本發(fā)明屬植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種冬櫻離體快繁方法。

背景技術(shù)：

冬櫻(cerasus×parvifolia‘fuyu-zakura’)為豆櫻與大島櫻的雜交品種，成葉小，又稱小葉櫻；小喬木，寬卵狀樹(shù)形。每年開(kāi)花兩次，冬花期為11月上旬至次年1月，因此而得名；春花期為3月下旬，花葉同放，花量比冬花大。傘房花序，1～4朵一束；花徑約3cm；春花的先端缺刻深，冬花的先端缺刻淺，逆突形，花梗無(wú)毛，萼筒鐘狀，紫綠色，無(wú)毛，萼片長(zhǎng)橢圓形，全緣，無(wú)毛；花瓣5枚，白色至淡紅色。雌蕊無(wú)毛，柱頭花柱與花柱同等高度的位置。果實(shí)直徑1厘米，果黑熟有甜味?！叭ùǖ亩瑱选北恢付椤疤烊患o(jì)念物”。我國(guó)武漢東湖等公園有少量引種栽培，生長(zhǎng)表現(xiàn)良好。一年冬春兩次，跟其他品種搭配，極大地延長(zhǎng)了櫻花園的觀花期，開(kāi)發(fā)前景廣闊。

目前，由于冬櫻的母株材料少，嫁接繁殖數(shù)量有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了市場(chǎng)推廣需求，迫切需要通過(guò)組培快繁技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)繁，以冬櫻成年優(yōu)株為母株進(jìn)行組培快繁技術(shù)研究，通過(guò)離體快繁促進(jìn)冬櫻產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)，意義現(xiàn)實(shí)而重大。

經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)檢索，尚未見(jiàn)關(guān)于冬櫻組培快繁的報(bào)道。試驗(yàn)表明，現(xiàn)發(fā)表的櫻屬植物相關(guān)種組織培養(yǎng)所用的配方并不適合冬櫻的離體繁殖，容易出現(xiàn)初代培養(yǎng)的褐化、繼代中玻璃苗大量產(chǎn)生、芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)慢、有效芽少、頂芽枯死等問(wèn)題，導(dǎo)致增殖系數(shù)小，成苗質(zhì)量差，繁殖速度慢，生產(chǎn)成本高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于：克服現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于冬櫻離體快繁方法匱乏、相關(guān)培養(yǎng)基對(duì)冬櫻離體快繁效果差的問(wèn)題，提供一種冬櫻的離體快繁方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種冬櫻離體快繁方法，其包括如下步驟：

(1)外植體預(yù)處理及采集：剪取外植體前，每隔3～4天用多菌靈或百菌清溶液800倍交替噴灑冬櫻樹(shù)體2～3次，剪取冬櫻的上半木質(zhì)化枝條作為外植體(天氣晴朗的上午為宜)，保濕帶回實(shí)驗(yàn)室后，氯氣熏蒸20min，除葉，用洗潔精溶液浸泡5min后，用軟毛筆蘸洗潔精溶液仔細(xì)地輕輕刷洗枝條各部(切勿刷掉托葉)，然后用純凈水洗凈，低溫保濕備用；

(2)外植體消毒和腋芽誘導(dǎo)：枝條用無(wú)菌水清洗兩遍后，使用次氯酸鈉和升汞對(duì)外植體進(jìn)行消毒，然后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到腋芽，誘導(dǎo)培養(yǎng)基以1/2yd為基本培養(yǎng)基，每升添加6-ba(6-芐氨基腺嘌呤)0.5～1.0mg、kt(激動(dòng)素)0.1～0.5mg、iba(吲哚丁酸)0～0.1mg、naa(萘乙酸)0.05～0.1mg、蔗糖20～40g、瓊脂6g，ph為5.8～6.0；

(3)增殖培養(yǎng)：將腋芽切下接種到增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到增殖苗，增殖培養(yǎng)基以yd為基本培養(yǎng)基，每升添加6-ba0.4～0.8mg、kt0.1～0.5mg、iba0～0.1mg、naa0～0.1mg、ga3(赤霉素)1～5mg、蔗糖20～40g、瓊脂5.6g，ph為5.8～6.0；

(4)生根培養(yǎng)：將增殖苗的嫩芽切取并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到生根苗，生根培養(yǎng)基以1/2yd培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每升添加naa0.1～0.5mg、iba0.1～0.5mg、蔗糖15～20g，瓊脂5.6g，ph為5.8～6.0；

(5)煉苗與移栽：將生根苗移到溫室進(jìn)行煉苗移栽，得到冬櫻種苗。

作為本發(fā)明冬櫻離體快繁方法的一種改進(jìn)，步驟(1)中，所述氯氣熏蒸是將外植體盛入玻璃器皿中，放入直徑400mm的干燥皿內(nèi)，用1g/片藥片的1/4(0.25g二氧化氯片作用量)與水反應(yīng)釋放的氯氣密閉熏蒸干燥皿內(nèi)的外植體20min。

作為本發(fā)明冬櫻離體快繁方法的一種改進(jìn)，步驟(2)和(3)中，所述培養(yǎng)條件為24±2℃，光照強(qiáng)度2000lx，光照時(shí)間12h/天。

作為本發(fā)明冬櫻離體快繁方法的一種改進(jìn)，步驟(4)中，所述培養(yǎng)條件為25±2℃，光照強(qiáng)度2000lx，光照時(shí)間12h/天。

作為本發(fā)明冬櫻離體快繁方法的一種改進(jìn)，所述yd培養(yǎng)基含有以下成分：1100mg/lnh4no3、1350mg/lkno3、330mg/lcacl2·2h2o、100mg/lca(no3)2·4h2o、370mg/lmgso4·7h2o、170mg/lkh2po4、100mg/lk2so4、22.3mg/lmnso4·4h2o、8.6mg/lznso4·7h2o、6.2mg/lh3bo3、0.83mg/lki、0.25mg/lna2moo4·2h2o、0.25mg/lcuso4·5h2o、0.025mg/lcocl2、33.4mg/lfeso4·7h2o、44.8mg/lna2·edta·h2o、100mg/l肌醇、2.0mg/l甘氨酸、0.1mg/l鹽酸硫胺素、0.5mg/l煙酸、0.5mg/l鹽酸吡哆醇，ph5.8，溶劑為水；所述1/2yd培養(yǎng)基為將yd培養(yǎng)基中nh4no3、kno3、ca(no3)2·4h2o、cacl2·2h2o、mgso4·7h2o、kh2po4、k2so4的用量減半，其余成分不變。

作為本發(fā)明冬櫻離體快繁方法的一種改進(jìn)，步驟(2)中所述消毒是使用10～20wt％的次氯酸鈉溶液浸泡2～5min后，倒掉次氯酸鈉溶液，用無(wú)菌水沖洗4～5次，再加入0.1wt％升汞溶液中浸泡1～3min，期間不斷搖動(dòng)，然后倒掉升汞溶液，用無(wú)菌水沖洗5～6次。

作為本發(fā)明冬櫻離體快繁方法的一種改進(jìn)，步驟(2)中所述接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上是將外植體用無(wú)菌刀片切除托葉、葉柄、莖段兩端的受傷部位后，再接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，一瓶接種一個(gè)外植體。

作為本發(fā)明冬櫻離體快繁方法的一種改進(jìn)，步驟(3)中，將腋芽切下接種到增殖培養(yǎng)基后，腋芽分化形成新芽叢，將新芽叢中的芽高大于等于3cm的切割成1.0～1.5cm的莖段，再轉(zhuǎn)入新的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到增殖苗。

作為本發(fā)明冬櫻離體快繁方法的一種改進(jìn)，步驟(5)中，將生根苗移到溫室中適應(yīng)環(huán)境5～7天，光照強(qiáng)度為5000～10000lx，移栽前1～2天將組培瓶蓋從半開(kāi)到全開(kāi)煉苗，然后將組培苗取出洗凈培養(yǎng)基，移栽到體積比為泥炭：珍珠巖：礱糠灰＝3:1:1的混合基質(zhì)上，移栽后前4～5天采用蓋膜保濕，然后解開(kāi)蓋膜按照常規(guī)幼苗管理。

本發(fā)明通過(guò)基本培養(yǎng)基(yd培養(yǎng)基，專門(mén)針對(duì)冬櫻生理狀態(tài)設(shè)定的基本培養(yǎng)基)設(shè)置、不同激素成份及濃度水平配比優(yōu)化，以成年優(yōu)株半木質(zhì)化枝條為外植體，經(jīng)腋芽誘導(dǎo)、腋芽增殖和生根培養(yǎng)，形成完整植株，移栽到基質(zhì)后，得到生長(zhǎng)整齊、表型一致的健壯苗木。本發(fā)明具有外植體的腋芽誘導(dǎo)速度快，誘導(dǎo)率高達(dá)100％、繁殖系數(shù)高達(dá)9.5、增殖芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)快，培養(yǎng)20d芽高達(dá)3～5cm；生根培養(yǎng)10d，生根率達(dá)100％，根數(shù)達(dá)5條/株以上；組培生根苗健壯、移栽成活率高達(dá)95％以上；在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中可進(jìn)行周年規(guī)?；焖儆?，生產(chǎn)出健壯、整齊一致的冬櫻組培苗。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明方法具有誘導(dǎo)速度快、誘導(dǎo)率高，增殖系數(shù)大、叢芽粗壯、伸長(zhǎng)生長(zhǎng)快、芽長(zhǎng)，生根率高、根系發(fā)達(dá)，生根苗粗壯、移栽成活率高，苗木生長(zhǎng)健壯整齊，生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)。此外，通過(guò)適當(dāng)降低冬櫻增殖培養(yǎng)基中激素水平，可確保增殖芽的質(zhì)量和增殖系數(shù)>5(繼代周期20d)，同時(shí)，繼代周期延長(zhǎng)至3個(gè)月。本發(fā)明為冬櫻種苗的規(guī)模化苗木生產(chǎn)提供了有效途徑，通過(guò)規(guī)模化育苗，可以大規(guī)模的獲得冬櫻種苗，將為冬櫻的無(wú)性化推廣提供技術(shù)支持，為我國(guó)園林綠化及生態(tài)文明建設(shè)提供新優(yōu)櫻花品種及優(yōu)質(zhì)種苗，意義重大，應(yīng)用前景廣闊。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明冬櫻離體快繁方法以及有益效果進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

圖1為本發(fā)明腋芽誘導(dǎo)圖。

圖2為本發(fā)明增殖培養(yǎng)基中的增殖瓶苗。

圖3為本發(fā)明生根培養(yǎng)基中的生根苗根系。

圖4為本發(fā)明組培生根苗。

圖5為本發(fā)明組培生根苗移栽后的生長(zhǎng)情況。

圖6為本發(fā)明可出圃的組培容器苗。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益技術(shù)效果更加清晰，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，本說(shuō)明書(shū)中描述的實(shí)施例僅僅是為了解釋本發(fā)明，并非為了限定本發(fā)明，實(shí)施例的參數(shù)、比例等可因地制宜做出選擇而對(duì)結(jié)果并無(wú)實(shí)質(zhì)性影響。

以下實(shí)施例中的yd培養(yǎng)基，其含有以下成分：1100mg/lnh4no3、1350mg/lkno3、330mg/lcacl2·2h2o、100mg/lca(no3)2·4h2o、370mg/lmgso4·7h2o、170mg/lkh2po4、100mg/lk2so4、22.3mg/lmnso4·4h2o、8.6mg/lznso4·7h2o、6.2mg/lh3bo3、0.83mg/lki、0.25mg/lna2moo4·2h2o、0.25mg/lcuso4·5h2o、0.025mg/lcocl2、33.4mg/lfeso4·7h2o、44.8mg/lna2·edta·h2o、100mg/l肌醇、2.0mg/l甘氨酸、0.1mg/l鹽酸硫胺素、0.5mg/l煙酸、0.5mg/l鹽酸吡哆醇，溶劑為水。按照上述配方的成分和含量，將上述成分混合均勻，調(diào)ph5.8、121℃滅菌18～20min，得到y(tǒng)d培養(yǎng)基，備用。所述的1/2yd培養(yǎng)基為將yd培養(yǎng)中所含大量元素(nh4no3、kno3、ca(no3)2·4h2o、cacl2·2h2o、mgso4·7h2o、kh2po4、k2so4)的用量減半，其余成分不變。

實(shí)施例1

一種冬櫻離體快速繁殖方法，包括如下步驟：

(1)外植體采集：4～5月份天氣晴朗的上午10時(shí)左右，從冬櫻母株上剪取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的半木質(zhì)化枝條，保濕處理后帶回實(shí)驗(yàn)室，將采集后嫩枝氯氣熏蒸20min(400mm干燥皿內(nèi)0.25g二氧化氯片作用量)。除葉，用純凈水清洗干凈后作為外植體置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。采集外植體前，每隔3～4d用800倍多菌靈、百菌清交替噴灑萌枝2～3次。

(2)外植體表面消毒：將枝條(外植體)剪成4cm左右長(zhǎng)的帶葉腋莖段，在超凈工作臺(tái)上先用無(wú)菌水擦洗干凈，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％～20％次氯酸鈉溶液，浸泡時(shí)間2～5min，倒掉次氯酸鈉溶液后，用無(wú)菌水沖洗4～5次，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％升汞溶液，根據(jù)外植體幼嫩程度浸泡1～3min，其間不斷搖動(dòng)，倒掉升汞溶液后，再用無(wú)菌水沖洗5～6次。無(wú)菌濾紙吸干無(wú)菌材料表面水珠，用無(wú)菌刀片切除托葉、葉柄、莖段兩端受傷部位后，再將莖段切成1.5～2cm帶葉腋莖段備用，得到消毒好的帶葉腋切斷。

(3)腋芽誘導(dǎo)：將消毒好的帶葉腋莖段(外植體)接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：24±2℃，光照強(qiáng)度2000lx，光照時(shí)間12h/d，每瓶接種一個(gè)外植體，腋芽第2～3d開(kāi)始萌動(dòng)，腋芽伸長(zhǎng)快，第20d可長(zhǎng)至2.5cm左右(圖1)，誘導(dǎo)率為100％，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基以1/2yd為基本培養(yǎng)基，每升添加6-ba0.8mg、kt0.2mg、naa0.05mg、蔗糖30g、瓊脂6g(激素購(gòu)自sigma-aldrich公司)，ph為5.8(其配制方法為：將上述成分混合均勻后，調(diào)ph值，滅菌備用)，由此得到腋芽。

(4)增殖培養(yǎng)：將誘導(dǎo)出的腋芽截成1.0～1.5cm的莖段轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：24±2℃，光照強(qiáng)度2000lx，光照時(shí)間12h/d，所述的增殖培養(yǎng)基以yd為基本培養(yǎng)基，每升添加6-ba0.5mg、kt0.2、iba0.1mg、naa0.05mg、ga35mg、蔗糖30g、瓊脂5.6g，ph為5.8(其配制方法為：將上述成分混合均勻后，調(diào)ph值，滅菌備用)，腋芽接入增殖培養(yǎng)基后，芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)快，單芽形成芽叢，20d增殖系數(shù)最高達(dá)9.5，苗高達(dá)5cm(圖2)，由此得到增殖苗。

(5)生根培養(yǎng)：從增殖苗選取健壯的有效芽(芽高>1.5cm)切取轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：25±2℃，光照強(qiáng)度2500lx，光照時(shí)間12h/d，所述的生根培養(yǎng)基以1/2yd為基本培養(yǎng)基，每升添加naa0.2mg、iba0.2mg、蔗糖15g、瓊脂5.6g，ph為5.8(其配制方法為：將上述成分混合均勻后，調(diào)ph值，滅菌備用)，10d生根率達(dá)100％，每株平均生根數(shù)達(dá)5條以上(圖3、圖4)。

(6)煉苗與移栽：將生根瓶苗移到溫室中適應(yīng)外界環(huán)境5～7d，光照強(qiáng)度為5000～10000lx，出瓶移植前1～2d將組培瓶蓋從半開(kāi)到全開(kāi)煉苗，使瓶苗逐步適應(yīng)適度小的自然環(huán)境，煉苗后將瓶中的幼苗小心取出，洗凈黏在苗上的培養(yǎng)基，移植到填滿泥炭:珍珠巖:礱糠灰＝3:1:1(體積比)混合基質(zhì)的育苗杯中，每一杯種植一株苗，移植覆土深度剛好蓋住根系，壓緊基質(zhì)，使苗根和基質(zhì)緊密接觸，移植完成后淋透定根水。

(7)幼苗培育：移植后，對(duì)幼苗進(jìn)行水分、肥及防病菌的管理：

①水分管理：瓶苗在移植后基質(zhì)保持濕潤(rùn)，空氣相對(duì)濕度在80％～90％為宜，前4～5d可通過(guò)蓋膜保濕，之后通過(guò)噴霧補(bǔ)水，控制培養(yǎng)溫度25±2℃，蔭棚用70％的遮陽(yáng)網(wǎng)遮光；

②肥及防病菌的管理：在移植后第三天用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％百菌清或多菌靈溶液噴霧消毒滅菌，之后每隔10d噴霧一次，百菌清和多菌靈交替使用；當(dāng)有新芽萌發(fā)、新根長(zhǎng)出時(shí)，噴施0.2％復(fù)合肥+0.04％尿素混合液，每隔15d噴施一次；

③待生長(zhǎng)穩(wěn)定，長(zhǎng)出新芽和新根后，逐步增加光照強(qiáng)度，直到進(jìn)行全光照常規(guī)管理，移栽后一個(gè)月成活率達(dá)97％(圖5)，待幼苗長(zhǎng)至10～15cm高時(shí)(圖6)，可移至大田培育大苗。

實(shí)施例2

一種冬櫻離體快速繁殖方法，包括如下步驟：

(1)外植體采集：4～5月份天氣晴朗的上午10時(shí)左右，從冬櫻母株上剪取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的半木質(zhì)化枝條，保濕處理后帶回實(shí)驗(yàn)室，將采集后嫩枝氯氣熏蒸20min(400mm干燥皿內(nèi)0.25g二氧化氯片作用量)。除葉，用純凈水清洗干凈后作為外植體置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。采集外植體前，每隔3～4d用800倍多菌靈、百菌清交替噴灑萌枝2～3次。

(2)外植體表面消毒：將枝條(外植體)剪成4cm左右長(zhǎng)的帶葉腋莖段，在超凈工作臺(tái)上先用無(wú)菌水摖洗干凈，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％～20％次氯酸鈉溶液，浸泡時(shí)間2～5min，倒掉次氯酸鈉溶液后，用無(wú)菌水沖洗4～5次，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％升汞溶液，根據(jù)外植體幼嫩程度浸泡1～3min，其間不斷搖動(dòng)，倒掉升汞溶液后，再用無(wú)菌水沖洗5～6次。無(wú)菌濾紙吸干無(wú)菌材料表面水珠，用無(wú)菌刀片切除托葉、葉柄、莖段兩端受傷部位后，再將莖段切成1.5～2cm帶葉腋莖段備用，得到消毒好的帶葉腋切斷。

(3)腋芽誘導(dǎo)：將消毒好的帶葉腋莖段(外植體)接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：24±2℃，光照強(qiáng)度2000lx，光照時(shí)間12h/d，每瓶接種一個(gè)外植體，腋芽第6～7d開(kāi)始萌動(dòng)，誘導(dǎo)率為76.7％，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基以1/2yd為基本培養(yǎng)基，每升添加6-ba0.5mg、kt0.5mg、naa0.1mg、蔗糖30g、瓊脂6g(激素購(gòu)自sigma-aldrich公司)，ph為5.8(其配制方法為：將上述成分混合均勻后，調(diào)ph值，滅菌備用)，由此得到腋芽。

(4)增殖培養(yǎng)：將誘導(dǎo)出的腋芽截成1.0～1.5cm的莖段轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：24±2℃，光照強(qiáng)度2000lx，光照時(shí)間12h/d，所述的增殖培養(yǎng)基以yd為基本培養(yǎng)基，每升添加6-ba0.8mg、kt0.1、iba0.05mg、naa0.1mg、ga33mg、蔗糖40g、瓊脂5.6g，ph為5.8(其配制方法為：將上述成分混合均勻后，調(diào)ph值，滅菌備用)，腋芽接入增殖培養(yǎng)基后，芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)快，單芽形成芽叢，20d增殖系數(shù)最達(dá)5.4，苗高達(dá)2.5cm左右，由此得到增殖苗。

(5)生根培養(yǎng)：從增殖苗選取健壯的有效芽(芽高>1.5cm)切取轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：25±2℃，光照強(qiáng)度2500lx，光照時(shí)間12h/d，所述的生根培養(yǎng)基以1/2yd為基本培養(yǎng)基，每升添加naa0.2mg、iba0.5mg、蔗糖15g、瓊脂5.6g，ph為5.8(其配制方法為：將上述成分混合均勻后，調(diào)ph值，滅菌備用)，10d生根率達(dá)78％。

(6)煉苗與移栽：將生根瓶苗移到溫室中適應(yīng)外界環(huán)境5～7d，光照強(qiáng)度為5000～10000lx，出瓶移植前1～2d將組培瓶蓋從半開(kāi)到全開(kāi)煉苗，使瓶苗逐步適應(yīng)適度小的自然環(huán)境，煉苗后將瓶中的幼苗小心取出，洗凈黏在苗上的培養(yǎng)基，移植到填滿泥炭:珍珠巖:礱糠灰＝3:1:1(體積比)混合基質(zhì)的育苗杯中，每一杯種植一株苗，移植覆土深度剛好蓋住根系，壓緊基質(zhì)，使苗根和基質(zhì)緊密接觸，移植完成后淋透定根水。

(7)幼苗培育：移植后，對(duì)幼苗進(jìn)行水分、肥及防病菌的管理：

①水分管理：瓶苗在移植后基質(zhì)保持濕潤(rùn)，空氣相對(duì)濕度在80％～90％為宜，前4～5d可通過(guò)蓋膜保濕，之后通過(guò)噴霧補(bǔ)水，控制培養(yǎng)溫度25±2℃，蔭棚用70％的遮陽(yáng)網(wǎng)遮光；

②肥及防病菌的管理：在移植后第三天用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％百菌清或多菌靈溶液噴霧消毒滅菌，之后每隔10d噴霧一次，百菌清和多菌靈交替使用；當(dāng)有新芽萌發(fā)、新根長(zhǎng)出時(shí)，噴施0.2％復(fù)合肥+0.04％尿素混合液，每隔15d噴施一次；

③待生長(zhǎng)穩(wěn)定，長(zhǎng)出新芽和新根后，逐步增加光照強(qiáng)度，直到進(jìn)行全光照常規(guī)管理，移栽后一個(gè)月成活率達(dá)95％，待幼苗長(zhǎng)至10～15cm高時(shí)，可移至大田培育大苗。

實(shí)施例3

一種冬櫻離體快速繁殖方法，包括如下步驟：

(1)外植體采集：4～5月份天氣晴朗的上午10時(shí)左右，從冬櫻母株上剪取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的半木質(zhì)化枝條，保濕處理后帶回實(shí)驗(yàn)室，將采集后嫩枝氯氣熏蒸20min(400mm干燥皿內(nèi)0.25g二氧化氯片作用量)。除葉，用純凈水清洗干凈后作為外植體置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。采集外植體前，每隔3～4d用800倍多菌靈、百菌清交替噴灑萌枝2～3次。

(2)外植體表面消毒：將枝條(外植體)剪成4cm左右長(zhǎng)的帶葉腋莖段，在超凈工作臺(tái)上先用無(wú)菌水摖洗干凈，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％～20％次氯酸鈉溶液，浸泡時(shí)間2～5min，倒掉次氯酸鈉溶液后，用無(wú)菌水沖洗4～5次，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％升汞溶液，根據(jù)外植體幼嫩程度浸泡1～3min，其間不斷搖動(dòng)，倒掉升汞溶液后，再用無(wú)菌水沖洗5～6次。無(wú)菌濾紙吸干無(wú)菌材料表面水珠，用無(wú)菌刀片切除托葉、葉柄、莖段兩端受傷部位后，再將莖段切成1.5～2cm帶葉腋莖段備用，得到消毒好的帶葉腋切斷。

(3)腋芽誘導(dǎo)：將消毒好的帶葉腋莖段(外植體)接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：24±2℃，光照強(qiáng)度2000lx，光照時(shí)間12h/d，每瓶接種一個(gè)外植體，腋芽第5～6d開(kāi)始萌動(dòng)，誘導(dǎo)率為82％，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基以1/2yd為基本培養(yǎng)基，每升添加6-ba1.0mg、kt0.1mg、iba0.05mg、naa0.08mg、蔗糖30g、瓊脂6g(激素購(gòu)自sigma-aldrich公司)，ph為5.8(其配制方法為：將上述成分混合均勻后，調(diào)ph值，滅菌備用)，由此得到腋芽。

(4)增殖培養(yǎng)：將誘導(dǎo)出的腋芽截成1.0～1.5cm的莖段轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：24±2℃，光照強(qiáng)度2000lx，光照時(shí)間12h/d，所述的增殖培養(yǎng)基以yd為基本培養(yǎng)基，每升添加6-ba0.6mg、kt0.5mg、iba0.1mg、ga31.0mg、蔗糖30g、瓊脂5.6g，ph為5.8(其配制方法為：將上述成分混合均勻后，調(diào)ph值，滅菌備用)，腋芽接入增殖培養(yǎng)基后，芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)快，單芽形成芽叢，20d增殖系數(shù)最達(dá)3.2，苗高達(dá)2cm左右，由此得到增殖苗。

(5)生根培養(yǎng)：從增殖苗選取健壯的有效芽(芽高>1.5cm)切取轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：25±2℃，光照強(qiáng)度2500lx，光照時(shí)間12h/d，所述的生根培養(yǎng)基以1/2yd為基本培養(yǎng)基，每升添加naa0.5mg、iba0.2mg、蔗糖15g、瓊脂5.6g，ph為5.8(其配制方法為：將上述成分混合均勻后，調(diào)ph值，滅菌備用)，10d生根率達(dá)80％。

(6)煉苗與移栽：將生根瓶苗移到溫室中適應(yīng)外界環(huán)境5～7d，光照強(qiáng)度為5000～10000lx，出瓶移植前1～2d將組培瓶蓋從半開(kāi)到全開(kāi)煉苗，使瓶苗逐步適應(yīng)適度小的自然環(huán)境，煉苗后將瓶中的幼苗小心取出，洗凈黏在苗上的培養(yǎng)基，移植到填滿泥炭:珍珠巖:礱糠灰＝3:1:1(體積比)混合基質(zhì)的育苗杯中，每一杯種植一株苗，移植覆土深度剛好蓋住根系，壓緊基質(zhì)，使苗根和基質(zhì)緊密接觸，移植完成后淋透定根水。

(7)幼苗培育：移植后，對(duì)幼苗進(jìn)行水分、肥及防病菌的管理：

①水分管理：瓶苗在移植后基質(zhì)保持濕潤(rùn)，空氣相對(duì)濕度在80％～90％為宜，前4～5d可通過(guò)蓋膜保濕，之后通過(guò)噴霧補(bǔ)水，控制培養(yǎng)溫度25±2℃，蔭棚用70％的遮陽(yáng)網(wǎng)遮光；

②肥及防病菌的管理：在移植后第三天用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％百菌清或多菌靈溶液噴霧消毒滅菌，之后每隔10d噴霧一次，百菌清和多菌靈交替使用；當(dāng)有新芽萌發(fā)、新根長(zhǎng)出時(shí)，噴施0.2％復(fù)合肥+0.04％尿素混合液，每隔15d噴施一次；

③待生長(zhǎng)穩(wěn)定，長(zhǎng)出新芽和新根后，逐步增加光照強(qiáng)度，直到進(jìn)行全光照常規(guī)管理，移栽后一個(gè)月成活率達(dá)95％，待幼苗長(zhǎng)至10～15cm高時(shí)，可移至大田培育大苗。

根據(jù)上述說(shuō)明書(shū)的揭示和教導(dǎo)，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以對(duì)上述實(shí)施方式進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兏托薷?。因此，本發(fā)明并不局限于上面揭示和描述的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的一些修改和變更也應(yīng)當(dāng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。此外，盡管本說(shuō)明書(shū)中使用了一些特定的術(shù)語(yǔ)，但這些術(shù)語(yǔ)只是為了方便說(shuō)明，并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。