本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及芥子酸在種子萌發(fā)、根生長和幼苗發(fā)育方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

芥子酸及其衍生物是一類重要的苯丙烷類代謝中間物質(zhì)，廣泛參與調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育、生殖和應(yīng)答各種逆境脅迫等。在苯丙烷類代謝途徑中，芥子酸是紫丁香基木質(zhì)素（syringyllignin）生物合成的一個(gè)中間產(chǎn)物，也是葉和果實(shí)中形成芥子酸酯（sinapateester）可溶性代謝物質(zhì)的前體（已有的研究表明，芥子酸酯有三種類型：即芥子?；咸烟牵╯inapoylglucose）、芥子酰基蘋果酸（sinapoylmalate）和芥子堿（sinapoylcholine），三種芥子酸酯代謝模式如圖1所示）。因此，芥子酸是研究苯丙烷類代謝參與調(diào)控植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)的一個(gè)重要代謝物質(zhì)。

脫落酸（abscisicacid，aba）是一種具有倍半萜結(jié)構(gòu)的植物激素，是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和生理代謝過程的主要激素之一，主要參與植物胚的成熟、種子休眠、萌發(fā)、幼苗生長、調(diào)控植物根的形態(tài)建成，氣孔運(yùn)動(dòng)和從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變過程等。同時(shí)，aba在植物響應(yīng)生物和非生物脅迫過程中也有著重要的調(diào)節(jié)作用。目前有較多關(guān)于aba信號通路的綜述報(bào)道，對aba的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與種子萌發(fā)、氣孔運(yùn)動(dòng)等生命活動(dòng)的關(guān)系進(jìn)行了闡述，但由于aba參與了許多的植物生理與發(fā)育過程，使得aba信號網(wǎng)絡(luò)的組分十分復(fù)雜，所以aba信號通路的研究仍然是當(dāng)前植物激素的研究熱點(diǎn)之一。

盡管芥子酸及其衍生物在植物生長發(fā)育，以及抵御外界環(huán)境脅迫多有報(bào)道，但芥子酸的代謝是否與植物激素aba有關(guān)，其是否參與aba調(diào)控的植物生長與發(fā)育的過程，目前仍不清楚。因此，研究芥子酸代謝與aba代謝及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)系，對于揭示芥子酸調(diào)控植物生長發(fā)育以及對逆境脅迫的響應(yīng)的分子機(jī)制，具有重要的生物學(xué)意義，同時(shí)，也可為生產(chǎn)中利用基因工程技術(shù)改善種子營養(yǎng)物質(zhì)的積累，調(diào)節(jié)種子萌發(fā)與植物生長發(fā)育提供的理論依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

通過對芥子酸與aba間作用關(guān)系的初步研究，本申請目的在于提供芥子酸在種子萌發(fā)和植物生長發(fā)育方面的應(yīng)用，從而為培育種子、種子改良和促進(jìn)植物生長方面奠定理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。

本申請所采取的技術(shù)方案詳述如下。

芥子酸在種子萌發(fā)、根生長和幼苗生長方面的應(yīng)用，低濃度的芥子酸（0.1~0.5mm）能誘導(dǎo)芥子酰膽堿（sinapolcholine）的累積，促進(jìn)芥子酸酯類的合成（包括芥子酰葡萄糖（sinapoylglucose）和芥子酰蘋果酸（sinapoylmalate）的合成），促進(jìn)種子萌發(fā)、側(cè)根發(fā)生和幼苗生長，誘導(dǎo)主根彎曲并抑制其生長；而高濃度的芥子酸（大于0.5mm）則抑制種子萌發(fā)和主根生長。

進(jìn)一步研究表明，芥子酸誘導(dǎo)脫落酸葡糖酯（aba-ge）轉(zhuǎn)移酶代謝相關(guān)基因（ugt71c5、ugt71b6、ugt71b7、ugt71b8）的表達(dá)；能特異性的促進(jìn)脫落酸葡糖酯（abscisicacid-glucoseester,aba-ge）的積累，抑制擬南芥aba的合成，降低植物體內(nèi)脫落酸的含量；而在芥子酸酯合成的關(guān)鍵酶，阿魏酸羥化酶（ferulicacidhydroxylase1）突變體fah1（無法合成芥子酸酯）中，aba含量較高，而脫落酸葡糖酯含量較低，這一結(jié)果表明，芥子酸參與調(diào)節(jié)了擬南芥種子中aba的代謝過程。

而在芥子酸處理后，低濃度的芥子酸（0.5mm）能抑制aba代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)突變體aba2-1和abi3-1的種子萌發(fā)，在這些突變體中，芥子酰膽堿的含量增高；具體而言：

芥子酸代謝突變體（aba2-1和abi3-1）中aba抑制種子萌發(fā)的效應(yīng)發(fā)生了變化，表現(xiàn)為在sng1-1中種子萌發(fā)率較野生型高，而在sng2和brt1-1中，萌發(fā)率較野生型低；

而芥子酰葡萄糖膽堿轉(zhuǎn)移酶（sinapoylglucose:cholinesinapoyltransferas,sct）的表達(dá)水平在aba2-1和abi3-1明顯較野生型高；同時(shí)，sct酶活性、芥子酰膽堿和種子中膽堿含量較野生型高。

芥子酸在種子萌發(fā)、根生長和幼苗生長中的應(yīng)用，可提高種子的萌發(fā)率，促進(jìn)幼苗的生長，具體而言，在播種前，以低濃度（0.1~0.5mm）的芥子酸浸泡作物種子，能提高種子的萌發(fā)率，從而節(jié)約生產(chǎn)成本；另一方面，利用基因工程技術(shù)對芥子酸和脫落酸相關(guān)基因的表達(dá)或者抑制，可調(diào)整種子萌發(fā)率。

本申請中，對芥子酸合成代謝相關(guān)基因brt1（at3g21560）、sng1（at2g22990）和sng2（at5g09640）以及aba代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因aba2和abi3進(jìn)行了初步研究，通過對植物中芥子酰膽堿、芥子酰葡萄糖、芥子酰蘋果酸、脫落酸和脫落酸葡糖酯含量的分析及相關(guān)基因表達(dá)的檢測，初步揭示了芥子酸和脫落酸協(xié)同調(diào)控種子萌發(fā)與幼苗生長的機(jī)制，并利用芥子酸代謝相關(guān)突變體和脫落酸代謝與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)突變體為材料，以檢測種子萌發(fā)率的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一理論。

總體而言，本申請通過對芥子酸與脫落酸的作用關(guān)系、作用機(jī)制的初步研究，創(chuàng)新性地提出芥子酸與脫落酸存在協(xié)同作用，進(jìn)而調(diào)控植物種子萌發(fā)及幼苗生長的理論。利用該理論，可為提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中植物種子的萌發(fā)率、促進(jìn)幼苗生長奠定良好的理論基礎(chǔ)和應(yīng)用基礎(chǔ)，并進(jìn)一步可為基因工程對種子的改良指明方向。

附圖說明

圖1為芥子酸酯代謝的模式圖；f5h為阿魏酸羥化酶（ferulate5-hydroxylase），

sgt為芥子酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（udp-glucose:sinapateglucosyltransferase），

sct為芥子酰葡萄糖膽堿轉(zhuǎn)移酶（sinapoylglucose:cholinesinapoyltransferase），

sce為芥子堿酯酶（sinapineesterase），

smt為芥子酰葡萄糖蘋果酸轉(zhuǎn)移酶（sinapoylglucose:malatesinapoyltransferase）；

擬南芥突變體名稱如下，brt：brighttrichomes（明亮的毛狀體）；sng：sinapoylglucoseaccumulator（芥子酰葡萄糖積累）；fah，ferulatehydroxylase（阿魏酸羥化酶）；

圖2為低濃度的芥子酸能促進(jìn)擬南芥種子萌發(fā)和早期幼苗生長；a為統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率數(shù)據(jù)；b為萌發(fā)的種子的照片；c和d為正常條件/芥子酸處理?xiàng)l件下生長的幼苗的照片；e為根長度的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；f為測量植物的鮮重；g為不同生長條件下植物體內(nèi)芥子酸膽堿的含量；h為測量不同生長條件下芥子酸酯類的含量；圖中部分橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)含義如下：germinationrate，萌發(fā)率；mock，對照；sinapicacid，芥子酸；rootlength，根長度；freshweight(g/plants)，鮮重（克/株植物）；d，天；sinapoylcholine，芥子酰膽堿；sinapicacidesters，芥子酸酯類；sinapoylglucose，芥子酰葡萄糖；sinapoylmalate，芥子酰蘋果酸；

圖3為不同濃度的芥子酸對擬南芥幼苗生長情況的影響；a為在正常條件下生長5天的幼苗，移栽至含不同濃度的芥子酸的培養(yǎng)基中，5天后拍照片；b為統(tǒng)計(jì)主根的生長長度；c為統(tǒng)計(jì)側(cè)根的數(shù)目；圖中部分橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)含義如下：rootlength(cm)，主根長度（厘米）；sinapicacidconcentration(mm)，芥子酸濃度（毫摩爾）；lateralrootnumberrate(%)，側(cè)根數(shù)目百分比；lateralrootnumber，側(cè)根數(shù)目；

圖4為測量擬南芥種子中aba和脫落酸葡糖酯的含量；a為脫落酸葡糖酯代謝相關(guān)基因的表達(dá)量分析；b和c分別為測量種子中aba和脫落酸葡糖酯的含量；d為芥子酸特異性降低了aba抑制種子萌發(fā)的效應(yīng)；圖中部分橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)含義如下：mock為對照組實(shí)驗(yàn)；relativeexpression，相對表達(dá)量；contentofaba/aba-ge(pmol/gdw)，aba和aba葡糖酯的含量（干重皮摩爾/克）；germinationrate，萌發(fā)率；sinapicacid，芥子酸；ferulicacid，阿魏酸；cinnamicacid，肉桂酸；p-coumaricacid，香豆酸；caffeicacid，咖啡酸；

圖5為aba影響芥子酸代謝相關(guān)突變體的種子萌發(fā)；a為sng2、sng1-1和brt1-1的幼苗照片；b為sng2、sng1-1和brt1-1的種子萌發(fā)率的統(tǒng)計(jì)；c為對sng2、sng1-1和brt1-1的子葉變綠數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)；d為測定sng2、sng1-1和brt1-1的體內(nèi)芥子酸膽堿含量；圖中部分橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)含義如下：germinationrate，萌發(fā)率；daysafterimbibition，種子吸水后的天數(shù)；greencotyledons(%)，綠色子葉的百分比；sinapolcholine(μmolg-1)，芥子酰膽堿的含量（微摩爾/克）；

圖6為檢測芥子酸對aba相關(guān)突變體aba2和abi3的種子萌發(fā)的影響。a為種子萌發(fā)率的統(tǒng)計(jì)；b為檢測sct基因表達(dá)量；c為對種子中sct活性的分析；d為植物中芥子酸膽堿含量的分析；e為檢測sce基因的表達(dá)量；f為測量植物中芥子酸膽堿的含量；圖中部分橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)含義如下：germinationrate，萌發(fā)率；relativeexpression，相對表達(dá)量；sctactivity，芥子酰葡萄糖膽堿轉(zhuǎn)移酶活性；sinapolcholine(μmolg-1)，芥子酰膽堿含量（微摩爾/克）；choline(μmolmg-1)，膽堿含量（微摩爾/毫克）。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本申請做進(jìn)一步的解釋說明，在介紹具體實(shí)施例前，就下述實(shí)施例中部分生物材料、實(shí)驗(yàn)試劑等問題簡要說明如下。

生物材料：

擬南芥野生型、突變體brt1-1（at3g21560）、sng1-1（at2g22990）和sng2（at5g09640）由美國普渡大學(xué)clintchapple教授提供；

aba2-1（at1g52340）由發(fā)明人前期通過紅外成像系統(tǒng)篩選獲得；

fah1-2（at4g36220）和abi3-1（at3g24650）從擬南芥資源中心（abrc，ohiostateuniversity）獲得；

引物合成及測序，由北京金維智公司提供完成。

實(shí)驗(yàn)試劑：

芥子酸，西格瑪，美國；

rna提取試劑盒，天根，北京；

revertraaceqpcrrt試劑盒，東洋紡公司，日本；

pcr反應(yīng)使用高效taq酶easytaqdnapolymerase，全式金，中國；

實(shí)時(shí)熒光定量rcp反應(yīng)試劑盒，普洛麥格公司，美國；

膽堿分析試劑盒，亞諾法，美國

aba購自takara，日本。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：

紫外-可見光分光光度計(jì)nanodrop2000c，賽默飛公司，美國；

高效液相色譜儀agilent1260，安捷倫，美國；

質(zhì)譜儀4000qtrap，羅克韋爾，美國；

超純水儀b1209907，密理博，美國；

實(shí)時(shí)定量pcr儀mx3005p，安捷倫，美國。

實(shí)施例1

在本實(shí)施例中，以擬南芥為例，發(fā)明人首先證明了芥子酸能促進(jìn)種子的萌發(fā)和幼苗的生長，相關(guān)實(shí)驗(yàn)過程簡要介紹如下。

將擬南芥野生型（wt）種子播種于0.6%瓊脂的ms培養(yǎng)基，以不添加芥子酸的培養(yǎng)基作為空白對照，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的芥子酸（sinapicacid）（濃度分別為0.1、0.5、1和2mm）作為實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行培育。

具體培育過程為：4℃春化3天，然后放置于光照培養(yǎng)間，培養(yǎng)室參數(shù)為：光/暗周期為16/8h，溫度22℃，相對濕度為70%；2天后統(tǒng)計(jì)種子的萌發(fā)率。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2a所示，從中可以看出，在低濃度芥子酸（0.1~1mm）處理?xiàng)l件下，種子的萌發(fā)率較高，尤其是0.5mm的芥子酸處理后，促進(jìn)種子萌發(fā)的效應(yīng)最高。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用0.5mm的芥子酸處理種子材料。

進(jìn)一步對種子培育，對部分植物形態(tài)特征數(shù)據(jù)及生理指標(biāo)進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖2b~g所示，相關(guān)結(jié)果簡要解釋如下。

圖2b中，為部分種子萌發(fā)狀態(tài)圖，從圖2b中可以看出，0.5mm的芥子酸處理后，可明顯促進(jìn)種子萌發(fā)；

圖2c和2d分別為含0.5mm的芥子酸的ms培養(yǎng)基中種子生長8天和20天后幼苗的生長狀態(tài)圖，從圖中可以明顯看出，芥子酸能促進(jìn)幼苗生長；

圖2e和圖2f分別為含0.5mm的芥子酸的ms培養(yǎng)基上幼苗的根長和植物鮮重統(tǒng)計(jì)結(jié)果，結(jié)果同樣表明，芥子酸能促進(jìn)擬南芥根系生長，并可明顯提高植物鮮重；

圖2g為0.5mm的芥子酸處理種子兩天后，利用高效液相色譜技術(shù)對種子中芥子酸膽堿含量的檢測分析，結(jié)果表明，芥子酸誘導(dǎo)條件下，種子內(nèi)的芥子酸膽堿在種子內(nèi)得到了明顯積累；

圖2h為含0.5mm的芥子酸培養(yǎng)中，種子萌發(fā)生長10天后，植物體內(nèi)芥子酸酯類含量測定結(jié)果，結(jié)果表明，芥子酸能誘導(dǎo)植物中芥子酸酯類的合成和富集。

對上述結(jié)果可以匯總?cè)缦拢?/p>

低濃度芥子酸（0.1~1mm）處理后，可明顯促進(jìn)種子萌發(fā)，而高濃度（2mm）則較為明顯地抑制了種子的萌發(fā)；

低濃度芥子酸（0.1~1mm，優(yōu)選0.5mm）處理時(shí)，可明顯促進(jìn)幼苗生長，在形態(tài)指標(biāo)上，表現(xiàn)為根系生長較長，植物鮮重增加較為明顯；而通過生理指標(biāo)可以發(fā)現(xiàn)，芥子酸誘導(dǎo)條件下，種子內(nèi)的芥子酸膽堿在種子內(nèi)得到了積累，而在植物幼苗體內(nèi)，芥子酸誘導(dǎo)了植物體內(nèi)芥子酸酯類的合成和富集。

為進(jìn)一步判定芥子酸對于種子萌發(fā)率是否具有特異性，發(fā)明人以其他有機(jī)酸作為對照，進(jìn)行了對照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，芥子酸能夠特異性提高種子的萌發(fā)率，相關(guān)實(shí)驗(yàn)過程簡介如下。

將擬南芥種子分別在0.5mm的芥子酸、阿魏酸、肉桂酸、香豆酸和咖啡酸中暗處理36h，然后播種于ms基本培養(yǎng)基中，1~3天后，統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率。接結(jié)果表明，芥子酸處理后種子在生長1~3天過程中的萌發(fā)率明顯高于其他有機(jī)酸處理過的種子，這表明芥子酸提高種子萌發(fā)率的效應(yīng)具有特異性。

需要解釋的是，采用高效液相色譜法測定植物體內(nèi)芥子酸酯類物質(zhì)含量時(shí)，具體可參考如下步驟進(jìn)行操作：

（1）將預(yù)處理的30mg植物材料轉(zhuǎn)移至組織勻漿器中，向勻漿器中加入1ml的提取液a（70%甲醇，50mm白楊素），將種子研磨至勻漿狀態(tài)；

（2）將勻漿轉(zhuǎn)移到2ml離心管中，再用1ml的提取液a沖洗勻漿器，合并兩次的提取液；

（3）4℃真空抽提1h，然后于4℃、12000rpm離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至5ml離心管中，沉淀用500μl提取液b（70%甲醇）在4℃抽提1h；

（4）4℃、12000rpm離心10min，合并上清液；

（5）用0.22μm孔徑的濾膜過濾上清液，收集到另一個(gè)ep管中；

（6）用流動(dòng)相b或純甲醇以0.4ml/min的速率沖洗柱子，等待基線及柱子壓強(qiáng)達(dá)到穩(wěn)定值；

取1.5ml樣品放入進(jìn)樣瓶中，并放入液相色譜儀的進(jìn)樣器中，按下列參數(shù)設(shè)置液相色譜儀程序：

柱溫箱，25℃；檢測器波長為220~400nm；流速為0.8ml/min；進(jìn)樣量為20μl；進(jìn)樣次數(shù)：2次；梯度洗脫程序設(shè)置參數(shù)如下：

；

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：

用70%的甲醇分別配置1μm、10μm和100μm的芥子酸溶液，并按下表設(shè)置程序和進(jìn)樣量做關(guān)于芥子酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線：

；

以芥子酸含量為x值，以上述洗脫程序下所得峰的面積為y值做出關(guān)于芥子酸含量相對于芥子酸峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線；最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得芥子酸酯類物質(zhì)含量數(shù)據(jù)。

對種子中芥子酸膽堿含量測定，可具體參考如下步驟：

（1）稱取萌發(fā)的種子，轉(zhuǎn)移至組織勻漿器中，然后向組織勻漿器中加入4℃預(yù)冷的磷酸緩沖液（pbs緩沖液，8.5g的nacl、5.54g的na2hpo4?12h2o和1g的nah2po4，用雙蒸水定容積至1l）750μl，充分研磨成勻漿，將勻漿轉(zhuǎn)移至2ml離心管中，組織勻漿器用750μl的pbs緩沖液沖洗并轉(zhuǎn)移溶液至含勻漿的離心管；

（2）4℃真空抽提1h，然后于4℃、14000rpm離心5min，取出漂于上層的脂類物質(zhì)，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，沉淀用500μl的pbs緩沖液混勻，再次于4℃真空抽提1h；

（3）合并兩次的提取液，并用濾膜濾去雜質(zhì)，過濾后的溶液低溫保存待測；

（4）將試劑盒中所有試劑置于冰上解凍，在enzymemix(dried)中加入120μlassaybuffer，混勻；

（5）取12μl、2mm的膽堿標(biāo)準(zhǔn)品加入228μl的無菌雙蒸水配置成濃度為100μl的母液，并按下表稀釋成4個(gè)梯度：

；

（6）將標(biāo)準(zhǔn)品和待檢測樣品分別轉(zhuǎn)移至酶標(biāo)板中，每個(gè)樣品室加入20μl樣品，設(shè)置三個(gè)重復(fù)樣；

（7）每個(gè)樣品室加入80μl反應(yīng)液（反應(yīng)液按85μlassaybuffer，1μlenzymemix和1μldyereagent的體積比配置），室溫孵育30min左右，反應(yīng)液出現(xiàn)顏色變化；

（8）將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，檢測并記錄光波長570nm下樣品的吸光值；

（9）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測樣品中膽堿的含量。

實(shí)施例2

本實(shí)施例中，以擬南芥幼苗為例，發(fā)明人主要對芥子酸影響擬南芥幼苗根的生長進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，芥子酸能抑制主根生長，使主根喪失向地性生長，表現(xiàn)為根卷曲生長（圖3a和b），而側(cè)根數(shù)目增多（圖3c）。具體實(shí)驗(yàn)情況如下。

將在正常ms培養(yǎng)基中生長5天的幼苗，移栽至含有不同濃度的芥子酸的培養(yǎng)基中，0為添加適量二甲亞砜（dmso）代替芥子酸，5天后拍照片如圖3a所示，主根的伸長方向發(fā)生變化，表現(xiàn)為卷曲生長，表明其喪失了向地性生長的功能。同時(shí)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，芥子酸能夠抑制擬南芥主根生長（圖3b），但是側(cè)根數(shù)目明顯增多（圖3c）。

實(shí)施例3

本實(shí)施例中，以擬南芥為例，發(fā)明人主要對芥子酸與脫落酸代謝間關(guān)系進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明：芥子酸能調(diào)節(jié)脫落酸和脫落酸葡糖酯的代謝，相關(guān)實(shí)驗(yàn)簡要介紹如下。

將擬南芥種子以0.5mm的芥子酸或二甲亞砜（dmso，0.5mm，陽性對照）在黑暗條件下浸泡36h后，播種于正常的ms培養(yǎng)基上，培養(yǎng)1天后（培養(yǎng)條件參考實(shí)施例1），按照現(xiàn)有技術(shù)，提取rna，以actin1基因作為內(nèi)參，對芥子酸合成代謝基因brt1及與脫落酸葡糖酯（aba-ge）轉(zhuǎn)移酶代謝相關(guān)基因（ugt71c5、ugt71b6、ugt71b7、ugt71b8）的表達(dá)情況進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr分析。

熒光定量pcr時(shí)，引物序列設(shè)計(jì)（如seqidno.1~12所示）如下：

brt1-f：5'-ggtaaaggctatctccggtatg-3'，

brt1-r：5'-gtggtcggaggatggttaag-3'；

ugt71c5-f：5'-atccgggtctagcttcgg-3'，

ugt71c5-r：5'-attccacggcccattgtt-3'；

ugt71b6-f：5'-tcgagatggtggaagagc-3'，

ugt71b6-r：5'-gtttccgaccaagcaata-3'；

ugt71b7-f：5'-aagtcggtgcttccgattac-3'，

ugt71b7-r：5'-gtcatctcgatggttggttga-3'；

ugt71b8-f：5'-cggtgatagacgtggctaatg-3'，

ugt71b8-r：5'-cactgacactgtactccttcttatc-3'；

actin1-f：5'-ggtaacattgtgctcagtggtgg-3'，

actin1-r：5'-aacgaccttaatcttcatgctgc-3'；

20μl擴(kuò)增反應(yīng)體系設(shè)計(jì)如下：

cdna，1μl；

2×sybrgreenpcrmastermix（普洛麥格公司，美國），10μl；

f引物，0.2μl（10μm）；

r引物，0.2μl（10μm）；

pcr程序?yàn)椋?5℃變性2min；95℃變性5s，60℃復(fù)性延伸45s，40個(gè)循環(huán)；40循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性用溶解曲線分析檢測。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4a所示，從圖中可以看出，芥子酸能明顯誘導(dǎo)brt1和脫落酸葡糖酯轉(zhuǎn)移酶代謝相關(guān)基因的表達(dá)。

進(jìn)一步地，參考上述種子處理過程，檢測表明，芥子酸處理后能抑制種子中aba的積累，誘導(dǎo)脫落酸葡糖酯的積累；

而在阿魏酸羥化酶突變體fah1-1（無法合成芥子酸酯）中，aba的含量較野生型高，脫落酸葡糖酯的含量較野生型低（測定結(jié)果如圖4b和圖4c所示）。這些結(jié)果表明，芥子酸參與調(diào)節(jié)了擬南芥種子中aba的代謝過程。另外，以不同有機(jī)酸同時(shí)處理擬南芥種子，僅芥子酸能促進(jìn)種子萌發(fā)（圖4d），表明在促進(jìn)種子萌發(fā)方面的特異性。

需要解釋的是，aba與aba-ge的測量方法參照文獻(xiàn)（lópez-carbonelletal.，2009,plantphysiolbiochem.47(4):256-61）進(jìn)行，具體如下。

含量測定方法：

（1）材料中aba的提取：

①稱取50mg種子材料，加入1ml樣品提取液（nacl137mm，kcl2.7mm，na2hpo410mm，kh2po42mm，ph7.4)；低溫條件下用組織勻漿器研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入2mlep管中，再用1ml樣品提取液將組織勻漿器沖洗干凈，所得溶液一并轉(zhuǎn)入ep管中，搖勻后放置在4℃冰箱中；

②4℃下孵育4h，12000rpm離心8min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的ep管中；所得沉淀中加入1ml樣品提取液，搖勻，置于4℃下再抽提1h，離心后合并上清液；

③上清液用0.22μm濾膜過濾，除去離心后的漂浮物；

④將過濾后的樣品轉(zhuǎn)移至新的離心管中，真空濃縮或用氮?dú)獯蹈?，除去提取液中的甲醇，用樣品稀釋液?00mlpbs中加入0.5mltween-20，0.5g明膠）定容到2ml；

（2）樣品測定：

①競爭：配制系列標(biāo)樣（分別配成100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、1.5625ng/ml和0ng/ml8個(gè)濃度），將系列標(biāo)樣加入酶標(biāo)板前兩行，每個(gè)濃度重復(fù)2次，每個(gè)樣品室50μl，其余的樣品室加入待測樣品；

同時(shí)，取5ml樣品稀釋液，按照稀釋倍數(shù)加入一定量的抗體，混勻，在加標(biāo)準(zhǔn)樣及待測樣的樣品室中加入50μl；將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀進(jìn)行孵育（37℃，30min）；

②洗板：吸出反應(yīng)液，加入洗滌液洗滌4次，其中第一次洗滌時(shí)加入的洗滌液（在1lpbs中加入1mltween-20）要立即甩掉；

③加二抗：在10ml樣品稀釋液中按照稀釋倍數(shù)加入酶標(biāo)二抗，混勻后在酶標(biāo)板上每樣品室加入100μl稀釋后的二抗，將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中內(nèi)孵育（37℃，30min）；

④洗板：將反應(yīng)液甩干并在報(bào)紙上拍干凈殘留液體；加入洗滌液洗滌4次，其中第一次洗滌時(shí)加入的洗滌液要立即甩掉；

⑤加底物顯色：稱取20mg鄰苯二胺（opd）溶解于10ml底物緩沖液（5.1gc6h8o7，18.43gna2hpo4，1mltween-20，雙蒸水定容積至1l）中，完全溶解后加入4μl、30%的h2o2混勻，在酶標(biāo)板每個(gè)樣品室中加入100μl底物，然后放入酶標(biāo)儀內(nèi)，顯色15min，每樣品室加入50μl的2m的硫酸終止反應(yīng)；

⑥測量：以酶標(biāo)儀依次測定標(biāo)準(zhǔn)物和各樣品在490nm處的吸光值；

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的數(shù)據(jù)，利用logit曲線作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中aba的含量。

含量測量方法如下：

取種子材料0.05g，將研缽用液氮預(yù)冷，加入700μl提取液（丙酮:水:乙酸按照體積比80:19:1），充分研磨種子，將研磨液收集到離心管中，15000rpm、4℃離心10min；

收集上清液，再加入700μl提取液，將兩次上清混合到一起并用氮?dú)獯蹈桑?/p>

加入200μl的復(fù)溶液（水:乙腈:乙酸按照體積比9:1:0.005），充分混勻，旋渦，15000rpm、4℃離心10min；最后用0.22μm的濾膜過濾；

取濾液，以高效液相色譜儀進(jìn)行檢測。

實(shí)施例4

在實(shí)施例3基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步驗(yàn)證芥子酸與aba代謝間關(guān)系，發(fā)明人檢測了芥子酸合成代謝相關(guān)基因brt1（at3g21560）、sng1（at2g22990）和sng2（at5g09640）突變體種子的萌發(fā)是否受aba的影響，從而判定芥子酸能否拮抗aba抑制種子的萌發(fā)效應(yīng)。相關(guān)實(shí)驗(yàn)過程簡要介紹如下。

將wt、brt1-1（brt1基因失活）、sng2（sng2基因失活）和sng1-1（sng1-1基因失活）的種子分別播種于ms培養(yǎng)基或者含有0.2μm的aba的培養(yǎng)基中（培養(yǎng)條件參考實(shí)施例1），培養(yǎng)條件參考實(shí)施例1，生長8天后觀察植株的生長表型。

從圖5a中可以看出，在含有aba的培養(yǎng)基中，wt受aba抑制生長的效應(yīng)較brt1-1、sng2和sng1-1相對較弱；換言之，在芥子酸合成缺陷植株或者說芥子酸缺失植株中，植株的生長不受aba的調(diào)節(jié)，或者說aba對于植株生長調(diào)節(jié)效果相對較差；

而在正常生長條件下（不受aba調(diào)控影響條件下），brt1-1、sng2和sng1-1突變體的種子萌發(fā)率低于wt，換言之，芥子酸合成受限情況下，種子發(fā)芽率也受到明顯影響。進(jìn)一步地分析表明，在sng1-1中，aba抑制種子萌發(fā)的效應(yīng)低于wt，而在brt1-1和sng2中，aba抑制種子萌發(fā)的效應(yīng)高于wt（圖5b）。

進(jìn)一步地，在含有aba的培養(yǎng)基（含量為0.2μm）中，wt的子葉變綠數(shù)目明顯高于brt1-1、sng2和sng1-1（圖5c）；而與wt相比較，在brt1-1、sng2和sng1-1中，芥子酰膽堿的積累量也發(fā)生了變化（圖5d）。

綜上結(jié)果可以認(rèn)為，芥子酸酯代謝關(guān)鍵基因的突變，使擬南芥對aba的敏感性發(fā)生了變化，表明aba可以抑制擬南芥種子萌發(fā)及幼苗的生長與芥子酸代謝相關(guān)。

實(shí)施例5

在實(shí)施例4基礎(chǔ)上，發(fā)明人進(jìn)一步以aba代謝突變體aba2-1（相當(dāng)于植物體內(nèi)不含aba）和aba信號傳導(dǎo)相關(guān)突變體abi3-1（相當(dāng)于雖然含有aba，但是aba信號傳導(dǎo)受影響）為例，對芥子酸與aba間協(xié)作關(guān)系進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

以0.5mm濃度芥子酸分別處理野生型（wt）、aba2-1突變體、abi3-1突變體擬南芥種子（處理過程及培育方式參考實(shí)施例3），統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)情況。

結(jié)果如圖6a所示，從圖中可以看出，低濃度的芥子酸（0.5mm）能促進(jìn)wt種子的萌發(fā)，而在aba代謝突變體aba2-1和aba信號傳導(dǎo)相關(guān)突變體abi3-1中，芥子酸抑制其種子萌發(fā)；換言之，芥子酸促進(jìn)種子萌發(fā)的效應(yīng)與aba含量及aba信號的傳導(dǎo)是相關(guān)的；

利用實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)，檢測芥子酸處理后擬南芥種子中芥子酰葡萄糖膽堿轉(zhuǎn)移酶（sct）基因的表達(dá)情況表明（以actin1為內(nèi)參基因），相對于wt，在aba2-1和abi3-1中，芥子酸誘導(dǎo)了sct基因大量表達(dá)（圖6b），而且，在aba2-1和abi3-1的種子中，sct活性明顯高于wt（圖6c）；而對芥子酸膽堿含量檢測表明，aba2-1和abi3-1突變體中芥子酸膽堿含量也高于wt（圖6d）；而sce基因的表達(dá)量高于wt（圖6e），芥子酸膽堿的含量高于wt（圖6f）。

熒光定量pcr時(shí)，引物序列設(shè)計(jì)如下：

actin1-f：5'-ggtaacattgtgctcagtggtgg-3'，

actin1-r：5'-aacgaccttaatcttcatgctgc-3'；

sct-f：5'-gctggctctggatactcttatg-3'，

sct-r：5'-gggtgtttcacaaaccaactc-3'；

sce-f：5'-ttaaccaccttcctcaatccgcct-3'，

sce-r：5'-cagttgcaccatacaccgcgaaat-3'；

熒光定量pcr及芥子酰膽堿含量的測量參見前述實(shí)施例；sct活性分析見參考文獻(xiàn)（vogtetal.,1993,archbiochembiophys.300:622-628）；膽堿含量的分析采用美國亞諾法公司的膽堿分析試劑盒，具體步驟見試劑盒說明書。

綜上結(jié)果可以認(rèn)為，芥子酸與aba相互協(xié)調(diào)，從而調(diào)節(jié)擬南芥種子的萌發(fā)與幼苗的生長。

sequencelisting

<110>河南大學(xué)

<120>芥子酸在種子萌發(fā)、根生長和幼苗發(fā)育方面的應(yīng)用

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