本發(fā)明涉及一種花生白絹病溫室苗期接種方法。

背景技術(shù)：

花生白絹病，又稱(chēng)白腳病，是由半知菌亞門(mén)無(wú)孢菌目齊整小菌核屬(sclerotiumrolfsiisacc.)引起的一種土傳維管束病害，花生白絹病在我國(guó)長(zhǎng)江流域以南的省份發(fā)生廣泛，在北方花生產(chǎn)區(qū)零星發(fā)生。近年來(lái)隨全球氣候的變暖，高水肥高密度種植模式下花生冠層郁閉的小環(huán)境導(dǎo)致白絹病在我國(guó)危害愈來(lái)愈嚴(yán)重，發(fā)生區(qū)域從南方蔓延到北方，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2004年山東臨沂發(fā)病面積達(dá)6萬(wàn)公頃，占全市播種面積的40％，重病田病株率達(dá)到67.3％。2007年河南鄭州東部重病田發(fā)病率達(dá)20％；同年該病害在遼寧興城首次大面積發(fā)生，一般地塊發(fā)病株率為10％左右，嚴(yán)重地塊發(fā)病株率為30％～40％。由于花生白絹病以菌核在病殘?bào)w和土層中越冬，能在土壤中存活多年，防治比較困難。

目前針對(duì)該病害的防治措施主要包括與非寄主作物的輪作、深耕，這些栽培措施防治效果不理想；利用殺菌劑防治花生白絹病具有一定的防治效果，但殺菌劑防治存在高成本、破壞環(huán)境及導(dǎo)致病原產(chǎn)生抗藥性等問(wèn)題。目前在國(guó)家提倡的“減施化肥和農(nóng)藥”的方針下，急需建立經(jīng)濟(jì)有效的防治措施。防治花生白絹病最經(jīng)濟(jì)有效的防治方法是種植抗病品種，我國(guó)目前尚無(wú)高抗品種的報(bào)道，而篩選抗病品種必須建立穩(wěn)定可靠的抗性鑒定技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種花生白絹病溫室苗期接種方法，旨建立一種簡(jiǎn)便、可靠的白絹菌接種方法，便于苗期篩選抗白絹病的花生種質(zhì)，獲得抗白絹病的材料，為抗病育種提供技術(shù)手段。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種花生白絹病溫室苗期接種方法，其特征在于包括如下步驟：

1)白絹菌株的獲得(分離獲得白絹病菌)：從田間(武漢市的田間)花生白絹病株上采集白絹菌核，在室內(nèi)進(jìn)行分離、純化{表面消毒后接種pda培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)后，挑取菌落菌絲尖端轉(zhuǎn)接新鮮pda培養(yǎng)基}，鑒定{收集菌絲提取dna，然后利用真菌dnaits區(qū)間通用引物its1和its4pcr擴(kuò)增后序列測(cè)定，經(jīng)blast在genbank比對(duì)，鑒定為sclerotiumrolfsii}；獲得白絹病菌(sclerotiumrolfsii)菌株(或稱(chēng)武漢菌株)；

2)帶菌接種物的制備：白絹菌的活化：將4℃保存白絹病菌菌株(或稱(chēng)白絹病菌武漢菌株)的菌核利用70wt％乙醇表面消毒30s，1wt％次氯酸鈉浸泡2min，無(wú)菌蒸餾水沖洗3次，蘸干后接種于pda培養(yǎng)基上，30℃黑暗條件下培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)出，得到活化的白絹菌絲；

①白絹菌碟的制備：取活化的白絹菌絲接種于pda培養(yǎng)上，30℃黑暗條件下培養(yǎng)3～4d，利用0.5cm的滅菌打孔器在菌落邊緣菌絲處打孔(無(wú)菌打孔器打取菌碟)，獲得白絹菌碟；

②帶菌牙簽的制備：滅菌牙簽呈扇形插入中央放置白絹菌碟的pda培養(yǎng)中，培養(yǎng)至牙簽布滿(mǎn)菌絲，得到帶菌牙簽；

具體為：將牙簽用蒸餾水浸泡過(guò)夜后，控干水分，高溫高壓滅菌后，超凈工作臺(tái)中呈扇形排布于pda平板上，中央接種新鮮的白絹菌碟，30℃黑暗條件下培養(yǎng)5～6d，直至菌絲布滿(mǎn)牙簽；

③帶菌燕麥粒的制備：燕麥粒用水浸泡后高壓滅菌，冷卻后接種白絹菌碟，培養(yǎng)至燕麥粒上布滿(mǎn)菌絲，每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，確保燕麥粒均有菌絲生長(zhǎng)，得到帶菌燕麥粒；

具體為：將燕麥粒裝入三角瓶中，蒸餾水浸泡4h后，倒掉水分，121℃高壓滅菌20min；將白絹菌碟接種到滅菌的燕麥粒中，置于30℃黑暗條件下培養(yǎng)5～6d，每天搖動(dòng)接種瓶2-3次，直至所有燕麥粒均有菌絲生長(zhǎng)；

3)帶菌接種物以不同方式接種花生幼苗：通過(guò)不同白絹菌的接種物接種花生幼苗，所述接種物為白絹菌碟、帶菌牙簽或帶菌燕麥粒，不同時(shí)間觀察癥狀表現(xiàn)，明確帶菌燕麥粒接種優(yōu)于白絹菌碟和帶菌牙簽，其中帶菌燕麥粒貼莖法病害發(fā)展速度最快，其次為帶菌燕麥粒撒表土法，這兩種方法病情指數(shù)差異不顯著，其中帶菌燕麥粒撒表土法比貼莖法操作簡(jiǎn)便、快速，選擇該方法為花生白絹病接種方法；

具體為：將感病花生(感病花生品系14-2012)種植于溫室的塑料大盆中，土壤：蛭石：營(yíng)養(yǎng)土的質(zhì)量比＝2：1：1，培養(yǎng)溫度為26±1℃，16h光照/8h黑暗，感病花生單粒種植，行距12～13cm，間距為6～9cm；播種15d后的花生幼苗按照下面5種方法接種白絹病菌：①菌碟法：將白絹菌碟(簡(jiǎn)稱(chēng)菌碟)的菌絲面貼在花生植株莖基部，透明膠固定；②牙簽法：將帶菌牙簽(長(zhǎng)滿(mǎn)菌絲的牙簽)插入距離莖基部周?chē)耐寥乐校?根帶菌牙簽/植株(每植株插入5根帶菌牙簽)；③燕麥粒貼莖法：將帶菌燕麥粒(帶菌的燕麥粒)按照每株2粒，貼于花生莖基部，并纏繞透明膠固定；④燕麥粒埋土法：將帶菌燕麥粒埋入花生莖基部周?chē)?cm深的土層中，2粒/株(每株埋入2粒帶菌燕麥粒)；⑤燕麥粒撒表土法：花生植株澆透水分，將帶菌燕麥粒(帶菌的燕麥粒)撒在植株莖基部周?chē)耐寥辣砻妫?粒/株(每株根表撒布2粒帶菌燕麥粒)，每天澆水一次；

5種方法接種白絹病菌，每種處理4次重復(fù)，每種重復(fù)7～10株，隨機(jī)排列；從接種4d后開(kāi)始調(diào)查植株發(fā)病，隨后間隔3d調(diào)查一次，一共調(diào)查7次，記錄發(fā)病株數(shù)和發(fā)病的嚴(yán)重度；試驗(yàn)重復(fù)兩次；病害分級(jí)的調(diào)查根據(jù)shokes等1998的標(biāo)準(zhǔn)稍加修改：1級(jí)：僅莖上有病斑，2級(jí)：莖基部有病斑，全株≤25％以下萎蔫和死亡，3級(jí)：全株26-50％表現(xiàn)萎蔫和死亡，4級(jí)：全株≥50％表現(xiàn)萎蔫和死亡。

病情指數(shù)的計(jì)算公式為：di＝{[σ(各級(jí)病株×相對(duì)級(jí)數(shù)值)]/(調(diào)查總株數(shù)×4)}×100；

4)不同數(shù)量的帶菌燕麥粒接種花生幼苗：播種15d的花生幼苗澆水后，將帶菌燕麥粒利用撒表土法接種于花生莖基部周?chē)臃N量分別為1粒、2粒、3粒、4粒和5粒；每個(gè)處理4次重復(fù)(處理指不同接種數(shù)量，就是接種1?！?粒這5個(gè)不同處理)，每個(gè)重復(fù)7～10株，隨機(jī)排列；每天澆水一次，溫室培養(yǎng)條件同上(培養(yǎng)溫度為26±1℃，16h光照/8h黑暗)；接種4d后開(kāi)始病害調(diào)查，間隔3d調(diào)查一次，調(diào)查4周；試驗(yàn)重復(fù)2次；

5)帶菌燕麥粒接種不同苗齡的花生幼苗：將帶菌燕麥粒利用撒表土法接種于播種后15d、20d、25d、30d和35d的花生植株莖基部周?chē)臃N量為4粒/植株，7～10株/重復(fù)，每個(gè)處理四次重復(fù)，隨機(jī)排列，接種后管理方法同上(每天澆水一次)；接種4d后開(kāi)始病害調(diào)查，間隔3d調(diào)查一次，調(diào)查4周；試驗(yàn)重復(fù)2次；

6)帶菌燕麥粒接種不同花生品種/系：將帶菌燕麥粒利用撒表土法接種于播種后15d的19份品種/品系花生幼苗莖基部周?chē)?粒/植株，7～10植株/重復(fù)，每個(gè)處理四次重復(fù)，隨機(jī)排列，接種后的管理方法同上(每天澆水一次)；接種4d后開(kāi)始病害調(diào)查，間隔3d調(diào)查一次，調(diào)查4周；試驗(yàn)重復(fù)2次。

本發(fā)明主要通過(guò)分離獲得白絹菌；通過(guò)不同接種技術(shù)的比較，獲得較好的接種方式；并對(duì)接種量和接種時(shí)間的比較，明確最佳的接種量和接種時(shí)間；進(jìn)一步對(duì)不同花生品種/系接種進(jìn)行抗病性鑒定，獲得相對(duì)抗病的花生材料。為花生抗白絹病種質(zhì)資源的篩選和培育抗白絹病品種提供技術(shù)支撐。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的方法繁殖的白絹菌的致病性強(qiáng)，接種操作簡(jiǎn)單，不需要額外蓋膜保濕，受環(huán)境影響小，效果穩(wěn)定，接種效率高，可結(jié)合田間接種實(shí)驗(yàn)，輔助驗(yàn)證花生種質(zhì)對(duì)花生白絹病的抗性。本發(fā)明提供一種簡(jiǎn)便、快速、可靠的花生抗白絹病的鑒定方法，可以進(jìn)行大量花生種質(zhì)資源材料抗白絹病的鑒定，為花生抗白絹病種質(zhì)資源的篩選和培育抗白絹病品種提供技術(shù)支撐。

附圖說(shuō)明

圖1是花生白絹菌的菌落形態(tài)圖(純化的白絹菌在pda培養(yǎng)基上的菌落)。

圖2是不同接種方法接種花生后的病害發(fā)展動(dòng)態(tài)圖。

圖2中：橫向座標(biāo)標(biāo)號(hào)，1-接種后第4天，2-接種后第7天，3-接種后第10天，4-接種后第13天，5-接種后第16天，6-接種后第19天，7-接種后第22天。

圖3是不同花生品種/系接種白絹后的表現(xiàn)圖(即白絹菌接種不同品種/系花生幼苗后的癥狀)。

圖3中：從左至右，1、2、3、4、5縱向排為不同花生品種/系。

具體實(shí)施方式

一種花生白絹病溫室苗期接種方法，包括如下步驟：

1).白絹菌株的獲得(分離獲得白絹病菌)：從武漢的田間花生白絹病株上采集白絹菌核，在室內(nèi)進(jìn)行分離、純化{表面消毒后接種pda培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)后，挑取菌落菌絲尖端轉(zhuǎn)接新鮮pda培養(yǎng)基}，鑒定{收集菌絲提取dna，然后利用真菌dnaits區(qū)間通用引物its1和its4pcr擴(kuò)增后序列測(cè)定，經(jīng)blast在genbank比對(duì)，鑒定為sclerotiumrolfsii}；獲得白絹病菌(sclerotiumrolfsii)菌株；

2).帶菌接種物的制備：白絹菌的活化：將4℃保存白絹病菌菌株(白絹病菌武漢菌株)的菌核利用70wt％乙醇表面消毒30s，1wt％次氯酸鈉浸泡2min，無(wú)菌蒸餾水沖洗3次，蘸干后接種于pda培養(yǎng)基上，30℃黑暗條件下培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)出，得到活化的白絹菌絲；

①白絹菌碟的制備：取活化的白絹菌絲接種于pda培養(yǎng)上，30℃黑暗條件下培養(yǎng)3～4d，利用0.5cm的滅菌打孔器在菌落邊緣菌絲處打孔(無(wú)菌打孔器打取菌碟)，獲得白絹菌碟；

②帶菌牙簽的制備：滅菌牙簽呈扇形插入中央放置白絹菌碟的pda培養(yǎng)中，培養(yǎng)至牙簽布滿(mǎn)菌絲，得到帶菌牙簽；

具體為：將牙簽用蒸餾水浸泡過(guò)夜后，控干水分，高溫高壓滅菌后，超凈工作臺(tái)中呈扇形排布于pda平板上，中央接種新鮮的白絹菌碟，30℃黑暗條件下培養(yǎng)5～6d，直至菌絲布滿(mǎn)牙簽；

③帶菌燕麥粒的制備：燕麥粒用水浸泡后高壓滅菌，冷卻后接種白絹菌碟，培養(yǎng)至燕麥粒上布滿(mǎn)菌絲，每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，確保燕麥粒均有菌絲生長(zhǎng)，得到帶菌燕麥粒；

具體為：將燕麥粒裝入三角瓶中，蒸餾水浸泡4h后，倒掉水分，121℃高壓滅菌20min；將白絹菌碟接種到滅菌的燕麥粒中，置于30℃黑暗條件下培養(yǎng)5～6d，每天搖動(dòng)接種瓶2-3次，直至所有燕麥粒均有菌絲生長(zhǎng)；

3).帶菌接種物以不同方式接種花生幼苗：通過(guò)不同白絹菌的接種物接種花生幼苗，所述接種物為白絹菌碟、帶菌牙簽或帶菌燕麥粒，不同時(shí)間觀察癥狀表現(xiàn)，明確帶菌燕麥粒接種優(yōu)于白絹菌碟和帶菌牙簽，其中帶菌燕麥粒貼莖法病害發(fā)展速度最快，其次為帶菌燕麥粒撒表土法，這兩種方法病情指數(shù)差異不顯著，其中帶菌燕麥粒撒表土法比貼莖法操作簡(jiǎn)便、快速，選擇該方法為花生白絹病接種方法；

具體為：將感病花生(感病花生品系14-2012)種植于溫室的塑料大盆中，土壤：蛭石：營(yíng)養(yǎng)土的質(zhì)量比＝2：1：1，培養(yǎng)溫度為26±1℃，16h光照/8h黑暗，感病花生單粒種植，行距12～13cm，間距為6～9cm；播種15d后的花生幼苗按照下面5種方法接種白絹病菌：①菌碟法：將白絹菌碟(簡(jiǎn)稱(chēng)菌碟)的菌絲面貼在花生植株莖基部，透明膠固定；②牙簽法：將帶菌牙簽(長(zhǎng)滿(mǎn)菌絲的牙簽)插入距離莖基部周?chē)耐寥乐校?根帶菌牙簽/植株(每植株插入5根帶菌牙簽)；③燕麥粒貼莖法：將帶菌燕麥粒(帶菌的燕麥粒)按照每株2粒，貼于花生莖基部，并纏繞透明膠固定；④燕麥粒埋土法：將帶菌燕麥粒埋入花生莖基部周?chē)?cm深的土層中，2粒/株(每株埋入2粒帶菌燕麥粒)；⑤燕麥粒撒表土法：花生植株澆透水分，將帶菌燕麥粒(帶菌的燕麥粒)撒在植株莖基部周?chē)耐寥辣砻妫?粒/株(每株根表撒布2粒帶菌燕麥粒)，每天澆水一次；

5種方法接種白絹病菌，每種處理4次重復(fù)，每種重復(fù)7～10株，隨機(jī)排列；從接種4d后開(kāi)始調(diào)查植株發(fā)病，隨后間隔3d調(diào)查一次，一共調(diào)查7次，記錄發(fā)病株數(shù)和發(fā)病的嚴(yán)重度；試驗(yàn)重復(fù)兩次；病害分級(jí)的調(diào)查根據(jù)shokes等1998的標(biāo)準(zhǔn)稍加修改：1級(jí)：僅莖上有病斑，2級(jí)：≤25％的莖萎蔫和死亡，3級(jí)：26-50％莖萎蔫和死亡，4級(jí)：≥50％的莖萎蔫和死亡；

病情指數(shù)的計(jì)算公式為：di＝{[σ(各級(jí)病株×相對(duì)級(jí)數(shù)值)]/(調(diào)查總株數(shù)×4)}×100；

4).不同數(shù)量的帶菌燕麥粒接種花生幼苗：播種15d的花生幼苗澆水后，將帶菌燕麥粒利用撒表土法接種于花生莖基部周?chē)?，接種量分別為1粒、2粒、3粒、4粒和5粒；每個(gè)處理4次重復(fù)(處理指不同接種數(shù)量，就是接種1?！?粒這5個(gè)不同處理)，每個(gè)重復(fù)7～10株，隨機(jī)排列；每天澆水一次，溫室培養(yǎng)條件同上(培養(yǎng)溫度為26±1℃，16h光照/8h黑暗)；接種4d后開(kāi)始病害調(diào)查，間隔3d調(diào)查一次，調(diào)查4周；試驗(yàn)重復(fù)2次；

5).帶菌燕麥粒接種不同苗齡的花生幼苗：將帶菌燕麥粒利用撒表土法接種于播種后15d、20d、25d、30d和35d的花生植株莖基部周?chē)臃N量為4粒/植株，7～10株/重復(fù)，每個(gè)處理四次重復(fù)，隨機(jī)排列，接種后管理方法同上(每天澆水一次)；接種4d后開(kāi)始病害調(diào)查，間隔3d調(diào)查一次，調(diào)查4周；試驗(yàn)重復(fù)2次；

6).帶菌燕麥粒接種不同花生品種/系：將帶菌燕麥粒利用撒表土法接種于播種后15d的19份品種/品系花生幼苗莖基部周?chē)?粒/植株，7～10植株/重復(fù)，每個(gè)處理四次重復(fù)，隨機(jī)排列，接種后的管理方法同上(每天澆水一次)；接種4d后開(kāi)始病害調(diào)查，間隔3d調(diào)查一次，調(diào)查4周；試驗(yàn)重復(fù)2次。采用相對(duì)抗病程度評(píng)價(jià)方法(王繼華等2005，鄭章云等2015)調(diào)查供試花生品種/系對(duì)花生白絹病的溫室苗期抗病能力。相對(duì)病情指數(shù)(relativediseaseindex,rdi)＝1-鑒定品種平均病情指數(shù)/發(fā)病最嚴(yán)重品種的平均病情指數(shù)?？共〕潭确譃?級(jí)，免疫：相對(duì)抗病指數(shù)為1.0，高抗：相對(duì)抗病指數(shù)為0.8～0.99，抗?。合鄬?duì)抗病指數(shù)為0.40～0.79，中感：相對(duì)抗病指數(shù)為0.2～0.39，高感：相對(duì)抗病指數(shù)低于0.2。

1～5粒帶菌燕麥粒通過(guò)撒表土法接種花生，發(fā)現(xiàn)不同接種量間病情指數(shù)差異不顯著，其中以接種4粒帶菌燕麥的發(fā)病率和病情指數(shù)最高；利用帶菌燕麥粒接種不同苗齡的花生植株，發(fā)現(xiàn)播種后15d～35d的花生幼苗接種白絹菌都能發(fā)病，病情指數(shù)方差分析無(wú)顯著差異，以播種后15d接種白絹菌和病害調(diào)查時(shí)間總共所用的時(shí)間少，單位時(shí)間內(nèi)鑒定的材料份數(shù)多，選擇該時(shí)間為白絹病的接種時(shí)間；建立了花生播種后15d的幼苗以4粒帶菌燕麥粒撒于莖基部土表的花生白絹接種方法。

花生抗白絹病的評(píng)價(jià)：19份花生材料利用帶菌燕麥粒接種花生，通過(guò)不同時(shí)間的癥狀觀察，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)，發(fā)現(xiàn)絕大部分材料為感病材料，只有1份材料存在相對(duì)抗性。

表15種不同接種方法接種3周后的發(fā)病結(jié)果

表1中：方差分析p<0.05時(shí)，相同小寫(xiě)字母表示兩個(gè)處理間平均數(shù)差異不顯著，不同字母表示兩個(gè)處理間平均數(shù)差異顯著(即a，b，c)。

表2帶菌燕麥粒不同接種量接種后3周后的發(fā)病結(jié)果

表2中：方差分析p<0.05時(shí)，相同小寫(xiě)字母表示處理間平均數(shù)差異不顯著。

表3不同苗齡接種帶菌燕麥粒的發(fā)病結(jié)果

表3中：方差分析p<0.05時(shí)，相同小寫(xiě)字母表示兩個(gè)處理間平均數(shù)差異不顯著。

表4不同花生品種/系接種白絹菌后的抗/感病表現(xiàn)

表4中：hs表示高度敏感，ms表示中等敏感，mr表示中等抗性。