本發(fā)明涉及落葉松植物栽培領(lǐng)域，具體涉及一種落葉松植物高效離體發(fā)生的方法。

背景技術(shù)：

落葉松(Larix Mill)屬松科(Pinaceae)落葉松亞科(Laricoideae)，天然分布在北半球溫帶山區(qū)、寒溫帶的平原及高山氣候區(qū)。落葉松具有分布廣泛、適應(yīng)性強(qiáng)、病蟲害少、材質(zhì)優(yōu)良等特點，其早期速生性在所有的針葉樹中位居前列，是國營林場和農(nóng)民都非常重視的造林樹種，人工造林面積目益擴(kuò)大；也是我國東北、西北、華北及南方亞高山地區(qū)的重要紙漿材及建筑材樹種。但落葉松生長周期較長，有性繁殖后代變異較大，且扦插繁殖生根率很低。組織培養(yǎng)作為落葉松快速無性繁殖的主要途徑，存在著很大潛力。因此，開展落葉松的高效離體發(fā)生研究具有重要意義。

作為基本的技術(shù)操作平臺，落葉松的離體再生系統(tǒng)具有以下主要用途：

(1)種苗提供常規(guī)方法生產(chǎn)落葉松種子耗時費力，單位時間內(nèi)生產(chǎn)效率低下，種子園的種子產(chǎn)量受氣候與栽培管理方式影響較大，年度間產(chǎn)量極不穩(wěn)定，種子供應(yīng)不足，種苗整齊度呈現(xiàn)正態(tài)分布。使用高效的離體再生系統(tǒng)，對優(yōu)良母株進(jìn)行無性擴(kuò)繁，為無性系林業(yè)育種提供技術(shù)支撐。

(2)品種改良目前，我國主要通過人工引種、良種選育、種間雜交等傳統(tǒng)育種方式對落葉松進(jìn)行遺傳改良。雖然在此領(lǐng)域已取得了令人矚目的進(jìn)展，然而從技術(shù)層面上來說，由于這些傳統(tǒng)的育種方式人力、物力耗費較大、受自然條件影響、育種周期長、遺傳操作難度大，落葉松育種進(jìn)程不能滿足現(xiàn)代林木遺傳育種的需要。

因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種新型的、可以實現(xiàn)落葉松植物的大規(guī)模種植的高效離體發(fā)生的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新型的、可以實現(xiàn)落葉松植物的大規(guī)模種植的高效離體發(fā)生的方法。

本發(fā)明第一方面提供了一種落葉松植物的繁殖方法，包括步驟：

(a)對所述落葉松植物的種子進(jìn)行萌發(fā)處理，從而獲得經(jīng)萌發(fā)的種苗；

(b)對所述經(jīng)萌發(fā)的種苗培養(yǎng)n天，其中n為4-20，從而獲得經(jīng)培養(yǎng)的實生苗；

(c)對所述實生苗的下胚軸進(jìn)行切取，獲得下胚軸切段，所述下胚軸切段的長度為1-6mm；和

(d)對所述的下胚軸切段進(jìn)行再生，從而獲得落葉松植物植株。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，從出苗日當(dāng)天起培養(yǎng)4-20天。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(b)中，將所述種苗進(jìn)行培養(yǎng)5-18天，較佳地，6-16天。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(d)中，包括以下一個或多個獨立的子步驟：

(d1)對所述的下胚軸切段進(jìn)行培養(yǎng)，獲得愈傷組織；

(d2)對所述愈傷組織進(jìn)行出芽處理，從而獲得原始不定芽(即，芽原基)；

(d3)對所述原始不定芽進(jìn)行培養(yǎng)，從而獲得伸長的不定芽；

(d4)對所述伸長的不定芽進(jìn)行生根處理，從而獲得落葉松植物植株。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(c)中，所述下胚軸切段的長度為1-5mm，較佳地，2-4mm。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(b)中，還包括對所述實生苗進(jìn)行消毒的步驟。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(d)中，所述再生在低氮和/或低NH₄⁺的培養(yǎng)基中進(jìn)行。

在另一優(yōu)選例中，所述的低氮和/或低NH₄⁺的培養(yǎng)基是基于MS培養(yǎng)基的低氮和/或低NH₄⁺的培養(yǎng)基。

在另一優(yōu)選例中，在所述低氮和/或低NH₄⁺的培養(yǎng)基中，除了氮和/或NH₄⁺之外的其他成分和含量與MS培養(yǎng)基基本相同(例如對于任一其他成分而言，為標(biāo)準(zhǔn)MS培養(yǎng)基中同一成分含量的約80-130％，較佳地90-120％)。

在另一優(yōu)選例中，所述子步驟(d1)、(d2)、(d3)和/或(d4)的一個或多個(或全部)中，所述再生在低氮、低NH₄⁺的培養(yǎng)基中進(jìn)行。

在另一優(yōu)選例中，所述的“低氮”指所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件的氮含量N_L與MS培養(yǎng)基中氮含量N0之比(N_L/N0)為0.3-0.9，較佳地0.35-0.8，更佳地0.3-0.6。

在另一優(yōu)選例中，所述的“低NH₄⁺”指所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件的NH₄⁺含量M_L與MS培養(yǎng)基中NH₄⁺含量M0之比(M_L/M0)為0.2-0.7，較佳地0.25-0.6，更佳地0.3-0.5。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(d)中，所述培養(yǎng)基為以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，且氮含量(濃度)為MS培養(yǎng)基中氮含量的1/4-1/2，較佳地，1/3-1/2。

在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基含有NH₄Cl、NH₄NO₃和KNO₃。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(d)或其一個或多個子步驟中，所述培養(yǎng)基中，NH₄Cl的濃度為300-650mg/l，較佳地，400-600mg/l。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(d)或其一個或多個子步驟中，所述培養(yǎng)基中，NH₄NO₃的濃度為400-700mg/l，較佳地，500-650mg/l。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(d)或其一個或多個子步驟中，所述培養(yǎng)基中，KNO₃的濃度為600-1000mg/l，較佳地，700-900mg/l。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(d)或其一個或多個子步驟中，所述培養(yǎng)基中，以Ca(NO₃)₂·2H₂O的質(zhì)量計，Ca(NO₃)₂·2H₂O的濃度為400-800mg/l，較佳地，500-700mg/l。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(d1)中，將所述下胚軸切段置于含0.08-20mg/l(較佳地，0.1-10mg/l，更佳地，0.3-8mg/l，最佳地，0.5-3mg/l)BA和0.01-5mg/l(較佳地，0.05-3mg/l，更佳地，0.08-1mg/l，最佳地，0.1-0.5mg/l)NAA的培養(yǎng)基上，于23±1℃培養(yǎng)，所述下胚軸的近子葉端開始膨大，獲得愈傷組織。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(d2)中，將所述愈傷組織置于含0.05-10mg/l(較佳地，0.08-8mg/l，更佳地，0.1-5mg/l，)BA和0.01-5mg/l(較佳地，0.05-3mg/l，更佳地，0.08-1mg/l)NAA的培養(yǎng)基上，于23±1℃培養(yǎng)8-12周，獲得原始不定芽，即芽原基。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(d3)中，將所述帶有原始不定芽(即芽原基)的愈傷組織置于含0.05-10mg/l(較佳地，0.08-8mg/l，更佳地，0.1-6mg/l)BA，0-0.1mg/l(較佳地，0.001-0.08mg/l，更佳地，0.005-0.05mg/l)TDZ和0.01-5mg/l(較佳地，0.05-3mg/l，更佳地，0.08-1mg/l)NAA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)6-8周，于23±1℃培養(yǎng)，誘導(dǎo)出形態(tài)清晰的不定芽。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(d4)中，將所述伸長的不定芽置于含有0-6mg/l(較佳地，0.01-3mg/l，更佳地，0.05-1mg/l，最佳地，0.1-0.6mg/l)BA、0-0.6mg/l(較佳地，0.01-0.5mg/l，更佳地，0.001-0.4mg/l，最佳地，0.002-0.2mg/l)NAA和0-6mg/l(較佳地，0.01-4mg/l，更佳地，0.05-3mg/l，最佳地，0.1-2mg/l)GA₃的培養(yǎng)基上，于22±1℃進(jìn)行暗培養(yǎng)2-8天(較佳地3-7天)。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(d4)中，將所述暗培養(yǎng)后的不定芽(較佳地，分離的單株不定芽)，去除形態(tài)學(xué)下端葉片，用5-100mg/l(較佳地，10-80mg/l，更佳地，20-60mg/l)IBA預(yù)處理0.2-36h(較佳地0.5-24h)。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(d4)中，所述預(yù)處理后的不定芽(較佳地，分離的單株不定芽)，切除形態(tài)學(xué)下端莖段，在含0.01-5mg/l(較佳地，0.05-3mg/l，更佳地，0.08-1mg/l，最佳地，0.1-0.5mg/l)IBA的1/2MS培養(yǎng)基(其中氮含量和NH₄含量減為MS培養(yǎng)基的約1/5至1/4)中繼續(xù)培養(yǎng)。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(d4)中，所述切除的下端莖段的長度為0.3-5mm，較佳地，0.5-4mm，更佳地，0.6-2mm。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(d4)中，在1/2MS培養(yǎng)基(其中氮含量和NH₄含量減為MS培養(yǎng)基的約1/5至1/4)中繼續(xù)培養(yǎng)4-6周，于24±1℃培養(yǎng)誘導(dǎo)得到不定根。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(d4)中，將獲得的不定根培養(yǎng)于25±2℃，培養(yǎng)1-2周后得到離體再生的落葉松植物植株。

在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括將步驟(d)獲得的植株進(jìn)行煉苗后，移植入栽培土中培養(yǎng)的步驟。

在另一優(yōu)選例中，所述栽培土中培養(yǎng)的溫度為25±2℃。

在另一優(yōu)選例中，所述栽培土的基質(zhì)包括泥炭、菜園土、和/或珍珠巖。

在另一優(yōu)選例中，所述泥炭、菜園土、珍珠巖的比例為3:6:1。

在另一優(yōu)選例中，所述落葉松植物選自下組的屬：松科屬、落葉松屬、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述落葉松植物選自下組：日本落葉松、華北落葉松、長白落葉松、云南落葉松、新疆落葉松、日本落葉松×長白落葉松(雜交落葉松)、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(a)中，所述萌發(fā)溫度為25±1℃。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(a)中，所述萌發(fā)時間為5-30天，較佳地，8-20天，更佳地，7-15天。

本發(fā)明第二方面提供了一種落葉松植物的繁殖方法，包括步驟：

(a)將所述落葉松植物的種子進(jìn)行萌發(fā)處理，從而獲得經(jīng)萌發(fā)的種苗；

(b)將所述種苗進(jìn)行培養(yǎng)4-20天，獲得經(jīng)培養(yǎng)的實生苗；

(c)對所述實生苗的下胚軸進(jìn)行切取，獲得下胚軸切段，所述下胚軸切段為1-6mm；

(d)對所述的下胚軸切段進(jìn)行培養(yǎng)，獲得愈傷組織；

(e)對所述的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得帶有不定芽的愈傷組織；和

(f)將步驟(e)獲得的不定芽進(jìn)行培養(yǎng)，生根獲得落葉松植物植株。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(c)中，所述下胚軸切段的長度為1-5mm，較佳地，2-4mm。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(b)中，還包括對所述實生苗進(jìn)行消毒的步驟。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(b)中，對所述種苗進(jìn)行培養(yǎng)5-18天，較佳地，6-16天。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(d)-(f)的一個或多個(或全部)步驟中，在低氮和/或低NH₄⁺的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(d)中，將所述下胚軸切段置于含0.08-20mg/l(較佳地，0.1-10mg/l，更佳地，0.3-8mg/l，最佳地，0.5-3mg/l)BA和0.01-5mg/l(較佳地，0.05-3mg/l，更佳地，0.08-1mg/l，最佳地，0.1-0.5mg/l)NAA的培養(yǎng)基上，于23±1℃培養(yǎng)，所述下胚軸的近子葉端開始膨大，獲得愈傷組織。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(e)包括步驟：

(e1)將步驟(d)獲得的愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)，獲得帶有原始不定芽(即芽原基)的愈傷組織；

(e2)對步驟(e1)獲得的帶有原始不定芽(即芽原基)的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得不定芽。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(e1)中，將所述愈傷組織置于含0.05-10mg/l(較佳地，0.08-8mg/l，更佳地，0.1-5mg/l，)BA和0.01-5mg/l(較佳地，0.05-3mg/l，更佳地，0.08-1mg/l)NAA的培養(yǎng)基上，于23±1℃培養(yǎng)8-12周，獲得原始不定芽，即芽原基。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(e2)中，將所述帶有原始不定芽(即芽原基)的愈傷組織置于含0.05-10mg/l(較佳地，0.08-8mg/l，更佳地，0.1-6mg/l)BA，0-0.1mg/l(較佳地，0.001-0.08mg/l，更佳地，0.005-0.05mg/l)TDZ和0.01-5mg/l(較佳地，0.05-3mg/l，更佳地，0.08-1mg/l)NAA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)6-8周，于23±1℃培養(yǎng)，誘導(dǎo)出形態(tài)清晰的不定芽。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(f)包括步驟：

(f1)對所述不定芽進(jìn)行培養(yǎng)，獲得伸長的不定芽；

(f2)分離步驟(f1)獲得的伸長的不定芽，繼續(xù)培養(yǎng)至生根獲得落葉松植物植株。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(f1)中，將所述不定芽置于含有0-6mg/l(較佳地，0.01-3mg/l，更佳地，0.05-1mg/l，最佳地，0.1-0.6mg/l)BA、0-0.6mg/l(較佳地，0.01-0.5mg/l，更佳地，0.001-0.4mg/l，最佳地，0.002-0.2mg/l)NAA和0-6mg/l(較佳地，0.01-4mg/l，更佳地，0.05-3mg/l，最佳地，0.1-2mg/l)GA₃的培養(yǎng)基上，于23±1℃培養(yǎng)，4-6周后，得到伸長的不定芽。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(f2)中，將伸長的不定芽置于含有0-6mg/l(較佳地，0.01-3mg/l，更佳地，0.05-1mg/l，最佳地，0.1-0.6mg/l)BA、0-0.6mg/l(較佳地，0.01-0.5mg/l，更佳地，0.001-0.4mg/l，最佳地，0.002-0.2mg/l)NAA和0-6mg/l(較佳地，0.01-4mg/l，更佳地，0.05-3mg/l，最佳地，0.1-2mg/l)GA₃的培養(yǎng)基上，于22±1℃進(jìn)行暗培養(yǎng)，3-7天。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(f2)中，將所述暗培養(yǎng)后的不定芽(較佳地，分離的單株不定芽)，去除形態(tài)學(xué)下端葉片，用5-100mg/l(較佳地，10-80mg/l，更佳地，20-60mg/l)IBA預(yù)處理0-36h(較佳地0.5-24h)。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(f2)中，所述預(yù)處理后的不定芽(較佳地，分離的單株不定芽)，切除形態(tài)學(xué)下端莖段，在含0.01-5mg/l(較佳地，0.05-3mg/l，更佳地，0.08-1mg/l，最佳地，0.1-0.5mg/l)IBA的1/2MS培養(yǎng)基(其中氮含量和NH₄含量減為約1/5至1/4)中繼續(xù)培養(yǎng)。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(f2)中，所述切除的下端莖段的長度為0.3-5mm，較佳地，0.5-4mm，更佳地，0.6-2mm。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(f2)中，在1/2MS培養(yǎng)基(其中氮含量和NH₄含量減為約1/5至1/4)中繼續(xù)培養(yǎng)4-6周，于24±1℃培養(yǎng)誘導(dǎo)得到不定根。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(f2)中，將獲得的不定根培養(yǎng)于25±2℃，培養(yǎng)1-2周后得到離體再生的完整小植株(即落葉松植物植株)。

在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括將步驟(f)獲得的植株進(jìn)行煉苗后，移植入栽培土中培養(yǎng)的步驟。

在另一優(yōu)選例中，所述栽培土中培養(yǎng)的溫度為25±2℃。

在另一優(yōu)選例中，所述栽培土的基質(zhì)包括泥炭、菜園土、和/或珍珠巖。

在另一優(yōu)選例中，所述泥炭、菜園土、珍珠巖的比例為3:6:1。

在另一優(yōu)選例中，所述落葉松植物選自下組的屬：松科屬、落葉松屬、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述落葉松植物選自下組：日本落葉松、華北落葉松、長白落葉松、云南落葉松、、新疆落葉松、日本落葉松×長白落葉松(雜交落葉松)、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(a)中，所述萌發(fā)溫度為25±1℃。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(a)中，所述萌發(fā)時間為5-30天，較佳地，8-20天，更佳地，7-15天。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了落葉松下胚軸再生體系，其中圖A：膨大的下胚軸切斷，bar:2mm。圖B：初級胚性愈傷組織，bar:4mm。圖C：富含大量芽原基的愈傷組織，bar:6mm。圖D：高頻同步化叢芽，bar:8mm。圖E：伸長的芽苗，bar:1cm。圖F：離體生根的小植株，bar:4cm。

具體實施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入地研究，經(jīng)過大量篩選，首次以采用特定工藝制備的落葉松植物實生苗的下胚軸切段作為起始外植體，在特定的低氮、低NH₄⁺含量的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，可誘導(dǎo)出含有許多胚性細(xì)胞的愈傷組織，并可進(jìn)一步高效誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生,并經(jīng)過不定芽的伸長、生根及移栽成苗后，可獲得大量再生植株表型一致性高、遺傳穩(wěn)定性好的落葉松植物。用本發(fā)明的培育方法獲得的落葉松植物植株，可作為體細(xì)胞雜交的親本之一，進(jìn)行細(xì)胞雜交，從而可高效快速地開發(fā)不同于原親本的落葉松新種質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。

培養(yǎng)基

本文所用的MS培養(yǎng)基是本領(lǐng)域目前使用最普遍的培養(yǎng)基，Murashige和Skoog于1962年為煙草細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計的，其特點是無機(jī)鹽和離子濃度較高，是較穩(wěn)定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養(yǎng)分的數(shù)量和比例合適，能滿足植物細(xì)胞的營養(yǎng)和生理需要,因而適用范圍比較廣，多數(shù)植物組織培養(yǎng)快速繁殖用它作為培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基(Murashige and Skoog A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.Physiol Plant,1962.15(3):473.)。除非另有說明，采用本領(lǐng)域已知的配方配制MS培養(yǎng)基或MS固體培養(yǎng)基即可。

在本發(fā)明中，所采用的培養(yǎng)基可在本領(lǐng)域的落葉松植物的常規(guī)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行構(gòu)建，并同時對常規(guī)培養(yǎng)基中的總氮含量進(jìn)行調(diào)節(jié)，使得培養(yǎng)基中的總氮含量(濃度)低于常規(guī)培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，本發(fā)明的一類優(yōu)選的培養(yǎng)基(即落葉松培養(yǎng)基)為低氮和/或低NH₄⁺的培養(yǎng)基。

如本文所用，“低氮”指所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件的氮含量N_L與MS培養(yǎng)基中氮含量N0之比(Nl/N0)為0.3-0.9，較佳地0.35-0.8，更佳地0.3-0.6。

如本文所用，“低NH₄⁺”指所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件的NH₄⁺含量M_L與MS培養(yǎng)基中NH₄⁺含量M0之比(Ml/M0)為0.2-0.7，較佳地0.25-0.6，更佳地0.3-0.5。

在本發(fā)明中，所述的低氮和/或低NH₄⁺的培養(yǎng)基可以基于本領(lǐng)域常規(guī)的培養(yǎng)基(如MS培養(yǎng)基、ML培養(yǎng)基)進(jìn)行配制。

典型地，一類特別優(yōu)選的落葉松培養(yǎng)基是基于MS培養(yǎng)基的低氮和/或低NH₄⁺的培養(yǎng)基。在另一優(yōu)選例中，在所述低氮和/或低NH₄⁺的培養(yǎng)基中，除了氮和/或NH₄⁺之外的其他成分和含量與MS培養(yǎng)基基本相同(例如對于任一其他成分而言，為標(biāo)準(zhǔn)MS培養(yǎng)基中同一成分含量的約80-130％，較佳地90-120％)。

在本發(fā)明中，所述子步驟(d1)、(d2)、(d3)和/或(d4)的一個或多個或全部子步驟中，在低氮、低NH₄⁺的培養(yǎng)基中進(jìn)行再生。

通常，在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，總氮含量(濃度)為MS培養(yǎng)基中氮含量(濃度)的1/4-1/2，較佳地，1/3-1/2。此外，K⁺、Ca²⁺的濃度與MS培養(yǎng)基中的K⁺、Ca²⁺的濃度基本相同，較佳地，以培養(yǎng)基的總重計，K⁺、Ca²⁺的濃度為80-120％。

在一優(yōu)選實施方式中，在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，NH₄Cl的濃度為300-650mg/l，較佳地，400-600mg/l。

在一優(yōu)選實施方式中，在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，NH₄NO₃的濃度為400-700mg/l，較佳地，500-650mg/l。

在一優(yōu)選實施方式中，在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，KNO₃的濃度為600-1000mg/l，較佳地，700-900mg/l。

在一優(yōu)選實施方式中，在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，以Ca(NO₃)₂·2H₂O的質(zhì)量計，Ca(NO₃)₂·2H₂O的濃度為400-800mg/l，較佳地，500-700mg/l。

6-芐基腺嘌呤

如本文所用，術(shù)語“6-芐基腺嘌呤”、“6-芐腺嘌呤”、“6-苯甲基腺嘌呤”、“6-BA”、“芐基腺嘌呤”、“BA”等均可以與互換使用。

6-芐基腺嘌呤是一種廣譜性植物生長調(diào)節(jié)劑，可促進(jìn)植物細(xì)胞生長，抑制植物葉綠素、核酸、蛋白質(zhì)的分解，提高氨基酸的含量，延緩葉片衰老，將氨基酸、生長素、無機(jī)鹽等向處理部位調(diào)運(yùn)等多種效能，廣泛用在農(nóng)業(yè)、果樹和園藝作物的從發(fā)芽到收獲的各個階段。

本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以使用常規(guī)方法獲得6-芐基腺嘌呤，如市場購買或用常規(guī)方法制取。

赤霉素

如本文所用，術(shù)語“赤霉素”可以與“GA”、“GA₃”互換使用。

赤霉素是一類廣泛存在的植物激素，化學(xué)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，屬于二萜類酸，由四環(huán)骨架衍生而得。赤霉素都含有赤霉素烷骨架。在高等植物中赤霉素的最近前體一般認(rèn)為是貝殼杉烯。赤霉素的基本結(jié)構(gòu)是赤霉素烷，有4個環(huán)。在赤霉素烷上，由于雙鍵、羥基數(shù)目和位置不同，形成了各種赤霉素，已知的赤霉素類至少有38種。不同的赤霉素生物活性不同，赤霉酸(GA₃)的活性最高?；钚愿叩幕衔锉仨氂幸粋€赤霉環(huán)系統(tǒng)(環(huán)ABCD)，在C-7上有羧基，在A環(huán)上有一個內(nèi)酯環(huán)。

赤霉素目前廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，如提高葡萄產(chǎn)量，或在雜交水稻制種中調(diào)節(jié)花期以使父母本花期相遇等；對水稻、棉花、蔬菜、瓜果、綠肥等有顯著的增產(chǎn)效果。

本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以使用常規(guī)方法獲得各種赤霉素，如市場購買或用常規(guī)方法制取。一種常規(guī)制取赤霉素的方法為用甲醇提取。不同的赤霉素可以用各種色譜分析技術(shù)分開。

萘乙酸

如本文所用，術(shù)語“萘乙酸”可以與“NAA”互換使用。

萘乙酸是廣譜型植物生長調(diào)節(jié)劑，能促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大，誘導(dǎo)形成不定根增加座果，防止落果，改變雌、雄花比率等?？山?jīng)葉片、樹枝的嫩表皮，種子進(jìn)入到植株內(nèi)，隨營養(yǎng)流輸導(dǎo)到全株。

本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以使用常規(guī)方法獲得萘乙酸，如市場購買或用常規(guī)方法制取。

IBA

如本文所用，術(shù)語“IBA”、“吲哚丁酸”可互換使用。

吲哚丁酸(IBA)是專性生根激素，并且是一種廣譜的吲哚類植物生長調(diào)節(jié)劑，是良好的生根劑，可促進(jìn)草本和木本觀賞植物插枝的生根。還可用于瓜果的座果，提高座果率。

在本發(fā)明中，添加IBA的目的與效果是為了促進(jìn)生根，加快植物的生殖轉(zhuǎn)換。

本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以使用常規(guī)方法獲得IBA，如市場購買或用常規(guī)方法制取。

TDZ

如本文所用，術(shù)語“TDZ”、“噻苯隆(thidiazuron)”可互換使用。

TDZ是一種新型植物生長調(diào)節(jié)劑，具有很強(qiáng)的細(xì)胞分裂素活性(CTK)，它的CTK活性要比一般CTK高幾十倍至幾百倍，研究表明，它可以促進(jìn)植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眼，促進(jìn)種子萌發(fā)，促進(jìn)愈傷組織生長，延緩植物衰老等。

在本發(fā)明中，添加TDZ的目的是促進(jìn)不定芽分化。

本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以使用常規(guī)方法獲得TDZ，如市場購買或用常規(guī)方法制取。

本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。

本發(fā)明的主要優(yōu)點包括：

(1)本發(fā)明首次對落葉松植物的直接不定芽離體發(fā)生進(jìn)行了研究，并獲得了較高頻率的再生植株。

(2)本發(fā)明首次以落葉松植物的實生苗下胚軸為起始外植體，可誘導(dǎo)出含有許多胚性細(xì)胞的愈傷組織，并可進(jìn)一步高效誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生,并經(jīng)過不定芽的伸長、生根及移栽成苗后，可獲得大量再生植株表型一致性高、遺傳穩(wěn)定性好、遺傳保守性高的落葉松植物。

(3)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的落葉松下胚軸再生體系還可以作為體細(xì)胞雜交的親本之一，進(jìn)行細(xì)胞雜交，可創(chuàng)造不同于原親本的落葉松新種質(zhì)。

(4)本發(fā)明的方法可離體快速大量繁殖落葉松植物，重復(fù)性好。

(5)本發(fā)明的方法能夠在短時間內(nèi)生產(chǎn)大量的落葉松優(yōu)質(zhì)種苗，而且這種種苗的發(fā)生不受季節(jié)限制，可以常年生產(chǎn)。

(6)本發(fā)明首次使落葉松下胚軸培養(yǎng)成功再生成植株。按本發(fā)明的方法重復(fù)三次試驗，平均每個下胚軸切斷能產(chǎn)生再生植株約20-30株，且與親本表型一致性高，并且不定芽誘導(dǎo)率高(約90％或更高)，生根率高(約95％)，移栽存活率高(約90％或更高)

(7)本發(fā)明的落葉松下胚軸再生體系可以用來拯救瀕臨滅絕的落葉松種質(zhì)資源。

下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。

除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

除非另有說明，否則本發(fā)明實施例中所用的材料和試劑均為市售產(chǎn)品。

實施例1

落葉松培養(yǎng)基No.1-3的制備

配制落葉松植物培養(yǎng)基，基于MS培養(yǎng)基的配方，對KNO₃、NH₄NO₃、NH₄Cl、和Ca(NO₃)₂·2H₂O的含量進(jìn)行調(diào)整(如表1所示)，其他成分不作調(diào)整。調(diào)節(jié)pH值至5.8，121℃滅菌15-25分鐘。從而得到低氮/低NH₄⁺的培養(yǎng)基No.1、No.2和No.3。不定芽的誘導(dǎo)和伸長均使用所述的低氮/低NH₄⁺的培養(yǎng)基(可簡稱為“落葉松培養(yǎng)基”)。

同時將市售的MS培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基。

表1

實施例2再生植株的制備

在本實施例中，對于實施例1中制備的落葉松培養(yǎng)基No.1-3以及對照的MS培養(yǎng)基，對經(jīng)特定工藝制備的下胚軸切段(或?qū)φ涨卸尾牧?進(jìn)行再生處理。其中，各實驗條件下重復(fù)三次。具體實驗方法如下：

實驗方法：

(1)將長白落葉松種子(由東北林業(yè)大學(xué)提供)用自來水浸泡1周，去除壞死病變的種子。將種子置于濕潤的脫脂棉上，種子上覆蓋濕透的紗布，28℃溫室萌發(fā)，注意保濕，10-15天后出苗。

(2)將出苗7-15天的落葉松實生苗用自來水洗凈，吸干表面水珠，在超凈工作臺上用70％的乙醇消毒30-90秒，0.1％的升汞浸泡5-8分鐘，無菌水沖洗5-8次，無菌濾紙吸干無菌材料表面水珠，將下胚軸切成2-4毫米的切段以備用。(對照材料為10mm的下胚軸切段)

(3)將下胚軸切段接種于附含0.5-3mg/l BA和0.1-0.5mg/l NAA的實施例1所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-15天后，下胚軸切斷的近子葉端開始膨大(圖1，圖A)，在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)4-6周后，起始外植體基本上被致密的愈傷組織包裹(圖1，圖B)。培養(yǎng)條件：光照(60μmol.m^-2.s^-1)16h/d培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為23±1℃。

(4)將步驟(3)所得的致密的愈傷組織在附含0.5-3mg/l BA和0.1-0.5mg/l NAA的實施例1所述的培養(yǎng)基上培養(yǎng)8-12周后，基開出現(xiàn)形態(tài)模糊的原始不定芽，即芽原基(圖1，圖C)。光照(60μmol.m^-2.s^-1)16h/d培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為23±1℃，4周繼代一次，培養(yǎng)基不變。繼代頻次，4周/代。

(5)將附帶原始不定芽的愈傷組織在附含0.5-3mg/l BA，0-0.01mg/l TDZ和0.1-0.5mg/l NAA的實施例1所述的培養(yǎng)基上培養(yǎng)6-8周后，誘導(dǎo)出形態(tài)清晰的不定芽(圖1，圖D)。光照培養(yǎng)(60μmol.m^-2.s^-1)16h/d，培養(yǎng)溫度為23±1℃。

(6)將不定芽轉(zhuǎn)入附含0-0.6mg/l BA、0-0.06mg/l NAA和0-0.6mg/l GA₃的實施例1所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)4-6周后，不定芽得到有效伸長(圖1，圖E)，光照(60μmol.m^-2.s^-1)16h/d，培養(yǎng)溫度22±1℃。

(7)將伸長的芽苗在步驟(5)的培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)(22±1℃)3-7天。

(8)將暗培養(yǎng)后的芽苗分離成單株，剝?nèi)バ∶缧螒B(tài)學(xué)下端葉片，用50mg/l IBA預(yù)處理0-36h，切除形態(tài)學(xué)下端1mm莖段后，轉(zhuǎn)入附含0.1-0.5mg/l IBA的1/2實施例1所述的落葉松培養(yǎng)基(減半的落葉松培養(yǎng)基)中培養(yǎng)4-6周后不定根被誘導(dǎo)出來(圖1，圖F)。生根培養(yǎng)基附加蔗糖2％，且用0.25％結(jié)冷膠(gelrite)固化。培養(yǎng)條件：光照(80μmol.m^-2.s^-1)16h/d，培養(yǎng)溫度24±1℃。

(9)將步驟(7)所得生根苗連同培養(yǎng)基、培養(yǎng)瓶等一起轉(zhuǎn)入28±2℃、光照(80μmol.m^-2.s^-1)16h/d的培養(yǎng)條件下進(jìn)行耐受培養(yǎng)1-2周后，打開培養(yǎng)瓶蓋子，注入10-20ml無菌水或去離子水，煉苗5-8天。

(10)將生根小苗移栽到泥炭、菜園土和珍珠巖(3∶6∶1)的基質(zhì)中，在28±2℃、自然光照的大棚中生長良好，成為與自然生長小苗一致的落葉松再生植株。

實驗結(jié)果：

采用常規(guī)的MS培養(yǎng)基(對照培養(yǎng)基)時，采用10mm的下胚軸切段作為植物材料時，無法獲得再生的落葉松植株。采用常規(guī)的MS培養(yǎng)基(對照培養(yǎng)基)時，即使采用經(jīng)特定工藝制備的下胚軸切段并分階段統(tǒng)計，所得到的落葉松的不定芽誘導(dǎo)率僅為20％，生根率僅為10％，移栽存活率為75％。平均每個下胚軸切斷僅能產(chǎn)生再生植株≤0.3株。

與此相反，采用本發(fā)明特定的特定工藝制備的落葉松下胚軸切段并在特定的低氮/低NH₄⁺的培養(yǎng)基(實施例1中的培養(yǎng)基No.1、2或3)，均可大幅提高再生植株的產(chǎn)率。

采用2-4mm的下胚軸切段并采用實施例1制備的落葉松培養(yǎng)基No.1、2或3時，各個培養(yǎng)基中的結(jié)果基本相同。對于落葉松植物來說，平均每個下胚軸切斷能產(chǎn)生再生植株20-30株(與采用MS培養(yǎng)基對照組相比，提高了約60-90倍)，且與親本表型一致性高，并且不定芽誘導(dǎo)率90-92％，生根率約94-96％，移栽存活率90％。與采用MS培養(yǎng)基對照組相比，落葉松培養(yǎng)基組的再生植株形態(tài)更優(yōu)。

實施例3

本實施例的步驟與實施例2基本相同，不同之處采用華北落葉松種子替換長白落葉松種子。

與采用常規(guī)的MS培養(yǎng)基(對照培養(yǎng)基)的對照組(平均每個下胚軸切斷僅能產(chǎn)生再生植株≤0.3株)相比，采用本發(fā)明特定的特定工藝制備的落葉松下胚軸切段并在特定的低氮/低NH₄⁺的培養(yǎng)基(實施例1中的培養(yǎng)基No.1、2或3)，均可大幅提高再生植株的產(chǎn)率。

采用2-4mm的下胚軸切段并采用實施例1制備的落葉松培養(yǎng)基No.1、2或3時，各個培養(yǎng)基中的結(jié)果基本相同。對于落葉松植物來說，平均每個下胚軸切斷能產(chǎn)生再生植株22-32株(與采用MS培養(yǎng)基對照組相比，提高了約70-96倍)，且與親本表型一致性高，并且不定芽誘導(dǎo)率89-92％，生根率約90-95％，移栽存活率約90％。

實施例3

本實施例的步驟與實施例2基本相同，不同之處采用云南落葉松種子替換長白落葉松種子。

與采用常規(guī)的MS培養(yǎng)基(對照培養(yǎng)基)的對照組(平均每個下胚軸切斷僅能產(chǎn)生再生植株≤0.32株)相比，采用本發(fā)明特定的特定工藝制備的落葉松下胚軸切段并在特定的低氮/低NH₄⁺的培養(yǎng)基(實施例1中的培養(yǎng)基No.1、2或3)，均可大幅提高再生植株的產(chǎn)率。

采用2-4mm的下胚軸切段并采用實施例1制備的落葉松培養(yǎng)基No.1、2或3時，各個培養(yǎng)基中的結(jié)果基本相同。對于落葉松植物來說，平均每個下胚軸切斷能產(chǎn)生再生植株22-28株(與采用MS培養(yǎng)基對照組相比，提高了至少約60倍)，且與親本表型一致性高，并且不定芽誘導(dǎo)率約91％，生根率約94％，移栽存活率＞90％。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。