本專利屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及tale蛋白avrxa7在防治柑橘潰瘍病害上的應(yīng)用。avrxa7來源于水稻白葉枯病菌，對柑橘潰瘍病菌中的ptha4致病功能有抑制作用，干擾柑桔中感病基因的表達(dá)，從而有效控制柑橘潰瘍病害發(fā)生。

背景技術(shù)：

柑橘潰瘍病是我國柑橘產(chǎn)區(qū)的一個重要細(xì)菌病害，為國內(nèi)外檢疫對象。引起潰瘍病產(chǎn)生的病原菌是柑橘黃單菌（xanthomonascitrisubsp.citri），在所有已經(jīng)測序得柑橘黃單胞菌中都含有4個avr/ptha基因家族成員ptha1、ptha2、ptha3和ptha4，其中ptha4是病原菌的主要致病基因，該基因突變后病原菌在柑橘寄主上的致病力完全喪失。在病害發(fā)生過程中，病原菌首先克服寄主植物表層結(jié)構(gòu)，隨后依賴ptha4激活柑橘中的感病基因表達(dá)，使得潰瘍癥狀最終形成。從提高寄主抗性角度對柑橘潰瘍病進(jìn)行控制，除了選用基礎(chǔ)抗性較強(qiáng)的柑橘品種，對ptha4的致病功能進(jìn)行干擾也是一個有效的控制策略，主要的突破途徑在于干擾ptha4對感病基因的激活。目前并未有利用水稻白葉枯病菌的tale蛋白avrxa7用于防治柑橘潰瘍病的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供水稻白葉枯病菌的tale蛋白avrxa7在柑橘潰瘍病生物防治中應(yīng)用。本發(fā)明利用水稻白葉枯病菌的avrxa7干擾柑橘潰瘍病菌的致病基因ptha4對柑橘感病基因的激活，從而達(dá)到防治柑橘潰瘍病菌的目的。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明的avrxa7基因來源于引起水稻白葉枯病菌的稻黃單胞（xanthomonasoryzaepv.oryzae）(yangb,zhuwg,johnsonlbandwhiteff.thevirulencefactoravrxa7ofxanthomonasoryzaepv.oryzaeisatypeiiisecretionpathway-dependentnuclear-localizeddouble-strandeddna-bindingprotein.pnas,2000,97:9807–9812.)，在基因序列上與柑橘潰瘍病菌ptha4同源性很高，屬同一個基因家族成員。在野生型柑橘潰瘍病菌中異源表達(dá)avrxa7，潰瘍菌喪失了在柑橘上形成潰瘍癥狀的能力。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和real-timepcr結(jié)果顯示，與ptha4對應(yīng)的感病基因在引入avrxa7以后，不能被誘導(dǎo)表達(dá)，表明avrxa7干擾了ptha4對柑橘感病基因的激活。將avrxa7在熒光假單胞菌中表達(dá)，對潰瘍病有顯著的防治作用。相對柑橘潰瘍病菌而言，avrxa7雖然是來源于黃單胞屬的不同種菌株，但可以干擾ptha4在致病過程中的功能，可用做高效生防菌株的分子改造，應(yīng)用于柑橘潰瘍病的生態(tài)物控制。

附圖說明

圖1、avrxa7在柑橘潰瘍病菌中抑制潰瘍病害的發(fā)生。

圖2、表達(dá)avrxa7的熒光假單胞菌對柑橘潰瘍的防治作用。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

（1）在野生型柑橘潰瘍病菌中表達(dá)avrxa7

將avrxa7基因克隆到質(zhì)粒pufr034中，通過電轉(zhuǎn)化方法進(jìn)入野生型柑橘潰瘍病菌xac29-1中。在nb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，注射接種柑橘葉片。5天后觀察潰瘍癥狀的形成情況。接種野生型菌株的區(qū)域，一般3天后就可以看到潰瘍癥狀出現(xiàn)，5天后注射接種區(qū)域的潰瘍斑隆起；而表達(dá)avrxa7的潰瘍菌株接種后，觀察不到潰瘍癥狀的形成（圖1）。

（2）avrxa7對柑橘潰瘍病菌ptha4基因致病功能的干擾

柑橘植物接種攜帶avrxa7的柑橘潰瘍菌株以后，運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法分析寄主植物的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)一批與avrxa7和ptha4相關(guān)的基因，其中最為突出的是與ptha4對應(yīng)的感病基因。接種野生型菌株后，與ptha4對應(yīng)的感病基因誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)水平增高100多倍，而接種表達(dá)avrxa7的潰瘍菌株后，感病基因沒有誘導(dǎo)表達(dá)，表明avrxa7干擾了柑橘潰瘍病菌ptha4基因的致病功能。

（3）avrxa7在柑橘潰瘍病害生物防治中的應(yīng)用

將avrxa7轉(zhuǎn)到生防熒光假單胞菌pf中，借助假單胞菌的iii型分泌系統(tǒng)，將avrxa7分泌到寄主植物細(xì)胞。將野生型柑橘潰瘍病菌和pf在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，采用摩擦接種的方法在柑橘葉片制造傷口，用攜帶avrxa7的假單胞菌液浸泡葉片30秒，然后放在室溫下自然風(fēng)干；2小時(shí)后，浸液接種柑橘潰瘍病菌。以后每隔10天用攜帶avrxa7的假單胞菌液處理一次葉片。1個月后觀察潰瘍病的發(fā)生情況。用水處理作為對照，1個月后，葉片出現(xiàn)典型的潰瘍癥狀，在傷口的位置都會形成隆起的潰瘍病斑。生防假單胞菌的傷口也會出現(xiàn)潰瘍斑，但癥狀輕微，稍有凸起。攜帶avrxa7的假單胞菌處理的葉片僅能看到葉片傷口的愈合，沒有看到任何潰瘍癥狀出現(xiàn)（圖2）。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供TALE蛋白AvrXa7在防治柑橘潰瘍病害上的應(yīng)用，屬生物技術(shù)領(lǐng)域，從稻黃單胞菌中分離的TALE蛋白AvrXa7通過干擾柑桔潰瘍病菌pthA4對感病基因的激活，抑制潰瘍病害的發(fā)生；在生防熒光假單胞菌Pf中表達(dá)AvrXa7，能夠有效抑制潰瘍癥狀的形成，AvrXa7是構(gòu)建高效基因工程菌株的極佳基因資源，在柑橘潰瘍病的生物防控中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)研發(fā)人員：鄒華松;孫東玲;卓濤;范曉靜;戶勛
受保護(hù)的技術(shù)使用者：福建農(nóng)林大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：2017.05.09
技術(shù)公布日：2017.07.25