本發(fā)明涉及樹莓組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種誘導(dǎo)樹莓愈傷組織形成球形胚的方法。

背景技術(shù)：

樹莓作為新興的功能性水果，因其營養(yǎng)豐富，越來越受到消費(fèi)者的歡迎，市場的需求也變得越來越大。隨著樹莓的種植面積的擴(kuò)大，對樹莓的種源要求也變得多樣化，因此加快樹莓的育種研究變得十分緊迫。

樹莓多為野生品種，經(jīng)過人工選育獲得的栽培品種，是遺傳相對穩(wěn)定的植物品種，通過常規(guī)的雜交，很難獲得新的優(yōu)良性狀，常規(guī)育種發(fā)展遇到瓶頸。而基因轉(zhuǎn)化技術(shù)又受到市場的制約，不能產(chǎn)業(yè)化，因此，目前樹莓的育種基本采用誘變技術(shù)。常規(guī)的物理及化學(xué)誘變多采用種子或植株，誘變效率極低，采用胚性愈傷組織進(jìn)行誘變育種，可以大大提高誘變效率。但由于胚性愈傷組織誘導(dǎo)較為困難，如何提高胚性化細(xì)胞的誘導(dǎo)率是極需解決的問題。

據(jù)檢索，沒有發(fā)現(xiàn)有關(guān)樹莓體細(xì)胞胚誘導(dǎo)方面的文獻(xiàn)和專利，關(guān)于饑餓處理誘導(dǎo)胚性愈傷組織文獻(xiàn)也很少，但發(fā)現(xiàn)諸多關(guān)于樹莓營養(yǎng)繁殖和其他植物激素誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的文獻(xiàn)，具體公開內(nèi)容可總結(jié)幾類如下：

1、文獻(xiàn)2005年許欣然等在河南農(nóng)業(yè)科學(xué)發(fā)表的《棉花優(yōu)良品種中棉所27直接胚胎發(fā)生與植株再生》一文中提到了“饑餓處理”，但這里的饑餓處理是指外植體在培養(yǎng)基(ms無機(jī)鹽+b5維生素)誘導(dǎo)下形成的愈傷組織少或無愈傷組織，不轉(zhuǎn)瓶接著培養(yǎng)，這里的饑餓處理只是沒有添加激素，實(shí)際上是有營養(yǎng)的，和本發(fā)明使用的無菌水是完全不一樣的。

2、文獻(xiàn)2004年甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)李尚中的碩士論文《小麥幼胚高頻再生及外源dna電擊轉(zhuǎn)化體系的研究》一文中提到了“低溫(3-4℃)饑餓處理”，是將小麥的幼胚用濕紗布包住置于3-4℃冰箱中處理0天、3天、7天、14天、20天和30天，再接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織和胚性愈傷組織。此方法有低溫和饑餓兩個條件，但最主要的是低溫的影響，沒有接種到培養(yǎng)基上的幼胚外植體，外源營養(yǎng)對其無作用。

3、文獻(xiàn)2007年東北林業(yè)大學(xué)張宇的碩士論文《水曲柳體細(xì)胞胚胎發(fā)生的同步化調(diào)控》一文中提到了“饑餓法”，是指將具有早期原胚的外植體轉(zhuǎn)移到無微量元素和維生素的培養(yǎng)基是進(jìn)行饑餓培養(yǎng)。此饑餓處理的方法是針對營養(yǎng)繁殖的，和本發(fā)明的誘導(dǎo)胚性愈傷組織無關(guān)系。

4、文獻(xiàn)2013年揚(yáng)州大學(xué)楊緒清的碩士論文《碳源對黃瓜愈傷組織糖代謝相關(guān)酶的調(diào)控》中提到了“饑餓法”，是將愈傷組織轉(zhuǎn)移到無糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后進(jìn)行愈傷組織各種可溶性糖含量的測定，和本發(fā)明的誘導(dǎo)胚性愈傷組織無關(guān)系。

5、文獻(xiàn)申請?zhí)枺?3104794.7發(fā)明了一種樹莓苗木組織培養(yǎng)繁殖方法；文獻(xiàn)申請?zhí)枺?00810246902.8發(fā)明了一種細(xì)胞培養(yǎng)繁殖樹莓的方法；文獻(xiàn)申請?zhí)枺?00910095104.4發(fā)明了一種紅樹莓的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法；文獻(xiàn)申請?zhí)枺?01410258289.7發(fā)明了一種美國紅樹莓苗的無激素培養(yǎng)及快速繁殖方法；文獻(xiàn)申請?zhí)枺?01410250093.3，發(fā)明了一種通過組織培養(yǎng)繁育樹莓苗的方法。以上發(fā)明方法是將樹莓外植體依次接種于培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再將生根苗移到大棚，可以獲得大量無性繁殖的組培苗。這些僅僅是關(guān)于樹莓品種營養(yǎng)繁殖的方法，與本發(fā)明所涉及的樹莓體細(xì)胞再生方面的研究完全不同。

6、文獻(xiàn)申請?zhí)枺?01510443187.7發(fā)明了一種楸樹的體外培養(yǎng)方法；文獻(xiàn)申請?zhí)枺?01611193740.7發(fā)明了一種誘導(dǎo)重樓未成熟合子胚產(chǎn)生體細(xì)胞胚的組織培養(yǎng)方法；文獻(xiàn)申請?zhí)枺?01610341816.x，發(fā)明了一種板栗的體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)方法；文獻(xiàn)申請?zhí)枺荷暾執(zhí)?01510771278.3發(fā)明了一種提高紅松胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)胚率的方法；文獻(xiàn)申請?zhí)枺?01610960985.1發(fā)明了一種連香樹的體外培養(yǎng)方法。以上發(fā)明方法應(yīng)用的外植體或是合子胚或是幼胚等，再分別將外植體依次置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、再生培養(yǎng)基等誘導(dǎo)體胚萌發(fā)，得到實(shí)生苗。與本發(fā)明外植體選擇的材料不同，使用的誘導(dǎo)方法不同。

7、文獻(xiàn)申請?zhí)枺?01610888281.8發(fā)明了一種山葡萄體細(xì)胞胚及其培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基及應(yīng)用；文獻(xiàn)申請?zhí)枺?01610426774.x發(fā)明了一種浙江紅花油茶的體胚快繁育苗方法；文獻(xiàn)申請?zhí)枺?01610560228.5，發(fā)明了一種北五味子的擴(kuò)繁方法。以上發(fā)明方法主要是通過調(diào)整激素配方形成不同階段的培養(yǎng)基，將外植體依次誘導(dǎo)出愈傷組織、胚性愈傷組織及體細(xì)胞胚，但大都沒有提到誘導(dǎo)率或是誘導(dǎo)率不高。與本發(fā)明使用的誘導(dǎo)方法不同，獲得的誘導(dǎo)率不同。

8、文獻(xiàn)申請?zhí)枺?01610163915.3發(fā)明了一種絨毛白蠟離體葉片體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率可達(dá)79％；文獻(xiàn)申請?zhí)枺?01610038247.1發(fā)明了一種高效誘導(dǎo)雜種檀香體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生的方法，誘導(dǎo)率可達(dá)80％以上；文獻(xiàn)申請?zhí)枺?01610017997.0發(fā)明了一種國槐離體葉片體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的快速繁殖方法，誘導(dǎo)率可達(dá)80％以上；文獻(xiàn)申請?zhí)枺?01510939742.5一種梨樹離體葉片體細(xì)胞胚誘導(dǎo)快繁培養(yǎng)方法；文獻(xiàn)申請?zhí)枺?01510779403.5發(fā)明了一種海桐體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生的方法；文獻(xiàn)申請?zhí)枺?01610727969.8，發(fā)明了一種無患子體細(xì)胞胚同步化的懸浮培養(yǎng)方法，誘導(dǎo)率達(dá)到95％。以上發(fā)明方法主要是將將外植體直接誘導(dǎo)成胚性愈傷組織，再轉(zhuǎn)接于其他階段的培養(yǎng)基中進(jìn)行體細(xì)胞胚的培養(yǎng)，使用的是激素誘導(dǎo)的方法，與本發(fā)明饑餓處理的方法不同。

9、文獻(xiàn)申請?zhí)枺?01610455479.7發(fā)明了一種荷花未成熟子葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生方法；文獻(xiàn)申請?zhí)枺?01610293458.x，本發(fā)明提供了一種皇冠草人工種子制備方法；文獻(xiàn)申請?zhí)枺?01610143917.6發(fā)明了一種牡丹組織培養(yǎng)再生的方法；文獻(xiàn)申請?zhí)枺?01510476557.7發(fā)明了一種短距槽舌蘭快速繁殖方法；文獻(xiàn)申請?zhí)枺?01410332223.8發(fā)明了一種露地菊‘火焰’間接體細(xì)胞胚快速誘導(dǎo)方法；文獻(xiàn)申請?zhí)枺?01610533011.5，發(fā)明提高了辣椒體細(xì)胞胚發(fā)生的頻率。以上發(fā)明方法大多將外植體接種到到體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上直接誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚，但主要是針對草本植物，而本發(fā)明是木本植物，所用的誘導(dǎo)方法也不同。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種誘導(dǎo)胚性愈傷組織，誘導(dǎo)率高，由誘導(dǎo)胚性愈傷組織培養(yǎng)球形胚，誘導(dǎo)率高的一種誘導(dǎo)樹莓愈傷組織形成球形胚的方法。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

一種誘導(dǎo)樹莓愈傷組織形成球形胚的方法，其特征在于：

包括如下步驟：

步驟1：剪取樹莓無菌苗兩葉片間的莖段作為外植體，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，得到樹莓的松散型愈傷組織；

步驟2：取培養(yǎng)好的松散型愈傷組織，接種到只有無菌水的無菌培養(yǎng)皿中，進(jìn)行饑餓誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到胚性愈傷組織；

步驟3：將所述胚性愈傷組織接種到ms培養(yǎng)基中，進(jìn)行胚狀體培養(yǎng)，得到球形胚。

本方法中，所述步驟1中，愈傷組織培養(yǎng)基為1/2ms+0.5-1.0mg/l2,4-d+100mg/lvc+20g/l蔗糖，ph值5.8；所述步驟1中，愈傷組織培養(yǎng)條件為23-25℃，光照時間12小時，光照強(qiáng)度為500-1000lux，培養(yǎng)時間14-21天。

本方法中，所述步驟2中，的饑餓誘導(dǎo)方法是將樹莓松散型愈傷組織切成大小2mm的小塊，無菌的培養(yǎng)皿內(nèi)放置無菌濾紙，培養(yǎng)皿中加入少量的無菌水，水量以全部浸濕濾紙為準(zhǔn)；所述步驟2中，的饑餓誘導(dǎo)培養(yǎng)條件是：光照強(qiáng)度為2000lux，光照時間為24h；溫度為23℃，饑餓誘導(dǎo)時間為6d。

本方法中，所述步驟3中，胚性愈傷組織接種到ms+20g/l蔗糖培養(yǎng)基中，ph值5.8。；所述步驟3中，胚性愈傷組織培養(yǎng)條件是：光照強(qiáng)度為500-1000lux，光照時間為12h；溫度為23-25℃℃，培養(yǎng)時間14-21d。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：

1、采用本方法，采用饑餓處理的方法誘導(dǎo)胚性愈傷組織，與常規(guī)的激素方法相比，此方法極為簡單，成本低，省時省力，誘導(dǎo)率高，形成的胚性愈傷組織可以分散為多個獨(dú)立的個體，以這種愈傷組織為誘變對象，可以使得每個突變植株都是由單個獨(dú)立的胚性變異細(xì)胞分裂、分化形成的，從而避免了常規(guī)誘變下出現(xiàn)的嵌合體現(xiàn)象；所述的胚性愈傷組織可以通過重新接種到ms培養(yǎng)基中進(jìn)行胚狀體的培養(yǎng)，形成球形胚。

2、本發(fā)明中，因?yàn)椴槐亟?jīng)過激素誘導(dǎo)，因此可節(jié)約研究時間，另外，采用本方法，針對樹莓愈傷組織進(jìn)行饑餓處理來誘導(dǎo)胚性愈傷組織，饑餓處理時間6d時，誘導(dǎo)率可達(dá)到100％；樹莓經(jīng)過饑餓處理后形成的胚性愈傷組織，轉(zhuǎn)移到ms培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)14d即可得到球形胚，誘導(dǎo)率可達(dá)到95％。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

一種誘導(dǎo)樹莓愈傷組織形成球形胚的方法，步驟如下：

(1)樹莓愈傷組織的饑餓處理

剪取樹莓無菌苗兩葉片間的莖段，接種到1/2ms+0.5+0.5-1.0mg/l2,4-d+100mg/lvc+20g/l蔗糖的培養(yǎng)基上進(jìn)行松散型愈傷組織的誘導(dǎo)，ph值5.8，培養(yǎng)條件為23-25℃，光照時間12小時，光照強(qiáng)度為500-1000lux。

2-3周后，取培養(yǎng)好的樹莓松散型愈傷組織，切成大小2mm的小塊進(jìn)行饑餓處理。取無菌的培養(yǎng)皿，在超凈臺中將無菌濾紙放在培養(yǎng)皿中，向培養(yǎng)皿中加入少量的無菌水，注意水量以全部浸濕濾紙為準(zhǔn)。不要多加或?yàn)V紙不能完全浸濕。將樹莓愈傷組織團(tuán)放在準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中。每個培養(yǎng)皿中放入15個愈傷組織團(tuán)，每個處理設(shè)5個重復(fù)。將處理好的愈傷組織放在光照條件下培養(yǎng)，具體培養(yǎng)條件為：2000lux光照強(qiáng)度，24h光照；溫度為23℃，饑餓處理時間分別為3、6、9、12d。將處理好的愈傷組織放在光照條件下培養(yǎng)，具體培養(yǎng)條件為：2000lux光照強(qiáng)度，24h光照；溫度為23℃。

經(jīng)過不同天數(shù)的饑餓處理，樹莓愈傷組織出現(xiàn)明顯的變化，在體式顯微鏡下觀察變化顯著，具體情況見表2。根據(jù)體式顯微鏡和顯微鏡的觀察結(jié)果，具體描述如表1所示。

表1饑餓處理對樹莓愈傷組織胚性化的影響

從表1可以看出，與對照相比，饑餓處理對樹莓愈傷組織的胚性化影響明顯。具體來看，處理3d，愈傷組織沒有明顯變化，在顯微鏡下只是偶爾見到類似球形胚的結(jié)構(gòu)，以上現(xiàn)象說明，饑餓處理3d對樹莓愈傷組織胚性化影響不大，還應(yīng)加大誘導(dǎo)力度。處理6d的情況要明顯好于3d的，從愈傷組織質(zhì)地來看，表面出現(xiàn)許多球形結(jié)構(gòu)的瘤體，類似球形胚狀體結(jié)構(gòu)。在顯微鏡下可以見到愈傷組織由大量球形結(jié)構(gòu)組成，這些球形結(jié)構(gòu)表面光滑，類似胚狀體的球形胚階段。當(dāng)處理時間達(dá)到9d時，在愈傷組織表面出現(xiàn)一些褐變的愈傷組織，愈傷組織表面出現(xiàn)一些球形結(jié)構(gòu)，且在顯微鏡下見到部分細(xì)胞出現(xiàn)死完的特征，說明處理時間過長，導(dǎo)致愈傷組織內(nèi)一些細(xì)胞衰老死亡。當(dāng)培養(yǎng)時間達(dá)到12d時，愈傷組織基本停止生長，雖然少數(shù)愈傷組織質(zhì)地變硬，但多數(shù)細(xì)胞褐變死亡，在顯微鏡下觀察到極少的球形結(jié)構(gòu)。

表2不同饑餓時間處理對樹莓愈傷組織胚性化細(xì)胞所占比例的影響

從表2可以看出，與對照相比，饑餓處理對樹莓愈傷組織的胚性化數(shù)量影響明顯。具體來看，處理3d，出現(xiàn)大約有5％的愈傷組織出現(xiàn)胚性化特征，處理6d，大約有95％的愈傷組織出現(xiàn)胚性化特征，隨著天數(shù)的增加，出現(xiàn)胚性化的比例也在下降，9d為85％，12d為50％。由此可見，樹莓愈傷組織饑餓時間為6d時愈傷組織向著胚性化轉(zhuǎn)變的比例最高。

(2)樹莓愈傷組織在ms培養(yǎng)基上的恢復(fù)培養(yǎng)

將饑餓處理后形成的胚性愈傷組織從培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移到ms培養(yǎng)基上進(jìn)行胚狀體的培養(yǎng)，ph值5.8，培養(yǎng)條件為23-25℃，光照時間12小時，光照強(qiáng)度為500-1000lux。14天后觀察愈傷組織的變化。

表3愈傷組織在ms培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)后的形態(tài)變化及球形胚的數(shù)量

從表3可以看出，恢復(fù)培養(yǎng)對樹莓愈傷組織的胚性化影響明顯。具體來看，處理3d后將其轉(zhuǎn)移到無激素的ms培養(yǎng)基上，只在愈傷組織表面有個別球形結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，約占5％。而處理6d后恢復(fù)培養(yǎng)的可以95％誘導(dǎo)出球形胚結(jié)構(gòu)。

處理9d后恢復(fù)培養(yǎng)的不久就會出現(xiàn)褐變，85％愈傷組織死亡。處理12d后恢復(fù)培養(yǎng)基的，很快所有愈傷組織就會褐變死亡，說明處理12d是樹莓愈傷組織所忍耐饑餓的極限時間。

因此，綜上所述，樹莓愈傷組織饑餓時間為6d時最有利于愈傷組織向著胚性化轉(zhuǎn)變，球形胚最高誘導(dǎo)率可達(dá)95％。