本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說，涉及一種中藥紅背絲綢的組培快繁方法。

背景技術(shù)：

中藥紅背絲綢，即葡萄科白粉藤屬植物苦郞藤(cissusassamica(laws.)craib.)又名毛葉白粉藤、野葡萄、左邊藤等，其性平，具有拔膿消腫、散瘀止痛等功效，民間常用于跌打損傷、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、癰瘡、腫毒、蛇咬傷等疾病的治療，特別是毒蛇咬傷，研究發(fā)現(xiàn)紅背絲綢有抗拮內(nèi)皮素作用，其乙醇提取物或乙酸乙酯萃取物或從其中分離得到的白藜蘆醇在整體和離體水平對et-1均具有明顯拮抗作用，顯著拮抗由et-1引起的離體大鼠主動脈條的收縮并呈劑量依賴性，并且能夠拮抗et-1導(dǎo)致的大鼠血壓上升的幅度，因此紅背絲綢在廣西有解蛇毒“圣藥”之美譽。紅背絲綢主要分布于廣西、廣東、江西、福建、貴州、云南、湖南等地，常見于山谷溪邊林中、林緣或山坡中。由于紅背絲綢生長境地的特殊性，生長緩慢以及被過度采挖，其野生資源銳減。

鑒于目前國內(nèi)對中藥紅背絲綢的人工繁育未取得突破性進展，本發(fā)明選擇紅背絲綢帶節(jié)莖段為外植體，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)以及移栽等步驟，實現(xiàn)了中藥紅背絲綢的組培快繁。本發(fā)明具有操作性強、成本低、工藝簡單等特點，可直接用于紅背絲綢種苗的工廠化生產(chǎn)，對于促進紅背絲綢產(chǎn)業(yè)化開發(fā)具有重要的現(xiàn)實意義。

目前，國內(nèi)外尚未有紅背絲綢組織培養(yǎng)技術(shù)的報道，也未有紅背絲綢組培快繁專利的申請。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種中藥紅背絲綢的組培快繁方法，本發(fā)明選擇紅背絲綢帶節(jié)莖段為外植體，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)以及移栽等步驟，其誘導(dǎo)率達到了88％以上，成活率達到了94％以上，實現(xiàn)了中藥紅背絲綢的組培快繁，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：一種中藥紅背絲綢的組培快繁方法，包括依次進行的如下步驟：獲取紅背絲綢的外植體、外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、移栽；

所述的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)操作的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基、2.0～4.0mg/l6-ba、0.5～1.0mg/lnaa、20～30g/l蔗糖、3.5～4.0g/l瓊脂、60～100ml/l椰子汁、0.1～0.3g/l活性炭，外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基ph為5.4～5.8。

在上述的中藥紅背絲綢的組培快繁方法中，所述的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)操作的方法為：將采集得到的作為外植體的紅背絲綢的帶節(jié)藤莖消毒后剪切成1.5～2.5cm的帶節(jié)藤莖并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于25～28℃進行全暗培養(yǎng)45～50天即可誘導(dǎo)形成不定芽。

在上述的中藥紅背絲綢的組培快繁方法中，所述的繼代培養(yǎng)操作所用到的繼代培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基、1.0～2.0mg/l6-ba、0.1～0.3mg/lnaa、20～30g/l蔗糖、3.5～4.0g/l瓊脂、0.1～0.5g/l活性炭，繼代培養(yǎng)基ph為5.4～5.8。

在上述的中藥紅背絲綢的組培快繁方法中，所述的繼代培養(yǎng)操作具體為：將外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)操作得到的不定芽切成長1～1.5cm的莖段并接種到繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)25～30天即可實現(xiàn)不定芽的繼代。

在上述的中藥紅背絲綢的組培快繁方法中，所述的生根培養(yǎng)操作所用到的生根培養(yǎng)基包括：ms、0.5～1.0mg/labt-6、2.0～4.0mg/lnaa、15～20g/l蔗糖、3.0～4.0g/l瓊脂、0.1～0.3g/l活性炭，生根培養(yǎng)基ph為5.4～5.8。

在上述的中藥紅背絲綢的組培快繁方法中，所述的生根培養(yǎng)操作的方法為：從基部切取所述的繼代培養(yǎng)操作得到的長1.5～2.0cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)25～30天即能實現(xiàn)試管苗的生根。

在上述的中藥紅背絲綢的組培快繁方法中，所述的移栽操作的具體方法為：將經(jīng)生根培養(yǎng)操作得到的根系生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗1～3天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、樹皮混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗。

在上述的中藥紅背絲綢的組培快繁方法中，繼代培養(yǎng)操作、生根培養(yǎng)操中培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度為25～28℃，光照強度為2500～3000lx，光照時間為10～12小時/天。

有益效果：

本發(fā)明利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)實現(xiàn)了中藥紅背絲綢的組培快繁，本發(fā)明具有操作性強、成本低、工藝簡單等特點，可直接用于紅背絲綢種苗的工廠化生產(chǎn)。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的詳細說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。

實施例一

(1)外植體采集：在野外選取生長健壯、無明顯病害的苦郞藤植株中上部、向陽充實的帶節(jié)藤莖為外植體，采集后立即進行保水保濕處理并及時帶回實驗室。

(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)：當步驟(1)采集回實驗室外植體先在自來水下沖洗過夜，置于超凈工作臺中于75％的乙醇溶液中消毒5秒鐘，無菌水沖洗5次后用無菌濾紙吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒15分鐘，無菌水沖洗5次后用無菌濾紙吸干水分后切成1.5～2.5cm左右的帶節(jié)藤莖并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于25℃進行全暗培養(yǎng)45天即可誘導(dǎo)形成不定芽，誘導(dǎo)率為90.1％，污率低于25％。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+4.0mg/l6-ba+1.0mg/lnaa+20g/l蔗糖+3.5g/l瓊脂+60ml/l椰子汁+0.1g/l活性炭，ph為5.4。

(3)繼代培養(yǎng)：將步驟(2)誘導(dǎo)得到的不定芽切成長約1～1.5cm的莖段并接種到繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天即可實現(xiàn)不定芽的繼代，增殖系數(shù)達到6倍。所述的繼代培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+2.0mg/l6-ba+0.3mg/lnaa+20～30g/l蔗糖+3.5g/l瓊脂+0.1g/l活性炭，ph為5.4。

(4)生根培養(yǎng)：從基部切取步驟(3)繼代得到的長約1.5～2.0cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天即能實現(xiàn)試管苗的生根，生根率達到100％。所述的生根培養(yǎng)基為：ms+1.0mg/labt-6(生根粉)+4.0mg/lnaa+15g/l蔗糖+3.0g/l瓊脂+0.1g/l活性炭，ph為5.4。

(5)移栽：將步驟(4)根系生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗1天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、樹皮混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗，移栽30天后成活率達到95.6％。

上述步驟(3)～(4)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25℃，光照強度為2000lx，光照時間為10小時/天。

實施例二

(1)外植體采集：在野外選取生長健壯、無明顯病害的苦郞藤植株中上部、向陽充實的帶節(jié)藤莖為外植體，采集后立即進行保水保濕處理并及時帶回實驗室。

(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)：當步驟(1)采集回實驗室外植體先在自來水下沖洗過夜，置于超凈工作臺中于75％的乙醇溶液中消毒7秒鐘，無菌水沖洗6次后用無菌濾紙吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒17分鐘，無菌水沖洗6次后用無菌濾紙吸干水分后切成1.5～2.5cm左右的帶節(jié)藤莖并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于27℃進行全暗培養(yǎng)47天即可誘導(dǎo)形成不定芽，誘導(dǎo)率為94.7％，污染率低于20％。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+3.0mg/l6-ba+0.8mg/lnaa+25g/l蔗糖+3.8g/l瓊脂+80ml/l椰子汁+0.2g/l活性炭，ph為5.6。

(3)繼代培養(yǎng)：將步驟(2)誘導(dǎo)得到的不定芽切成長約1～1.5cm的莖段并接種到繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)27天即可實現(xiàn)不定芽的繼代，增殖系數(shù)達到5倍。所述的繼代培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+1.5mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+25g/l蔗糖+3.8g/l瓊脂+0.3g/l活性炭，ph為5.6。

(4)生根培養(yǎng)：從基部切取步驟(3)繼代得到的長約1.5～2.0cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)28天即能實現(xiàn)試管苗的生根，生根率為96％。所述的生根培養(yǎng)基為：ms+0.7mg/labt-6(生根粉)+3.0mg/lnaa+17g/l蔗糖+3.5g/l瓊脂+0.2g/l活性炭，ph為5.6。

(5)移栽：將步驟(4)根系生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗2天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、樹皮混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗，移栽30天后成活率在95％以上。

上述步驟(3)～(4)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為27℃，光照強度為2300lx，光照時間為11小時/天。

實施例三

(1)外植體采集：在野外選取生長健壯、無明顯病害的苦郞藤植株中上部、向陽充實的帶節(jié)藤莖為外植體，采集后立即進行保水保濕處理并及時帶回實驗室。

(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)：當步驟(1)采集回實驗室外植體先在自來水下沖洗過夜，置于超凈工作臺中于75％的乙醇溶液中消毒10秒鐘，無菌水沖洗7次后用無菌濾紙吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒20分鐘，無菌水沖洗7次后用無菌濾紙吸干水分后切成1.5～2.5cm左右的帶節(jié)藤莖并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于28℃進行全暗培養(yǎng)50天即可誘導(dǎo)形成不定芽，誘導(dǎo)率為88％，污染率低于15％。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+4.0g/l瓊脂+100ml/l椰子汁+0.3g/l活性炭，ph為5.8。

(3)繼代培養(yǎng)：將步驟(2)誘導(dǎo)得到的不定芽切成長約1～1.5cm的莖段并接種到繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天即可實現(xiàn)不定芽的繼代，增殖系數(shù)達到4.1倍。所述的繼代培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+1.0mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+30g/l蔗糖+4.0g/l瓊脂+0.5g/l活性炭，ph為5.8。

(4)生根培養(yǎng)：從基部切取步驟(3)繼代得到的長約1.5～2.0cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天即能實現(xiàn)試管苗的生根，生根率為89％。所述的生根培養(yǎng)基為：ms+0.5mg/labt-6(生根粉)+2.0mg/lnaa+20g/l蔗糖+4.0g/l瓊脂+0.3g/l活性炭，ph為5.8。

(5)移栽：將步驟(4)根系生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗3天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、樹皮混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗，移栽30天后成活率為94％。

上述步驟(3)～(4)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為28℃，光照強度為2500lx，光照時間為12小時/天。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。