本發(fā)明涉及植物培養(yǎng)方法，具體為提高長春花植物體中長春堿含量的栽培方法。

背景技術：

長春堿(vinblastine)又稱長春花堿是由夾竹桃科植物長春花(catharanthusroseus)中提出的一種生物堿，為細胞周期特異性抗腫瘤藥。作用于g1、s及m期，并對m期有延緩作用。能干擾增殖細胞紡錘體的形成，使有絲分裂停止于中期。并有免疫抑制作用。對何杰金氏病(hodgkinslymphoma)、絨毛膜上皮癌療效較好，對急性白血病、乳腺癌、卵巢癌、睪丸癌、頭頸部癌、口咽部癌、單核細胞白血病均有一定療效。對淋巴肉瘤、網(wǎng)狀細胞肉瘤、腎母細胞瘤、惡性黑色素瘤也有效。

目前主要是從天然植物中提取長春堿，雖然利用化學合成和半合成的方法可以得到長春堿及其衍生物，也有人研究通過組織培養(yǎng)的途徑獲得，但都不理想，不適合生產。組織培養(yǎng)的方法不能合成長春堿的前體之一文多靈，可能是因為組織培養(yǎng)體系不能產生合成文多靈所需的某種酶，這樣組織培養(yǎng)就不能大規(guī)模地生產長春堿。所以從植物體中直接提取長春堿就顯得尤為重要，如何提高植物體中長春堿的含量也成為研究的熱點之一。

技術實現(xiàn)要素：

為了達到提高長春花植物體中長春堿含量的目的，本發(fā)明采用一種新的長春花栽培方法，具體技術方案為：

提高長春花植物體中長春堿含量的栽培方法，將一定濃度的h2o2、乙烯利、乙酰水楊酸、色氨酸的水溶液外施于長春花幼苗或成熟植株，噴灑一次或數(shù)次。處理后采收長春花的枝葉，提取其中的長春堿并檢測其含量。

所述的h2o2、乙烯利、乙酰水楊酸、色氨酸水溶液，h2o2濃度在10～1000mmol/l的范圍內，乙烯利濃度在0.5～50g/l的范圍內，乙酰水楊酸濃度在0.5～100mg/l的范圍內，色氨酸的濃度在10～2000mg/l的范圍內。

所述的外施于長春花幼苗或成熟植物體，幼苗即從萌發(fā)后還未開花的植株，成熟植株即從開花后的植株。外施包括對地上植株的外施和對土壤的外施。

噴灑一次作用一定時間后進行采收，或是間隔一定時間地噴灑數(shù)次后進行采收。

在植物體中，長春堿的生物合成途徑還不能確定，但根據(jù)已有的研究結果表明，它是由單萜吲哚生物堿文多靈和長春質堿耦合而成的，并且進一步的研究結果顯示這種耦合作用是在過氧化物酶(pod)的作用下進行的。

pod是消除植物體內氧自由基的一種活性酶，它與超氧物歧化酶(sod)和過氧化氫酶(cat)協(xié)調一致組成保護酶系統(tǒng)，將植物體內的氧自由基維持在一個較低的水平。植物體內的氧自由基包括o2˙ˉ、oh˙,sod可消除這些氧自由基，而細胞中的作為一種活性氧的h2o2可降低這種效率，超氧物歧化酶(sod)和過氧化氫酶(cat)又可以分解h2o2。h2o2參與植物體內許多重要的生化過程。在正常情況下，氧自由基和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，氧自由基水平很低，不會傷害細胞。但當植物受到外界脅迫時，這種動態(tài)平衡就被打破。

植物體內的活性氧含量過高，能夠造成細胞結構與功能的傷害：它可以引起線粒體結構的損傷，導致某些生化功能受破壞；它也可以使脂膜分子結構受干擾或破壞引起脂膜過氧化，干擾或破壞是與膜功能相關的各種生理功能；氧自由基亦可以導致蛋白質、酶和dna等生物大分子的損傷。而作為次生代謝產物的生物堿，在植物體內的生理作用是行使某種保護測略，所以長春堿的積累可能是某種逆境條件下細胞的正常代謝受到某種干擾而誘導的。

色氨酸是合成生物堿的前體之一，其在色氨酸脫羧酶的作用下首先轉化為色胺，在異胡豆苷合成酶的作用下進一步合成吲哚類生物堿的共同前體異胡豆苷，運用前體飼喂色氨酸的方法可使合成長春堿的前體含量大大提高，使生物堿的代謝發(fā)生平衡流動進而提高長春堿的含量。

本發(fā)明提供的提高長春花植物體中長春堿含量的栽培方法，根據(jù)以上原理向植物體噴施h2o2或者可以誘導長春花植株體內產生更多的h2o2的植物激素，來使植物體中更多的pod酶活性的激發(fā)，從而促進文多靈與長春質堿的締合而形成長春堿，或者運用前體飼喂的方法增加長春堿的合成速率，達到提高植物體中長春堿的含量的目的。這種栽培方法簡單易行，而且效果顯著，可大幅度提高長春堿的含量，較傳統(tǒng)上的從未經(jīng)處理的長春花植株內直接提取長春堿大大節(jié)省了原材料，并且傳統(tǒng)的提取已經(jīng)遠遠滿足不了植物藥市場的年需求量。因此，該方法的為長春堿的產業(yè)化提供了新方法開辟了新途徑。

本發(fā)明提供的提高長春花植物體中長春堿含量的栽培方法的技術效果有：

(1)噴施一定濃度的h2o2、乙烯利、乙酰水楊酸、色氨酸等溶液，其操作簡單易行，適用于大規(guī)模生產，便于實現(xiàn)長春堿的產業(yè)化；

(2)提高長春堿在長春花植物體中的單位產量，可大大節(jié)省原材料，并且工業(yè)生產時，還可同時獲得其它種類的生物堿，提高產業(yè)化的附加值。

具體實施方式

結合實施例說明本發(fā)明的具體技術方案。

實施例1：

將濃度為10mmol/l的h2o2溶液均勻地噴施于苗齡為3個月的長春花幼苗的地上部分，培養(yǎng)2天后，采收長春花幼苗的枝葉，烘干后提取長春堿用高效液相法進行檢測，長春堿含量為25.4μg/gdw，較一般未經(jīng)處理的長春花中長春堿的含量為約20μg/gdw，有所增加，但含量增加不顯著。

實施例2：

將濃度為100mmol/l的h2o2溶液均勻地噴施于苗齡為3個月的長春花幼苗的地上部分，培養(yǎng)2天后，采收長春花幼苗的枝葉，烘干后提取長春堿用高效液相法進行檢測，長春堿含量為50.4μg/gdw，較一般未經(jīng)處理的長春花中長春堿的含量約20μg/gdw，提高了1倍多。

實施例3：

將濃度為1000mmol/l的h2o2溶液均勻地噴施于苗齡為3個月的長春花幼苗的地上部分，培養(yǎng)2天后，采收長春花幼苗的枝葉，烘干后提取長春堿用高效液相法進行檢測，長春堿含量為30.7μg/gdw，較一般未經(jīng)處理的長春花中長春堿的含量約20μg/gdw，有所提高，但與100mmol/l相比含量增加較少，綜合經(jīng)濟原因100mmol/l的h2o2溶液為最適濃度。

實施例4：

用濃度為0.5g/l的乙烯利溶液均勻地噴施于苗齡為18個月的成熟長春花植株的地上部分，7天后采收長春花枝葉，烘干后提取長春堿并用高效液相法進行檢測，結果含量為較未噴施乙烯利的長春花葉片中長春堿含量增加了43.9％。

實施例5：

用濃度為25g/l的乙烯利溶液均勻地噴施于苗齡為18個月的成熟長春花植株的地上部分，7天后采收長春花枝葉，烘干后提取長春堿并用高效液相法進行檢測，結果含量為較未噴施乙烯利的長春花葉片中長春堿含量增加了70.5％。

實施例6：

用濃度為50g/l的乙烯利溶液均勻地噴施于苗齡為18個月的成熟長春花植株的地上部分，7天后采收長春花枝葉，烘干后提取長春堿并用高效液相法進行檢測，結果含量為較未噴施乙烯利的長春花葉片中長春堿含量增加了106.0％。

實施例7：

用濃度為0.5mg/l的乙酰水楊酸溶液均勻地噴施于苗齡為18個月的成熟長春花植株的地上部分，4天后采收長春花枝葉，烘干后提取長春堿并用高效液相法進行檢測，結果含量為較未噴施乙酰水楊酸溶液的長春花葉片中長春堿含量有所增加但增加含量不顯著。

實施例8：

用濃度為100mg/l的乙酰水楊酸溶液均勻地噴施于苗齡為18個月的成熟長春花植株的地上部分，4天后采收長春花枝葉，烘干后提取長春堿并用高效液相法進行檢測，結果顯示含量與未施加乙酰水楊酸溶液相比生物堿含量增加1.3倍。

實施例9：

用濃度為200mg/l的乙酰水楊酸溶液均勻地噴施于苗齡為18個月的成熟長春花植株的地上部分，4天后采收長春花枝葉，烘干后提取長春堿并用高效液相法進行檢測，結果顯示由于添加的濃度過高，對細胞生長產生了不利影響，細胞開始出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。

實施例10：

用濃度為10mg/l的色氨酸溶液均勻地噴施于苗齡為18個月的成熟長春花植株的地上部分，5天后采收長春花枝葉，烘干后提取長春堿并用高效液相法進行檢測，結果顯示由于色氨酸溶液濃度較低，長春花葉片中長春堿含量雖有所增加但增加含量不顯著。

實施例11：

用濃度為1000mg/l的色氨酸溶液均勻地噴施于苗齡為18個月的成熟長春花植株的地上部分，5天后采收長春花枝葉，烘干后提取長春堿并用高效液相法進行檢測，結果顯示噴灑過濃度為1000mg/l的色氨酸溶液的長春花葉片中長春堿含量較未噴施的長春花葉片中長春堿含量增加1倍。

實施例12：

用濃度為2000mg/l的色氨酸溶液均勻地噴施于苗齡為18個月的成熟長春花植株的地上部分，5天后采收長春花枝葉，烘干后提取長春堿并用高效液相法進行檢測，結果顯示噴灑過濃度為2000mg/l的色氨酸溶液的長春花葉片中長春堿含量是未噴施的長春花葉片中長春堿含量的3.14倍。