本發(fā)明屬于細(xì)胞低溫凍存技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雪旺細(xì)胞的低溫凍存方法。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，隨著活體細(xì)胞和組織在醫(yī)學(xué)，生物學(xué)，藥學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，對(duì)活體細(xì)胞和組織的需求也日益增長(zhǎng)，而離體的細(xì)胞和組織在常溫下難以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存和長(zhǎng)途運(yùn)輸，且細(xì)胞的體外培養(yǎng)本身過(guò)于耗時(shí)耗材。因此，低溫凍存作為目前最常用的對(duì)活體細(xì)胞和組織的保存技術(shù)，逐漸成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。在傳統(tǒng)的低溫凍存過(guò)程中，隨著溫度的下降，細(xì)胞的生理活動(dòng)被迫停止，而當(dāng)溫度恢復(fù)至生理溫度，細(xì)胞復(fù)蘇，細(xì)胞又可恢復(fù)活性，發(fā)揮其生理功能。然而現(xiàn)有的凍存方法會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定程度的冰晶損傷，以及由于凍存保護(hù)劑的加入和難以去除帶來(lái)的毒性傷害，體積變化損傷和滲透損傷。

目前將凝膠應(yīng)用于低溫凍存的研究報(bào)道中，多為利用水凝膠包埋活細(xì)胞的方法來(lái)減少低溫?fù)p傷。hang等研究了利用海藻酸-多聚賴氨酸-海藻酸微膠囊做微囊化肝細(xì)胞凍存相對(duì)于直接對(duì)肝細(xì)胞凍存的影響，復(fù)蘇后的檢測(cè)結(jié)果表明，微囊化凍存組相對(duì)直接凍存組，生存能力更強(qiáng)，附件效率也更高。haishuihuang等發(fā)現(xiàn)海藻酸鹽水凝膠微囊化的細(xì)胞可以在凍存后的復(fù)蘇過(guò)程中有效的抑制反玻璃化，從而保護(hù)細(xì)胞免受其內(nèi)部的冰晶對(duì)細(xì)胞造成的傷害。但微膠囊的包裹會(huì)限制甚至阻礙貼附型細(xì)胞的貼壁、遷移、增殖和分化。例如：kuldipsidhu等研究了海藻酸鹽水凝膠微囊化的人體胚胎干細(xì)胞(hescs)和未被包埋的胚胎干細(xì)胞的活性和干性。研究結(jié)果表明，被海藻酸鹽凝膠包埋的的活性和干性都較未包埋的hescs低，且海藻酸鹽凝膠囊膜難以去除。

與傳統(tǒng)凝膠通過(guò)化學(xué)交聯(lián)的方法形成凝膠態(tài)不同，超分子水凝膠由低分子的有機(jī)化合物即凝膠因子在水中通過(guò)分子間非共價(jià)鍵作用(如氫鍵，靜電作用，π-π共軛)形成交聯(lián)得到三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而形成凝膠態(tài)。因而超分子水凝膠的交聯(lián)方式屬于物理交聯(lián)，更加接近自然界中生物體的交聯(lián)結(jié)構(gòu)。因此，超分子水凝膠的生物相容性極佳。此外，分子間非共價(jià)鍵的作用本身可逆，因而超分子凝膠通常也是可逆的，并且還可能具備自修復(fù)特性和刺激響應(yīng)性。因此，作為一種軟物質(zhì)材料，超分子水凝膠在藥物載體，生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用廣泛。

目前相關(guān)的報(bào)道多利用水凝膠微膠囊來(lái)凍存細(xì)胞或組織，而基于超分子凝膠在微流控裝置中的低溫保存研究卻很少。微流控技術(shù)作為一種可以在截面尺寸為微米級(jí)的微型通道內(nèi)操控流體的中心技術(shù)，在許多微型系統(tǒng)包括化學(xué)，生物和醫(yī)藥等方面應(yīng)用廣泛。常見(jiàn)的微通道包括由軟刻蝕技術(shù)制得的pdms硅膠通道和由毛細(xì)管構(gòu)成的玻璃微通道。相比pdms硅膠微通道形成的微流控裝置，玻璃毛細(xì)管微流控裝置的制作成本更為低廉，方法更為簡(jiǎn)便，且存儲(chǔ)量更大。

雪旺細(xì)胞最早是在1939年被theodorschwann發(fā)現(xiàn)和命名的一種膠質(zhì)細(xì)胞。雪旺細(xì)胞通過(guò)在外周神經(jīng)系統(tǒng)中增殖，遷移和分化等形成鞘突，鞘和軸突一起構(gòu)成了一個(gè)神經(jīng)纖維。研究表明，雪旺細(xì)胞對(duì)周圍神經(jīng)的發(fā)育和再生等影響重大。wang等通過(guò)移植技術(shù)將雪旺細(xì)胞移植到坐骨神經(jīng)損傷處，成功使坐骨神經(jīng)再生。因此，雪旺細(xì)胞對(duì)神經(jīng)修復(fù)有重要意義。對(duì)雪旺細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存可以幫助更好地研究其生物學(xué)特征和臨床應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種雪旺細(xì)胞的低溫凍存方法，減少被包埋的雪旺細(xì)胞在凍存過(guò)程中受到的損傷，提高復(fù)溫后雪旺細(xì)胞的存活率，并保證其正常的增殖情況。

為達(dá)到上述目的，采用技術(shù)方案如下：

利用受限空間中超分子水凝膠凍存雪旺細(xì)胞的方法，包括以下步驟：

將已貼壁的雪旺細(xì)胞經(jīng)消化，離心，加入溶有凝膠因子的細(xì)胞全培養(yǎng)基并吹散，得到含有凝膠因子的雪旺細(xì)胞懸浮液；

將所得細(xì)胞懸浮液和凍存保護(hù)劑導(dǎo)入微流控裝置中；

將微流控裝置置于0～2℃冰水浴中，平衡4～5min；

最后將微流控裝置直接置于程序降溫盒，并放入-82～-78℃冰箱。

按上述方案，所述的凝膠因子為低分子量的氨基酸類凝膠因子；其濃度為0.75g/l，相轉(zhuǎn)變溫度為6-7℃。

按上述方案，所述的細(xì)胞全培養(yǎng)基為含有10vol％胎牛血清和1vol％雙抗的rpmi1640全培養(yǎng)基。

按上述方案，所述的微通道裝置由圓形毛細(xì)管、方形毛細(xì)管、聚四氟乙烯管、聚氨酯管組裝而成：

將圓形毛細(xì)管一端插入到方形毛細(xì)管中，保證方形毛細(xì)管的內(nèi)壁和圓形毛細(xì)管的外壁緊貼；所述方形毛細(xì)管的長(zhǎng)度較長(zhǎng)；

使用聚四氟乙烯管一端套住圓形毛細(xì)管的伸出端并密封；

使用聚氨酯管套住聚四氟乙烯管、圓形毛細(xì)管和方形毛細(xì)管；所述聚氨酯管與方形毛細(xì)管重合的一端縮小管口徑并密封，另一端即為凍存保護(hù)劑的入口；

所用聚氨酯管側(cè)面開(kāi)有孔，聚四氟乙烯管口從孔中伸出，即為細(xì)胞懸浮液入口。

按上述方案，所述的凍存保護(hù)劑為二甲基亞砜；濃度為6-10vol％。

本發(fā)明低分子量的氨基酸類凝膠因子通過(guò)非共價(jià)鍵自組裝形成超分子水凝膠具有良好的生物相容性。由于非共價(jià)鍵具有熱可逆性，因此所得超分子水凝膠也是熱可逆的。該超分子水凝膠通過(guò)調(diào)節(jié)凝膠因子濃度可保證其在低溫時(shí)形成凝膠相，在復(fù)溫即37℃時(shí)由凝膠相轉(zhuǎn)變?yōu)橐合啵虼丝赏ㄟ^(guò)離心與細(xì)胞分離。同時(shí)，在細(xì)胞培養(yǎng)基和傳統(tǒng)的凍存保護(hù)劑中加入超分子凝膠，利用超分子凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和熱可逆性來(lái)降低細(xì)胞在凍存和復(fù)溫過(guò)程中的損傷，并解決復(fù)溫后囊膜材料的去除問(wèn)題。

本發(fā)明微流控裝置制備簡(jiǎn)單，可提供超分子水凝膠的受限空間。使超分子水凝膠形成纖維網(wǎng)絡(luò)更為緊密的球形三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在凍存過(guò)程中對(duì)細(xì)胞起到更好的保護(hù)作用。具體表現(xiàn)為：束縛水分子，降低體系冰點(diǎn)，限制冰晶的生長(zhǎng)空間，減少冰晶損傷；減小滲透速率，減緩由于凍存保護(hù)劑的加入和去除而引起的滲透壓的變化，從而減少細(xì)胞滲透和體積變化損傷，以提高細(xì)胞復(fù)溫后的存活率。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，主要具有以下優(yōu)點(diǎn)：

在凍存過(guò)程中利用超分子水凝膠特殊的三維網(wǎng)絡(luò)多孔結(jié)構(gòu)保護(hù)細(xì)胞免受凍存?zhèn)?，提高?xì)胞復(fù)溫后的存活率，又保證了它在復(fù)溫后能完全去除，不影響細(xì)胞的貼壁，增殖和分化等活動(dòng)。

由于超分子水凝膠在受限空間中形成的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較非受限空間更加緊密，因此在微通道中的超分子水凝膠比微通道外的超分子水凝膠對(duì)細(xì)胞的冷凍保護(hù)更好。微流控技術(shù)作為一種微米規(guī)模的技術(shù)手段，其尺度剛好與細(xì)胞大小吻合，且相對(duì)傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，微流控設(shè)備可以對(duì)細(xì)胞所處的微環(huán)境做更為靈活精準(zhǔn)的控制。與軟刻蝕法得到的微通道裝置相比，利用玻璃毛細(xì)管得到的微流控裝置成本更低，制作更為簡(jiǎn)單，且可凍存體積更大。

由于受限空間內(nèi)超分子水凝膠的結(jié)構(gòu)可起到很好的冷凍保護(hù)作用，因而可通過(guò)微流控精準(zhǔn)調(diào)控凍存保護(hù)劑的用量，在傳統(tǒng)用量的基礎(chǔ)上適當(dāng)降低所加入凍存保護(hù)劑的濃度，這樣就更進(jìn)一步的減少了細(xì)胞的毒性傷害，再次提高細(xì)胞的存活率。

附圖說(shuō)明

圖1：dsc分析圖；

圖2：微流控裝置的示意圖；

圖3：載玻片上的超分子水凝膠微觀形貌；

圖4：微流控裝置內(nèi)超分子水凝膠的微觀形貌；

圖5：各組復(fù)溫后雪旺細(xì)胞的存活率；

圖6：各組復(fù)溫后細(xì)胞的存活和增殖情況；

其中：1-方形毛細(xì)管，2-圓形毛細(xì)管，3-聚氨酯管，4-聚四氟乙烯管。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例進(jìn)一步闡釋本發(fā)明的技術(shù)方案，但不作為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。

實(shí)施例1：超分子水凝膠的制備及其性能研究

以boc-l-酪氨酸甲酯、dmf和溴代十二烷等為原料合成凝膠因子十二烷基-boc-l-酪氨酸，記為凝膠因子bdt。該凝膠因子的合成方法如下：

(1)十二烷基-boc-l-酪氨酸甲酯(bdte)的合成(boc-l-酪氨酸甲酯烷基化)：

稱取3.998g(0.0135mol)boc-l-酪氨酸甲酯置于25ml圓底燒瓶中，加入10mldmf，待原料完全溶解后，再加入3.7113gk2co3(0.027mol)作為縛酸劑，后加入4ml溴代十二烷(0.0167mol)，室溫反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后加20ml水洗滌，抽濾、洗滌濾餅、真空干燥24h后得到得白色固體。無(wú)水乙醇(20ml)重結(jié)晶1次，得純凈的白色固體。

(2)bdt的合成(bdte的水解反應(yīng))：

將0.5007g(0.0011mol)bdte置于25ml燒瓶中用10ml乙醇溶解，在冰水浴下逐滴加入1mol/l的naoh溶液1.7ml(0.0017mol)，在0℃左右反應(yīng)1h，室溫反應(yīng)5h。在強(qiáng)烈攪拌下向反應(yīng)體系中逐滴加入0.2mol/l的冰鹽酸(25ml)溶液至ph為1～2，抽濾，真空干燥24h得0.4858g白色固體。

該凝膠因子bdt可通過(guò)加熱溶于細(xì)胞培養(yǎng)基，并在低溫時(shí)形成具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的超分子水凝膠，且該超分子水凝膠熱可逆，在溫度回升至其相轉(zhuǎn)變溫度以上時(shí)可恢復(fù)至液態(tài)。

將1.5g/l的bdt在50～55℃條件下溶于細(xì)胞培養(yǎng)基溶液，記為溶液s。通過(guò)倒置法確定溶液s可在3～5℃冰水浴中形成超分子水凝膠，記為凝膠g。通過(guò)升高體系溫度，利用落球法測(cè)試得到凝膠g的相轉(zhuǎn)變溫度為6.5℃，遠(yuǎn)低于細(xì)胞復(fù)溫時(shí)的37℃。因此可選用溶液s導(dǎo)入到微通道作為細(xì)胞凍存時(shí)的培養(yǎng)基，使其在受限空間形成特殊的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以保護(hù)細(xì)胞。

以加入了10vol％的dmso的rpmi1640培養(yǎng)基作為空白組，在空白組的基礎(chǔ)上加入1.5g/l的bdt的混合溶液作為凝膠組，對(duì)兩組培養(yǎng)基溶液做dsc測(cè)試，結(jié)果如圖1所示，空白組體系冰點(diǎn)為-17.03℃，而加入了bdt的凝膠組體系冰點(diǎn)為-20.46℃，相比空白組冰點(diǎn)有所下降，說(shuō)明g的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可有效降低體系冰點(diǎn)，減少細(xì)胞在凍存過(guò)程中的冰晶損傷。

實(shí)施例2：微流控裝置的制備和微流控裝置內(nèi)超分子水凝膠的形貌

微流控裝置的制備主要采用購(gòu)自北京中成石英玻璃制品有限責(zé)任公司的石英玻璃毛細(xì)管。具體制備過(guò)程如下：將長(zhǎng)度為40mm的圓形毛細(xì)管(內(nèi)徑0.4mm，外徑0.7mm)插入到聚四氟乙烯管(內(nèi)徑1.0mm，外徑1.3mm，購(gòu)自無(wú)錫海新塑料制品有限公司)中，連接處通過(guò)環(huán)氧樹(shù)脂膠和硅膠質(zhì)量比為1：1的環(huán)氧結(jié)構(gòu)膠(購(gòu)自美國(guó)itwdevcon公司)粘接密封，固化約30min。用剪刀在聚氨酯管(內(nèi)徑2.0mm，外徑2.8mm，購(gòu)自無(wú)錫海新塑料制品有限公司)的上方開(kāi)一小孔，將聚四氟乙烯管的另一端自聚氨酯管內(nèi)部插入，從小孔處插出，連接處用環(huán)氧結(jié)構(gòu)膠粘結(jié)密封。將圓形毛細(xì)管的另一端插入到長(zhǎng)度為110mm的方形毛細(xì)管(內(nèi)徑0.7mm，外徑0.9mm)中，兩管重合部分為20mm。方形毛細(xì)管的同一端插入到聚氨酯管有聚四氟乙烯管插入的一端中，連接處用環(huán)氧結(jié)構(gòu)膠粘結(jié)密封，待環(huán)氧結(jié)構(gòu)膠固化1～2h，微流控裝置制作完成。

如圖2所示，所述微流控裝置由方形毛細(xì)管1、圓形毛細(xì)管2、聚氨酯管3、以及聚四氟乙烯管4組裝而成。

用一次性注射器吸取0.5ml的溶液s，將一次性注射器針頭插入到聚四氟乙烯管中，將一次性注射器固定在微量注射器泵(購(gòu)自美國(guó)farmingdale公司)上，調(diào)節(jié)流速為50μl/min，將溶液s導(dǎo)入微通道中。將微流控裝置置于0～2℃冰箱中20min，再置于光學(xué)顯微鏡下觀察。此外將溶液s滴在載玻片上，待其自然流平，置于4℃冰箱中20min，也置于光學(xué)顯微鏡下觀察。圖3和圖4分別為在s溶液在載玻片上以及微流控裝置中所形成的超分子水凝膠的形貌。

實(shí)施例3：低溫凍存大鼠雪旺細(xì)胞

1.細(xì)胞的獲得與培養(yǎng)：雪旺細(xì)胞(atcc:crl:2765)是由湖北生物材料工程技術(shù)研究中心從健康成年的雄性大鼠上提取并提供而得。用25ml的t型培養(yǎng)瓶將雪旺細(xì)胞培養(yǎng)在含有10vol％胎牛血清和1vol％雙抗的rpmi1640培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)瓶放置在含有5％co2，且溫度可持續(xù)維持在37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中貼壁生長(zhǎng)，增殖。當(dāng)細(xì)胞增殖到培養(yǎng)瓶底部沒(méi)有空隙時(shí)，加入胰蛋白酶(0.25vol％)進(jìn)行消化，使貼壁的細(xì)胞懸浮，將含有胰蛋白酶的細(xì)胞懸浮液移入離心管，以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心8min，吸棄上清，再次加入全培養(yǎng)基并吹散細(xì)胞，將細(xì)胞接種到多個(gè)培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.添加凝膠因子的雪旺細(xì)胞的凍存管中凍存與復(fù)溫

(1)將已貼壁且處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶消化，使細(xì)胞懸浮于全培養(yǎng)基中，將含有胰蛋白酶的細(xì)胞懸浮液分為等量?jī)山M：空白組，凝膠組。將兩組細(xì)胞懸浮液分別移入離心管，每組均用高速離心機(jī)離心8min，(設(shè)定轉(zhuǎn)速為1000r/min)，使細(xì)胞沉于底部，棄上清。

(2)空白組用全培養(yǎng)基吹散細(xì)胞，凝膠組用加入了1.5g/lbdt的全培養(yǎng)基吹散細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10⁶cells/ml，兩組分別取0.5ml細(xì)胞懸浮液置于2ml凍存管中，在4℃冰水浴中滴加0.5ml的冷凍保護(hù)劑i(在全培養(yǎng)基中加入20vol％dmso，得到冷凍保護(hù)劑i)，在滴加冷凍保護(hù)劑過(guò)程同時(shí)應(yīng)輕輕晃動(dòng)凍存管使dmso和細(xì)胞懸浮液混合均勻，防止溶解放熱等因素對(duì)細(xì)胞造成損傷。

(3)將兩組凍存管放置于程序降溫盒中，再將降溫盒置于-80℃的恒溫冰箱，程序降溫盒可以使降溫速率保持在1℃/min。

(4)復(fù)溫：將程序降溫盒置于-80℃恒溫冰箱保存24h后，取出程序降溫盒中的兩組凍存管，并快速轉(zhuǎn)移到37℃恒溫水浴復(fù)溫，使整個(gè)體系恢復(fù)至液態(tài)。將兩組凍存管中的細(xì)胞懸浮液吸出，加入到15ml離心管中，加入9ml全培養(yǎng)基，經(jīng)1000r/min的速度離心15min，使細(xì)胞沉淀在離心管下方，棄上清，再加入10ml全培養(yǎng)基，重復(fù)離心一次。棄上清，加入4ml全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.添加凝膠因子的雪旺細(xì)胞的微流控技術(shù)凍存與復(fù)溫

(1)在已貼壁的細(xì)胞中加入0.25％濃度的胰蛋白酶，使細(xì)胞消化后懸浮于全培養(yǎng)基中，將含有胰蛋白酶的細(xì)胞懸浮液吸出，加到離心管中，并用高速離心機(jī)離心8min，(設(shè)定轉(zhuǎn)速為1000r/min)，棄上清。向細(xì)胞中加入含有1.5g/lbdt的全培養(yǎng)基并吹散，調(diào)整細(xì)胞濃度為：2×10⁶cells/ml，得到純凈的細(xì)胞懸浮液。

(2)將微流控裝置分為a，b兩組。向a組微流控裝置中加入冷凍保護(hù)劑i，b組微流控裝置中加入冷凍保護(hù)劑ii(在全培養(yǎng)基中加入12vol％dmso，得到冷凍保護(hù)劑ii)。兩組操作步驟相同。具體操作過(guò)程如下：用注射器1吸取0.5ml冷凍保護(hù)劑，注射器2吸取0.5ml細(xì)胞懸浮液，注射器1和聚氨酯管相連，注射器2和聚四氟乙烯管相連。將兩注射器分別固定于兩臺(tái)微流量注射泵上，調(diào)節(jié)流速為5～7μl/min，將含有凝膠因子bdt的雪旺細(xì)胞懸浮液和冷凍保護(hù)劑同時(shí)導(dǎo)入微流控裝置中。將微流控裝置置于0～2℃冰水浴中，平衡4～5min。

(3)將兩組微流控裝置置于梯度降溫盒中，再將降溫盒置于-80℃的恒溫冰箱中，使整個(gè)體系以1℃/min的降溫速率降至-80℃。因此，凍存時(shí)的兩組含全培養(yǎng)基的細(xì)胞懸浮液中，加入的其他成分的最終配比分別為：微流控a組：0.75g/lbdt+10vol％dmso；微流控b組：0.75g/lbdt+6vol％dmso。

(4)復(fù)溫：將程序降溫盒置于-80℃恒溫冰箱保存24h后，取出程序降溫盒中的微流控裝置，并置于37℃恒溫水浴中解凍，使體系恢復(fù)至液態(tài)。用注射器吸取0.5ml全培養(yǎng)基，將聚四氟乙烯管和注射器相連，在方形毛細(xì)管出口端置于離心管中，再將注射器固定在微流量注射泵上，設(shè)定流速為30μl/min，將微流控裝置中的雪旺細(xì)胞沖洗到離心管中，沖洗3-5次，經(jīng)1000r/min的速度離心15min，使細(xì)胞沉淀在離心管下方，棄上清，再加入10ml全培養(yǎng)基，重復(fù)離心一次。棄上清，加入4ml全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

實(shí)施例4：復(fù)溫后雪旺細(xì)胞的檢測(cè)

1.臺(tái)盼蘭排斥實(shí)驗(yàn)

本發(fā)明使用臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)復(fù)溫后大鼠雪旺細(xì)胞的死活，從而計(jì)算和比較不同的凍存方式下每組雪旺細(xì)胞的存活率。具體操作方法如下：

(1)接種雪旺細(xì)胞：取每組復(fù)溫后離心過(guò)的大鼠雪旺細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞密度為6×10³cells/ml。按照每孔90μl的體積標(biāo)準(zhǔn)接種于96孔培養(yǎng)板中，每組接種6個(gè)孔；

(2)臺(tái)盼藍(lán)染色：在接種了細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，選擇一組中的一個(gè)孔，加入10μl0.4％的臺(tái)盼藍(lán)溶液(將4％臺(tái)盼藍(lán)母液用pbs緩沖溶液稀釋10倍制得)，吹打混勻；

(3)計(jì)數(shù)：迅速將細(xì)胞懸浮液充入血球計(jì)數(shù)板，并移至倒置顯微鏡鏡頭下觀察，在染色后3分鐘內(nèi)，于顯微鏡鏡下觀察，此時(shí)，淡藍(lán)色的細(xì)胞是被臺(tái)盼藍(lán)染色成功的死細(xì)胞，沒(méi)有被染上顏色的則是活細(xì)胞，快速記下死細(xì)胞和活細(xì)胞的數(shù)目。根據(jù)公式(4-1)求細(xì)胞存活率，并對(duì)其他每組各孔重復(fù)(2)、(3)，取各組細(xì)胞存活率的平均值。

圖5為復(fù)溫后各組雪旺細(xì)胞的平均存活率。

對(duì)比在凍存管中凍存的對(duì)照組和凝膠組，顯然添加了0.75g/lbdt的凝膠組的雪旺細(xì)胞平均存活率更高。此外，在微流控裝置中凍存的兩組細(xì)胞復(fù)活率均高于凍存管中的兩組細(xì)胞。綜合比較來(lái)看，加入了6vol％dmso的微流控凍存組相比含有10vol％dmso的凍存管組的細(xì)胞平均存活率要更高。

2.mtt比色實(shí)驗(yàn)

本發(fā)明使用mtt比色實(shí)驗(yàn)的方法來(lái)檢測(cè)經(jīng)凍存管凍存和微通道凍存兩種凍存方式凍存，復(fù)溫后各組大鼠雪旺細(xì)胞的存活與生長(zhǎng)情況。具體實(shí)驗(yàn)方法如下：

(1)接種雪旺細(xì)胞：雪旺細(xì)胞經(jīng)兩種凍存方式凍存24h復(fù)溫并離心后，調(diào)整細(xì)胞懸浮液密度為6×10³cells/ml，按照每孔100μl的體積標(biāo)準(zhǔn)接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，其中每組需要接種5塊培養(yǎng)板，每塊培養(yǎng)板中每組細(xì)胞至少接種6個(gè)孔；

(2)96孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)：將96孔培養(yǎng)板放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)0.5天，1天，2天，3天，5天后分別取出一塊培養(yǎng)板做后續(xù)測(cè)試和處理，培養(yǎng)過(guò)程中，若96孔板中全培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，則需立即更換全培養(yǎng)基，確保活細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和增殖；

(3)mtt呈色：將各組的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板做相同mtt呈色處理：每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，隨后繼續(xù)放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中，4h后，取出96孔培養(yǎng)板，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每個(gè)孔都小心加入體積為150μl的dmso，孔底迅速出現(xiàn)紫色結(jié)晶。并將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于搖床，震蕩15min左右至紫色結(jié)晶完全溶解；

(4)測(cè)定吸光值：將96孔板置于酶標(biāo)儀中，先用連續(xù)波長(zhǎng)測(cè)定一個(gè)孔吸收曲線，找出吸收的峰值對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)為550nm，用次波長(zhǎng)測(cè)定吸光值。記錄數(shù)據(jù)；

(5)整理數(shù)據(jù)：將每組培養(yǎng)了0.5天，1天，2天，3天，5天的細(xì)胞經(jīng)mtt比色實(shí)驗(yàn)所測(cè)吸光值整理，以所測(cè)吸光值為y軸，以測(cè)定的生長(zhǎng)時(shí)間為x軸，得到細(xì)胞的增殖曲線。

圖6為各組雪旺細(xì)胞復(fù)溫后0.5天到5天內(nèi)的存活和增殖情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入了凝膠因子bdt后的凍存組其雪旺細(xì)胞存活率相比空白組更高，且凝膠因子的加入沒(méi)有影響到復(fù)溫后細(xì)胞的增殖情況，說(shuō)明超分子水凝膠在復(fù)溫后被去除干凈；在微通道中的凍存組復(fù)溫后的存活率顯然高于凍存管中的雪旺細(xì)胞。綜合比較來(lái)看，加入了6vol％dmso的微流控凍存組相比含有10vol％dmso的凍存管組有更好的凍存保護(hù)效果。這意味著利用受限空間內(nèi)的超分子水凝膠既可以減少細(xì)胞的冷凍傷害，又可以通過(guò)降低冷凍保護(hù)劑的濃度，減小對(duì)細(xì)胞的毒性傷害。