲勞、抗應(yīng)激作用、鎮(zhèn)靜催眠作用、滋補(bǔ)強(qiáng)壯作用、解熱鎮(zhèn)痛作用、改善腎功能、促進(jìn)造血系統(tǒng)功能、提升營(yíng)養(yǎng)狀況等作用。

現(xiàn)代流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)，缺硒可導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生。目前已知的與缺硒有關(guān)的人類疾病有40多種，包括癌癥、心腦血管疾病、糖尿病、肝病、高血壓、性功能減退等，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)艾滋病人的血硒含量低于正常人體血硒含量。中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦國(guó)人每日從飲食中攝取的硒為50-250微克之間，世界衛(wèi)生組織推薦的人體每日硒攝入量為400微克。我國(guó)是一個(gè)貧硒國(guó)，72％的地區(qū)處于土壤貧硒帶。國(guó)人每日正常硒攝入量?jī)H為17-32微克之間，最低在8微克以下，按此標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)人硒的攝入量不足，長(zhǎng)此以往，對(duì)人體健康會(huì)造成不利影響，因此，補(bǔ)硒對(duì)于維持缺硒人群健康十分重要。以往補(bǔ)硒采用直接補(bǔ)充無(wú)機(jī)硒的方法，無(wú)機(jī)硒(主要是亞硒酸鈉)吸收不穩(wěn)定，而且安全量不易把握，易造成中毒，有機(jī)補(bǔ)硒的方法逐步成為人們補(bǔ)硒的重要途徑。近年來(lái)，隨著人們對(duì)硒的作用及食品安全的深入認(rèn)識(shí)，通過食用富含有機(jī)硒的食品補(bǔ)硒成為人體補(bǔ)硒的重要形式，但目前能夠提供穩(wěn)定有機(jī)硒含量的食品非常少，很難達(dá)到定量補(bǔ)硒的目的。研究證明：大部分糧食、蔬菜等農(nóng)作物對(duì)硒元素的吸收是有限的，甚至是不能吸收，而真菌對(duì)硒元素的吸收別比較好。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種富硒蟬花蟲草、其培養(yǎng)方法及應(yīng)用。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種富硒蟬花蟲草的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

(1)在培養(yǎng)基上進(jìn)行蟬花蟲草菌種的活化培養(yǎng)；

(2)制備含硒酸鹽的液體培養(yǎng)基，將活化后的蟬花蟲草菌種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；

(3)制備子實(shí)體富硒培養(yǎng)基，培養(yǎng)富硒蟬花蟲草孢梗束；

(4)采收后的富硒蟬花蟲草在45℃以下烘干或冷凍干燥，使其含水量控制在8％以下后儲(chǔ)存。

優(yōu)選地，步驟(1)所述的培養(yǎng)基為pda培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為20～25℃，培養(yǎng)時(shí)間為15～20天。

優(yōu)選地，步驟(2)所述的液體培養(yǎng)基的配方為：每1000ml水中含馬鈴薯200g、蔗糖20g、磷酸二氫鉀0.3g、硫酸鎂0.15g、硒酸鹽20mg。

優(yōu)選地，步驟(2)所述的發(fā)酵培養(yǎng)包括以下步驟：

(21)選取步驟(1)活化后產(chǎn)孢良好的蟬花蟲草菌種，用滅菌的蒸餾水配制成孢子懸浮液；

(22)將含硒酸鹽的液體培養(yǎng)基滅菌、分裝，每200～250ml液體培養(yǎng)基接種5～10ml孢子懸浮液，置于130～160r/min、20～25℃條件下的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～56小時(shí)；

(23)在種子罐中裝入罐體2/3體積的含硒酸鹽液體培養(yǎng)基和食用消泡劑，滅菌后冷卻至20～25℃，接入200～250ml步驟(22)培養(yǎng)后的菌種，在培養(yǎng)溫度為25±1℃，通氣量為1.0～1.5vvm的條件下培養(yǎng)36～48小時(shí)；

(24)在發(fā)酵罐中裝入罐體2/3體積的含硒酸鹽液體培養(yǎng)基和食用消泡劑，滅菌后冷卻至20～25℃，將種子罐中培養(yǎng)好的菌種通過已滅菌的移種管道轉(zhuǎn)入到發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度為25±1℃，通氣量為1.0～1.5vvm，經(jīng)36～48小時(shí)通氣培養(yǎng)，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后備用。

優(yōu)選地，步驟(3)所述的子實(shí)體富硒培養(yǎng)基采用小麥固體培養(yǎng)基，包括小麥和培養(yǎng)液；小麥的添加量為使滅菌前小麥在容器內(nèi)的厚度達(dá)到1.5～2cm，培養(yǎng)液的量為使小麥吸收培養(yǎng)液且滅菌后厚度達(dá)到2～3cm。

優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液為：蟬蛹粉50g/l、硒酸鹽50～100mg/l、kh2po40.5g/l、mgso40.3g/l的水溶液。

優(yōu)選地，步驟(3)所述的培養(yǎng)富硒蟬花蟲草孢梗束包括以下步驟：將經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的蟬花蟲草菌種接種到滅菌后的子實(shí)體富硒培養(yǎng)基中，每33～45ml培養(yǎng)基接種5～10ml菌種，在22～25℃、濕度70～80％的條件下避光、無(wú)菌、透氣培養(yǎng)3～5天；待白色菌絲體在培養(yǎng)基表面全部長(zhǎng)滿后，開始光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度保持在100～200lx，且避免直射光照射，并控制濕度在75～90％；經(jīng)20～30天的培養(yǎng)，子實(shí)體成熟部分頂端產(chǎn)孢即可采收。

優(yōu)選地，所述硒酸鹽為硒酸鈉、亞硒酸鈉、硒酸鉀、硒酸銨中的至少一種。

本發(fā)明還保護(hù)利用所述的一種富硒蟬花蟲草的培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的富硒蟬花蟲草。

本發(fā)明還進(jìn)一步保護(hù)所述富硒蟬花蟲草在制備藥物或保健品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：

本方法以蟬花蟲草作為硒元素的轉(zhuǎn)化載體，將一定微量的硒元素添加到蟬花蟲草的培養(yǎng)基中，通過菌絲的吸收和轉(zhuǎn)化變成安全、容易被人體吸收的有機(jī)硒。用該方法培養(yǎng)獲得的蟬花蟲草孢梗束能大幅度提高有機(jī)硒含量，子實(shí)體硒含量可達(dá)84-146mg/kg，且蟬花蟲草子實(shí)體的生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、色澤鮮艷，從而提高了蟬花的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值；另外，本發(fā)明實(shí)施條件容易達(dá)到，所以能進(jìn)行大規(guī)模行業(yè)推廣。

本發(fā)明培養(yǎng)方法在蟬花蟲草液體菌種培養(yǎng)的過程中就添加硒酸鹽，馴化蟬花蟲草菌種對(duì)含硒培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)，在菌絲生長(zhǎng)的同時(shí)從培養(yǎng)液中吸收、轉(zhuǎn)化和積累硒元素；在固體培養(yǎng)階段增大培養(yǎng)基中硒酸鹽的濃度，以增加蟬花蟲草菌絲和子實(shí)體形成過程中對(duì)硒的轉(zhuǎn)化和積累。依據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的蟬花蟲草子實(shí)體的硒含量比普通方法培養(yǎng)的蟬花蟲草子實(shí)體硒含量增加400-800倍。實(shí)驗(yàn)表明，在蟬花蟲草培養(yǎng)基中添加硒酸鹽，對(duì)蟬花蟲草子實(shí)體的產(chǎn)量還有一定的促進(jìn)作用。

具體實(shí)施方式

為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，以下實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明而非對(duì)其加以限定。

一種富硒蟬花蟲草的培養(yǎng)方法，該方法包括如下步驟：

第一步：菌種活化培養(yǎng)

1、培養(yǎng)基成分構(gòu)成：

馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂18g～20g、水1000ml；

2、制備方法

將洗凈去皮的馬鈴薯200g切成薄片加入一定量的水煮沸半小時(shí)，用6-8層細(xì)紗布濾去馬鈴薯殘?jiān)?，加入蔗?0g，瓊脂20g，用水量補(bǔ)足1000ml，加熱煮沸5min以內(nèi)，待瓊脂完全溶化，趁熱迅速分裝到試管內(nèi)，每個(gè)試管裝5-7ml，用硅膠塞塞緊封口后開始滅菌，高壓滅菌鍋溫度達(dá)到121℃-123℃時(shí)保壓30min出鍋，趁熱將試管擺成斜面，培養(yǎng)基不得接觸硅膠塞，冷卻后斜面成固體狀。將在冰箱保存的蟬花蟲草菌種(該菌種已于2015年12月14日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為cctccno.2015745，保藏地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué))轉(zhuǎn)接至新配制的斜面培養(yǎng)基上，然后將試管放入20-25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15-20天左右，至大量產(chǎn)孢后即可備用。

第二步：富硒蟬花蟲草液體菌種的制備

1、培養(yǎng)基配方

馬鈴薯200g、蔗糖20g、磷酸二氫鉀0.3g、硫酸鎂0.15g、硒酸鹽20mg、水1000ml

2、制備方法

將洗凈去皮的馬鈴薯200g切成薄片加入一定量的水煮沸半小時(shí)，用細(xì)紗布濾去馬鈴薯殘?jiān)尤胝崽?0g、磷酸二氫鉀0.3g、硫酸鎂0.15g、硒酸鹽20mg、用水量補(bǔ)足1000ml，加熱煮沸5分鐘混勻，分裝于三角瓶500ml中，每瓶裝200-250ml。用硅膠塞封口，置于滅菌鍋中滅菌。溫度達(dá)到121℃-123℃時(shí)保壓20分鐘，冷卻后放入超凈工作臺(tái)，連同其他接種用品用具一起照射紫外線30min，準(zhǔn)備接種。添加磷酸二氫鉀、硫酸鎂的作用是由于蟬花在液體培養(yǎng)的過程中，ph值會(huì)減低，添加兩種鹽首先可以緩沖培養(yǎng)液的ph值變化，其次是給菌種生長(zhǎng)提供礦質(zhì)元素。添加低濃度的硒酸鹽是讓菌種適應(yīng)有硒元素的環(huán)境，利用其在固體培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)。

接種過程要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，所以接種用品用具和操作人員必須經(jīng)過無(wú)菌化處理之后方可進(jìn)行操作。接種過程是將產(chǎn)孢良好的蟬花蟲草斜面試管菌種，注入10ml滅菌的蒸餾水，用接種環(huán)刮下孢子后倒入50ml三角瓶配制成孢子懸浮液。每個(gè)500ml三角瓶接種5-10ml孢子懸浮液。液體培養(yǎng)基量增大時(shí)，接種量按上述比例類推增加。將接種好的三角瓶放置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，置于130-160r/min，25℃條件下的振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)36-56小時(shí)。

種子罐發(fā)酵培養(yǎng)：在30l氣升式發(fā)酵罐中裝入20l液體培養(yǎng)基和食用消泡劑，在121℃，0.11mpa條件下保壓滅菌30分鐘；滅菌后，冷卻至20-25℃時(shí)，將1瓶上述培養(yǎng)好的500ml搖瓶菌種在火焰保護(hù)下種接到發(fā)酵罐中，在培養(yǎng)溫度為25±1℃，通氣量為1.5vvm的條件下培養(yǎng)36-48小時(shí)。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：在300l氣升式發(fā)酵罐中裝入200l液體培養(yǎng)基和食用消泡劑，在121℃，0.11mpa條件下保壓滅菌30-45分鐘；滅菌后，冷卻至20-25℃時(shí)，將種子發(fā)酵罐中培養(yǎng)好菌種通過以滅菌的移種管道轉(zhuǎn)入到發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度為25±1℃，通氣量為1.5vvm，經(jīng)36-48小時(shí)通氣培養(yǎng)，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后備用。

第三步：富硒蟬花蟲草孢梗束的培養(yǎng)

1、培養(yǎng)基配方：

(采用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)時(shí))小麥30g/瓶、培養(yǎng)液33ml-45ml/瓶，

培養(yǎng)的容器既可以是培養(yǎng)瓶，也可以是pp材質(zhì)的培養(yǎng)盒或者培養(yǎng)袋(其中培養(yǎng)袋的厚度以8絲至10絲為宜)。小麥的添加量根據(jù)培養(yǎng)容器的不同而不同，使小麥滅菌前厚度為1.5-2cm，吸收培養(yǎng)液滅菌后厚度為2-3cm。培養(yǎng)基太薄其營(yíng)養(yǎng)不夠，太厚則單位培養(yǎng)基的產(chǎn)量較低。

培養(yǎng)液配方：蟬蛹粉50g/l、硒酸鹽50-100mg/l，kh2po40.5g/l和mgso40.3g/l的水溶液；硒酸鹽是硒酸鈉、亞硒酸鈉、硒酸鉀、硒酸銨中的一種；蟬蛹粉富含蛋氨酸、賴氨酸、色氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等多種氨基酸和b族維生素。稱取適量的蟬蛹粉，沸水蒸煮半小時(shí)，冷卻至室溫，并將硒酸鹽溶解于其中，使硒酸鹽的濃度為50～100mg/kg；將清洗的小麥按照1:1.1～1.4與上述培養(yǎng)液混合。

2、配制程序

根據(jù)實(shí)際需要的數(shù)量，按上述所列的培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，混合攪拌均勻，裝入清洗干凈的培養(yǎng)瓶中，用無(wú)菌透氣膜封口，橡皮筋包扎。放入滅菌鍋，在121℃溫度下高壓蒸汽滅菌30min。降溫后取出放入嚴(yán)格滅菌的接種臺(tái)中，將蟬花蟲草液體菌種接種到培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基上，每瓶接種5-10ml，無(wú)菌透氣膜封好口，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室中的培養(yǎng)架上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)室的溫度應(yīng)控制在22℃-25℃，濕度控制在70％-80％；避光培養(yǎng)3-5天，待白色菌絲體在培養(yǎng)基表面全部長(zhǎng)滿后，開始光照培養(yǎng)，照強(qiáng)度保持在100-200lx，但要避免直射光照射；此時(shí)培養(yǎng)室的濕度應(yīng)控制在75％-90％。經(jīng)24-28天的培養(yǎng)，子實(shí)體成熟部分頂端產(chǎn)孢即可采收。

采收后的富硒蟬花蟲草可在45℃以下的烘箱中烘干，也可以采用冷凍干燥法干，含水量必須保持在8％以下才可以儲(chǔ)存，包裝在真空密封的塑料袋中效果最佳。

檢測(cè)培養(yǎng)得到的富硒蟬花蟲草孢梗束中主要功能和營(yíng)養(yǎng)成分含量，結(jié)果如表1所示：

表1富硒蟬花蟲草孢梗束中主要功能和營(yíng)養(yǎng)成分含量

不同字母表示與對(duì)照組比較差異顯著，p<0.05

由上表1可以看出，經(jīng)過富硒培養(yǎng)的蟬花蟲草中含有硒元素，而且隨著培養(yǎng)料中硒含量的增加，蟬花蟲草孢梗束中硒的含量也逐漸增加。富硒蟬花蟲草孢梗束中腺苷的含量略有降低，甘露醇、粗脂肪和蛋白質(zhì)的含量隨著硒添加量增加而增加；粗纖維的含量卻因硒含量的增加而降低。

檢測(cè)培養(yǎng)得到的富硒蟬花蟲草孢梗束中氨基酸含量情況，結(jié)果如表2所示：

表2富硒蟬花蟲草孢梗束中氨基酸含量情況

由表2可以看出，培養(yǎng)料中硒的添加量對(duì)蟬花蟲草孢梗束中總氨基酸的含量無(wú)明顯的影響作用；部分硒添加劑量組必需氨基酸含量有所增加，必需氨基酸占總氨基酸中的比例略有增加，但增加的水平有限。

通過上述兩個(gè)表中的數(shù)據(jù)，可以看出，通過富硒培養(yǎng)的蟬花蟲草孢梗束中硒元素的含量明顯增加，同時(shí)部分營(yíng)養(yǎng)成分和功能成分的含量還有所改善。富硒蟬花蟲草不僅具有蟬花蟲草的功能還具有硒的功能和效果，可以制成保健食品作為缺硒人群的良好補(bǔ)劑，也可對(duì)慢性腎臟病患者進(jìn)行補(bǔ)硒治療，還能制成食用菌食品，提高蟬花的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值。

以上所述實(shí)施方式僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。