本發(fā)明涉及水產(chǎn)動物遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種超雄鯉魚和遺傳雄性而生理雌性鯉魚的制備方法，采用該方法可以培育出yy型染色體的超雄鯉魚，用它產(chǎn)生的精液與普通雌性鯉魚產(chǎn)生的卵子雜交，生產(chǎn)出后代全部為雄性的鯉魚，將雄性鯉魚人工性反轉(zhuǎn)為生理雌性的鯉魚，應(yīng)用于鯉魚性別決定與分化等基礎(chǔ)理論研究和鯉魚入侵種群的控制。

背景技術(shù)：

鯉是全球第三大淡水養(yǎng)殖品種，2014年鯉全球水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量近420萬噸，占全球淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量近11％，年產(chǎn)值近59億美元(fao,2014)。但是，在美洲、大洋洲及非洲等地的部分地區(qū)，尤其是在美國、加拿大和澳大利亞，鯉是一種嚴(yán)重破壞當(dāng)?shù)厮锶郝浼吧鷳B(tài)系統(tǒng)的外來入侵物種(zambranoetal.,2006；chapmanandhoff,2011；weberandbrown,2011；forsythetal.,2013；bajerandsorensen,2015；vilizzietal.,2015；bajeretal.,2016)，鯉被列入全球100大最嚴(yán)重外來入侵物種名單(luqueetal.,2014)。

目前主要通過水位調(diào)控、圍網(wǎng)、電魚及全湖投毒等人工去除的方法控制入侵鯉種群，但是，采用這些方法來根除入侵的鯉種群不切實(shí)際(gutierrezandteem,2006；brittonetal.,2011；vilizzi,2012；koehnetal.,2016)。昆蟲防治(klassenandcurtis,2005)及海七鰓鰻(twoheyetal.,2003；wangetal.,2016)的研究表明，通過改變?nèi)肭治锓N群體的性別比例可以有效控制和滅絕入侵種。

gutierrez和teem等提出“trojanychromosome(tyc)”模型控制入侵鯉種群，通過人工培育出超雄的yy鯉，在此基礎(chǔ)上人工誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)的yy雌鯉，并釋放到水環(huán)境后，與入侵雌鯉競爭精子產(chǎn)生全雄子代，使入侵鯉群體性別比例嚴(yán)重偏向雄性，最終導(dǎo)致該群體100％都是雄性進(jìn)而致使整個(gè)入侵鯉群體滅絕(gutierrezandteem,2006；cottonandwedekind,2007；teemandgutierrez,2011)。該模型得到了多種數(shù)學(xué)模型分析論證(parshadandgutierrez,2010,2011；zhaoetal.,2012；wangetal.,2014)，被認(rèn)為是目前最佳的控制xy型染色體性別決定型魚類的方法之一(teemetal.,2014；wangetal.,2016)。但該模型目前仍處于理論階段，獲得超雄的yy鯉和遺傳雄性而生理雌性的鯉魚是實(shí)施該策略的關(guān)鍵。

采用雌激素進(jìn)行魚類性反轉(zhuǎn)，成功研制出遺傳雄性而生理雌性(fxy)的青鳉(yamamoto,1967；scholzetal.,2003)、尼羅羅非魚(veracruzetal.,1996；mairetal.,1997)、黃顙魚(liuetal.,2013)及美洲紅點(diǎn)鮭(schilletal.,2016)，這些生理雌性的fxy魚可以存活并發(fā)育為可育的成體，為進(jìn)一步培育yy超雄魚創(chuàng)造了條件。但是，很可能由于鯉對雌激素有更強(qiáng)的耐受力(teemandgutierrez,2011)，采用雌激素處理雄鯉，卻難以獲得性反轉(zhuǎn)的遺傳雄性生理雌性xy鯉(komenetal.,1989；bongersetal.,1991)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了一種超雄鯉魚和遺傳雄性而生理雌性鯉魚的制備方法，方法簡單，易行。

為了達(dá)到上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：

一種超雄鯉魚和遺傳雄性而生理雌性鯉魚的制備方法，包括下述步驟：

1)將1200-1800顆鯉魚卵細(xì)胞分散懸浮于加有50mlm-199細(xì)胞培養(yǎng)液的底面直徑為22-28cm的不銹鋼圓形容器中，置于標(biāo)準(zhǔn)型圓周搖床上，轉(zhuǎn)速為90-110rpm；波長為254nm的30w紫外滅菌燈垂直照射，照射時(shí)間為3.5-4.5min，照距24-28cm。

2)鯉魚卵經(jīng)紫外照射后，倒掉m-199細(xì)胞培養(yǎng)液，加入0.1-0.3ml鯉魚精液，用干燥潔凈的雞毛輕輕混勻后以23-25℃的曝氣水人工授精，均勻鋪在網(wǎng)片上，受精25-35min后，將粘附有鯉魚胚胎的網(wǎng)片于40±0.5℃水浴中熱休克處理1.5-2.5min，處理后的胚胎在室溫曝氣后自來水或池塘水中孵化。

3)利用分子標(biāo)記m1(5’-maagcattcgtaagcagtgtcatc-3’和5’-tctgtaactaatgtgccaaaaag-3’)和m2(5’-mcactcttacctttcctgtttgt-3’和5’-cagttagttatttgggttttgc-3’)，對孵化出的雄核發(fā)育鯉魚子代進(jìn)行鑒定，選取僅遺傳父本遺傳物質(zhì)(父本條帶)的子代；

4)將步驟3)篩選出的雄核發(fā)育鯉魚養(yǎng)殖到性成熟，選取可以人工擠出精液的性成熟鯉魚，將其精液與普通雌性鯉魚卵子授精，獲得測交子代。將測交子代飼養(yǎng)至性成熟后辨別其性別，測交子代全為雄性的鯉魚的父本就是人工誘導(dǎo)雄核發(fā)育獲得的yy超雄鯉魚。

5)將yy超雄鯉(myy)測交所得全雄子代(mxy)采用雌激素及雄激素受體拮抗劑flutamide進(jìn)行鯉性反轉(zhuǎn)，即可獲得遺傳雄性而生理雌性的鯉魚

以上所述的方案中，優(yōu)選的，步驟5)中進(jìn)行鯉性反轉(zhuǎn)的方法具體包括：將yy超雄鯉(myy)測交所得全雄子代(mxy)培育至2月齡大小，投喂混有雌二醇(200mg/kg)和flutamide(200mg/kg)處理的飼料，一天兩次，連續(xù)投喂3個(gè)月后改用正常飼料投喂，即可獲得遺傳雄性而生理雌性的鯉魚。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：

目前還沒有將雄性鯉魚性反轉(zhuǎn)為雌性鯉魚的成功技術(shù)。鯉魚性反轉(zhuǎn)通常在魚苗階段投喂含有激素的飼料進(jìn)行處理，但沒有可用于鑒定鯉魚性別的穩(wěn)定的分子遺傳標(biāo)記，因此無法在魚苗階段鑒定出雄性鯉魚苗實(shí)施性反轉(zhuǎn)處理。本發(fā)明研制出雄核發(fā)育的超雄yy鯉魚，并通過微衛(wèi)星標(biāo)記親子鑒定和測交試驗(yàn)確證。yy鯉魚與普通雌性鯉魚雜交產(chǎn)生的后代全部為雄性的鯉魚，不需要進(jìn)行鯉魚性別鑒定，直接對這些已知性別的雄性幼鯉進(jìn)行人工性反轉(zhuǎn)，獲得了遺傳雄性而生理雌性的鯉魚。本發(fā)明提供的方法培育出的yy超雄鯉魚可以應(yīng)用于控制作為外來種的鯉魚種群，也可應(yīng)用于鯉魚的性別決定與分化等基礎(chǔ)研究。遺傳雄性而生理雌性鯉魚的制備技術(shù)為進(jìn)一步研制yy型雌性鯉魚提供借鑒。

(1)本發(fā)明不需要特殊的儀器明確具體的uv劑量，通過控制uv照距、uv照射時(shí)間即可實(shí)現(xiàn)雌性卵原核遺傳失活，所用試劑材料，均易于購買，且操作人員不需要經(jīng)過特殊的科研培訓(xùn)即可操作，相對更簡單易行；

(2)uv照射過程中，采用m-199細(xì)胞培養(yǎng)液及圓周搖床，能夠使卵細(xì)胞很好分散懸浮于其中而不被激活，且使卵能夠更好地受到uv均勻照射，達(dá)到雌性卵原核遺傳失活最佳的效果；

(3)uv照射處理強(qiáng)度及持續(xù)時(shí)間是遺傳失活雌性卵原核的關(guān)鍵，但不論怎樣，總會存在一些卵細(xì)胞并沒有遺傳失活，這樣在子代中就會存在正常受精的受精卵，采用微衛(wèi)星標(biāo)記能夠區(qū)分父本和母本，從子代群體中將僅遺傳父本遺傳物質(zhì)即雄核發(fā)育的個(gè)體篩選出來，能夠大大減少后續(xù)測交驗(yàn)證所導(dǎo)致的成本，迅速篩選出真正的yy超雄魚；

(4)本發(fā)明成功培育了性成熟的yy超雄鯉，并驗(yàn)證了其與正常對照雌鯉測交子代全為雄性。直接對這些已知性別的雄性幼苗進(jìn)行人工性反轉(zhuǎn)處理，所得雌鯉全部為遺傳雄性而生理雌性的鯉魚，取得了雄鯉雌性化的突破。

附圖說明

圖1為分子標(biāo)記m1和m2對子代微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定圖譜；

其中：♂：父本；♀：母本；泳道1-10：僅遺傳父本遺傳信息的雄核發(fā)育子代。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

一種超雄鯉魚和遺傳雄性而生理雌性鯉魚的制備方法。其步驟是：

1)將約1500顆鯉魚卵細(xì)胞分散懸浮于加有50mlm-199細(xì)胞培養(yǎng)液的底面直徑為25cm的不銹鋼圓形容器中，此時(shí)m-199細(xì)胞培養(yǎng)液剛好沒過鯉魚卵，置于標(biāo)準(zhǔn)型圓周搖床(scilogexsk-o180-e)上，轉(zhuǎn)速為100rpm；波長為254nm的30w紫外滅菌燈垂直對容器進(jìn)行照射，照射時(shí)間為4min，照距26cm(即光源與容器底面的距離為26cm)。

2)鯉魚卵經(jīng)紫外照射后，倒掉m-199細(xì)胞培養(yǎng)液，加入0.25ml鯉魚精液，用干燥潔凈的雞毛輕輕混勻后以24℃的曝氣水人工授精，均勻鋪在網(wǎng)片上，受精30min后，將粘附有鯉魚胚胎的網(wǎng)片于40±0.5℃水浴中熱休克處理2min，處理后的胚胎在室溫曝氣后自來水中孵化。

3)將孵化出來的鯉魚按常規(guī)方法養(yǎng)殖，利用分子標(biāo)記m1(5’-maagcattcgtaagcagtgtcatc-3’和5’-tctgtaactaatgtgccaaaaag-3’)和m2(5’-mcactcttacctttcctgtttgt-3’和5’-cagttagttatttgggttttgc-3’)，對孵化出的鯉魚的雄核發(fā)育子代進(jìn)行鑒定，選取僅遺傳父本遺傳物質(zhì)(父本條帶)的子代(圖1)；pcr體系包括1ul鯉基因組dna(50ng/ul)、5ul的2×taqmastermix、正反引物各0.2ul(10umol/ml)，0.32ul的m13熒光接頭和3.28ul的ddh2o。pcr程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min，擴(kuò)增28個(gè)循環(huán)(94℃30s，56℃退火25s，72℃延伸25s)，再72℃延伸5min。pcr產(chǎn)物用li-cor4300dna凝膠電泳系統(tǒng)進(jìn)行分析。

4)將步驟3)篩選出的雄核發(fā)育鯉魚養(yǎng)殖到性成熟，選取可以人工擠出精液的性成熟鯉魚，將其精液與普通雌性鯉魚卵子雜交，獲得雜交子代。將雜交子代飼養(yǎng)至性成熟后辨別其性別，雜交子代全為雄性的鯉魚的父本就是雄核發(fā)育的yy超雄鯉魚。

根據(jù)上述方法，69尾胚胎中25尾發(fā)育至性成熟，其中有10尾遺傳父本遺傳信息，10尾中有4尾能擠出精液且測交子代全為雄性。

5)按照鯉魚的常規(guī)養(yǎng)殖方法，將yy超雄鯉(myy)測交所得全雄子代(mxy)培育至2月齡大小，選取100尾幼魚，投喂混有雌二醇(200mg/kg)和flutamide(200mg/kg)處理的飼料，一天兩次，連續(xù)投喂3個(gè)月后改用正常飼料投喂。至6月齡時(shí)，隨機(jī)檢測其中的17尾鯉魚，有10尾發(fā)育為雌性卵巢，這10尾鯉魚即為遺傳雄性而生理雌性的鯉魚，雌性化率達(dá)58.8％。