本發(fā)明涉及一種鐵皮石斛的提取方法，特別是一種多糖含量高的鐵皮石斛的提取方法。

背景技術：

鐵皮石斛別稱鐵皮蘭、吊蘭、云南鐵皮、鐵皮吊蘭，是蘭科石斛屬多年生草本植物，鐵皮石斛是石斛類藥材的上品，素有“中華仙草-藥中黃金”之美稱，以莖入藥，含有多糖、石斛堿、生物堿等有效成分，具有滋陰清熱、生津益胃、潤喉明目等功效，在抗腫瘤、提高人體免疫力、治療胃腸道疾病、抗衰老、抗氧化、抗血小板聚集、降低血糖、治療白內(nèi)障等方面均有良好療效。

現(xiàn)代藥理學研究表明，鐵皮石斛對非特異性及特異性免疫均有增強作用，在抗腫瘤、抗氧化、降低血糖以及白內(nèi)障的治療等方面，藥理作用顯著。其化學成分較復雜，已確定的化合物類型主要有：生物堿類、多糖類、菲類、聯(lián)芐母核類，其中生物堿類、多糖類藥理活性較為顯著。多糖類成分是藥用石斛發(fā)揮免疫活性作用的重要物質基礎，鐵皮石斛多糖能顯著提高外周白細胞數(shù)，促進淋巴細胞產(chǎn)生移動抑制因子，可有效提高機體免疫力。2010版《藥典》首次收載了鐵皮石斛的質量標準，對多糖以及甘露糖進行含量測定。

現(xiàn)有技術中對鐵皮石斛進行加工時，通常是直接將鐵皮石斛粉碎成粉，但是發(fā)明人在研究過程中發(fā)現(xiàn)，采用現(xiàn)有技術對靈芝進行加工時，鐵皮石斛的有效成分多糖不易測出，使得靈芝的的藥效還不夠理想。同時隨著鐵皮石斛的保健功效被人們廣泛的認識和接受，野生鐵皮石斛已遠遠不能滿足人們的需求。人們已經(jīng)開始采用人工栽培鐵皮石斛，鐵皮石斛的栽培方法中，培養(yǎng)基是鐵皮石斛賴以生存的條件，不同的培養(yǎng)原料和配方可對鐵皮石斛的生長、產(chǎn)量和活性成分等產(chǎn)生重要的影響?，F(xiàn)有技術中鐵皮石斛用的培養(yǎng)基及現(xiàn)有栽培方法，不利于產(chǎn)出的鐵皮石斛的品質保證。特別是不能保證鐵皮石斛中多糖的含量，使得最終得到的鐵皮石斛中多糖含量低。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的，是提供一種鐵皮石斛的提取方法，本發(fā)明對靈芝的具體加工工藝進行了改進，使得靈芝的有效成分多糖容易測出，且測出的多糖含量高，使得靈芝的藥效好。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的。一種鐵皮石斛的提取方法，取前處理后的鐵皮石斛，洗凈后用水和檸檬酸，浸泡后，煎煮，均趁熱濾過，合并濾液，濾液70-80℃0.06-0.08mpa下減壓薄膜濃縮成浸膏，浸膏干燥后粉碎，即得。

前述的鐵皮石斛的提取方法中，取前處理后的鐵皮石斛，洗凈后加6-10倍量的水和10-12倍量的檸檬酸，浸泡1-3h后，煎煮2-3次，每次1-2h，均趁熱濾過，合并濾液，濾液70-80℃0.07mpa下減壓薄膜濃縮成浸膏，浸膏干燥后粉碎，即得。

前述的鐵皮石斛的提取方法，所述前處理為：具體包括以下步驟：

(1)取鐵皮石斛種子，洗凈后，在超凈工作臺上采用70-80％的乙醇消毒5-15min后，再用無菌水沖洗3-4次，置于滅菌的濾紙上吸干后，接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上，在晝溫為20-25℃，夜溫18-20℃條件下，暗培養(yǎng)，直至種子萌發(fā)；

(2)待種子萌發(fā)后，將1-2cm高的單苗接種到增殖培養(yǎng)基上，在23-28℃，光強1500-2500lx下每天光照9-10h，直至鐵皮石斛苗高為5-8cm；

(3)移栽，移栽時間為4-6月，苗高為5-8cm的鐵皮石斛苗，先用清水洗凈幼苗根部的培養(yǎng)基，再用0.3-0.5％的高錳酸鉀稀釋液浸根消毒，按行距為10-15cm鐵皮石斛苗種于基質中，確?；|覆蓋住根系，使根系與基質接觸；

(4)種植后每隔3-5天噴施1次菌靈液，連續(xù)噴施20-30天；之后采用噴施方式進行澆水，澆水次數(shù)為1-3月份2-3天1次，3-6月份1-2天1次，6-9月份5-6天1次，9-12月份2-3天1次，11月至次年3月，采收，即可。

前述的鐵皮石斛的提取方法，所述步驟(1)中，所述萌發(fā)培養(yǎng)基主要由按重量份計算的蔗糖3-6份、瓊脂5-15份、黃連10-20份和貝母10-20份按下述方法制成：黃連和貝母加10-12倍量的水煎煮2-3h后，過濾，取濾渣，干燥，粉碎成粗顆粒，粗顆粒與蔗糖、瓊脂混勻，即得。

前述的鐵皮石斛的提取方法，所述萌發(fā)培養(yǎng)基主要由按重量份計算的蔗糖5份、瓊脂10份、黃連15份和貝母15份按下述方法制成：黃連和貝母加11倍量的水煎煮2.5h后，過濾，取濾渣，干燥，粉碎成粗顆粒，粗顆粒與蔗糖、瓊脂混勻，即得。

前述的鐵皮石斛的提取方法，所述步驟(2)中，所述增殖培養(yǎng)基主要由按重量份計算的蔗糖3-6份、紅薯泥10-20份、黃豆渣5-15份、naa5-10份、當歸10-20份和麻黃10-20份按下述方法制成：當歸和麻黃加10-12倍量的水煎煮2-3h后，過濾，取濾渣，干燥，粉碎成粗顆粒，粗顆粒與蔗糖、紅薯泥、黃豆渣和naa混勻，即得。

前述的鐵皮石斛的提取方法，所述增殖培養(yǎng)基主要由按重量份計算的蔗糖5份、紅薯泥15份、黃豆渣10份、naa8份、當歸15份和麻黃15份按下述方法制成：當歸和麻黃加11倍量的水煎煮2.5h后，過濾，取濾渣，干燥，粉碎成粗顆粒，粗顆粒與蔗糖、紅薯泥、黃豆渣和naa混勻，即得。

前述的鐵皮石斛的提取方法，所述步驟(3)中，所述基質主要由按重量份計算的蔗糖3-6份、紅薯泥10-20份、土豆泥10-20份、玉米糊5-15份、黃豆渣5-15份、熟地10-20份、丹皮5-15份、苦參10-20份、女貞子5-15份和吳茱萸10-20份按下述方法制成：熟地、丹皮、苦參、女貞子和吳茱萸加10-12倍量的水煎煮2-3h后，過濾，取濾渣，干燥，粉碎成粗顆粒，粗顆粒與蔗糖、紅薯泥、土豆泥、玉米糊和黃豆渣混勻，即得。

前述的鐵皮石斛的提取方法，所述基質主要由按重量份計算的蔗糖5份、紅薯泥15份、土豆泥15份、玉米糊10份、黃豆渣10份、熟地15份、丹皮10份、苦參15份、女貞子10份和吳茱萸15份按下述方法制成：熟地、丹皮、苦參、女貞子和吳茱萸加10-12倍量的水煎煮2-3h后，過濾，取濾渣，干燥，粉碎成粗顆粒，粗顆粒與蔗糖、紅薯泥、土豆泥、玉米糊和黃豆渣混勻，即得。

申請人對本發(fā)明進行了大量的實驗研究，部分實驗如下：

實驗例1多糖含量考察.

1材料與方法

1.1材料

1.1.1鐵皮石斛1：按實施例1進行提取。

1.1.2鐵皮石斛2：按實施例1進行提取，前處理時萌發(fā)培養(yǎng)基中不含黃連和貝母，增殖培養(yǎng)基中不含當歸和麻黃，基質中不含熟地、丹皮、苦參、女貞子和吳茱萸，其余方法同實施例1。

1.2儀器和試劑

葡萄糖標準品[d一(+)一葡萄糖]：kayon公司；甲醇(色譜純)：天津市科密歐化學試劑有限公司；其余試劑均為分析純；苯酚：上海凌峰化學試劑有限公司；硫酸：上海凌峰化學試劑有限公司。

2方法

2.1供試品溶液的制備

2.1.1供試品溶液1的制備：

取本發(fā)明鐵皮石斛(鐵皮石斛1)樣品，置烘箱中50℃，干燥，粉碎，過三號篩，取過濾后藥材粉末，揮干溶劑，加水2000ml，加熱回流2小時，放冷，轉移至250ml量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2ml，置15ml離心管中，精密加入95％乙醇，搖勻，冷藏1小時，取出，離心20分鐘，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉移至25ml量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得供試品溶液1。

2.1.2供試品溶液2的制備

取鐵皮石斛2樣品，置烘箱中50℃，干燥，粉碎，過三號篩，取過濾后藥材粉末，揮干溶劑，加水2000ml，加熱回流2小時，放冷，轉移至250ml量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2ml，置15ml離心管中，精密加入95％乙醇，搖勻，冷藏1小時，取出，離心20分鐘，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉移至25ml量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得供試品溶液2。

2.2對照品溶液的制備

精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖適量，加水制成99mg/l溶液，備用。

2.3標準曲線制備

精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml置10ml具塞試管中，加水至1.0ml，精密加入5％苯酚溶液1ml(i臨用前現(xiàn)配制)，搖勻，再精密加入硫酸5ml，搖勻，置沸水浴中加熱20分鐘，取出，放入冰水浴中冷卻5分鐘，以相應的試劑為空白，在488nm波長處測定吸光度，以吸光度y為縱坐標，濃度x(g/l)為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為：y＝11.772x-0.1492，r＝0.9995。結果表明多糖在0.02-0.10g/l范圍內(nèi)線性關系良好。

2.4測定法

分別精密量取供試品溶液1和供試品溶液2各0.5ml，置10ml具塞試管中，加水至1ml，按“2.3”標準曲線的制備項下的方法，自“精密加入5％苯酚溶液1ml”起，依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的含量，計算，即得。

2.5精密度試驗

精密吸取葡萄糖對照品溶液6份，每份0.6ml，按照“2.4”項下的方法測定吸光度。測定結果，rsd分別為1.60％和1.62％，精密度良好。

2.6重復性試驗

按上述方法制備6份供試品溶液1和供試品溶液2，照按上述方法測定吸光度。測定結果，rsd分別為2.70％和2.71％，重復性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗

分別取同一供試品溶液1和供試品溶液2，在室溫下放置，分別于10min、30min、1h、2h、4h、6h后按上述方法測定吸光度。測定結果，rsd分別為2.70％和2.73％，表明供試品溶液1和供試品溶液2均在6小時內(nèi)穩(wěn)定。

2.8加樣回收率試驗

稱取已知含量(12.5％)的鐵皮石斛1粉末6份，每份約1.65g，精密稱定。準確加入葡萄糖對照品溶液(濃度為0.099g/l)2ml，按上述方法制備供試品溶液1，按上述方法測定，計算多糖含量，結果平均回收率為94.9％，rsd為2.7％。

稱取已知含量(12.5％)的鐵皮石斛2粉末6份，每份約1.65g，精密稱定。準確加入葡萄糖對照品溶液(濃度為0.099g/l)2ml，按上述方法制備供試品溶液2，按上述方法測定，計算多糖含量，結果平均回收率為93.9％，rsd為2.6％。

2.9樣品測定

按上述供試品溶液1和供試品溶液2的制備方法和測定條件，測定6份鐵皮石斛1樣品和6份鐵皮石斛2樣品中多糖的含量，記錄結果，結果取平均值，結果見表1。

表1多糖含量測定結果

由表可知，本發(fā)明方法進行提取得到的鐵皮石斛多糖的含量較高。鐵皮石斛的品質好。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明對靈芝的具體加工工藝進行了改進，使得靈芝的有效成分多糖容易測出，且測出的多糖含量高，使得靈芝的藥效好。

具體實施方式

實施例1。

一種鐵皮石斛的提取方法：取前處理后的鐵皮石斛，洗凈后加8倍量的水和11倍量的檸檬酸，浸泡2h后，煎煮2次，每次1.5h，均趁熱濾過，合并濾液，濾液70-80℃0.07mpa下減壓薄膜濃縮成浸膏，浸膏干燥后粉碎，即得。

所述前處理為：具體包括以下步驟：

(1)取鐵皮石斛種子，洗凈后，在超凈工作臺上采用75％的乙醇消毒10min后，再用無菌水沖洗3次，置于滅菌的濾紙上吸干后，接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上，在晝溫為20-25℃，夜溫18-20℃條件下，暗培養(yǎng)，直至種子萌發(fā)；所述萌發(fā)培養(yǎng)基由蔗糖5kg、瓊脂10kg、黃連15kg和貝母15kg按下述方法制成：黃連和貝母加11倍量的水煎煮2.5h后，過濾，取濾渣，干燥，粉碎成粗顆粒，粗顆粒與蔗糖、瓊脂混勻，即得；

(2)待種子萌發(fā)后，將1-2cm高的單苗接種到增殖培養(yǎng)基上，在23-28℃，光強1500-2500lx下每天光照8h，直至鐵皮石斛苗高為5-8cm；所述增殖培養(yǎng)基由蔗糖5kg、紅薯泥15kg、黃豆渣10kg、naa8kg、當歸15kg和麻黃15kg按下述方法制成：當歸和麻黃加11倍量的水煎煮2.5h后，過濾，取濾渣，干燥，粉碎成粗顆粒，粗顆粒與蔗糖、紅薯泥、黃豆渣和naa混勻，即得；

(3)移栽，移栽時間為4-6月，苗高為5-8cm的鐵皮石斛苗，先用清水洗凈幼苗根部的培養(yǎng)基，再用0.4％的高錳酸鉀稀釋液浸根消毒，按行距為10-15cm鐵皮石斛苗種于基質中，確?；|覆蓋住根系，使根系與基質接觸；所述基質由蔗糖5kg、紅薯泥15kg、土豆泥15kg、玉米糊10kg、黃豆渣10kg、熟地15kg、丹皮10kg、苦參15kg、女貞子10kg和吳茱萸15kg按下述方法制成：熟地、丹皮、苦參、女貞子和吳茱萸加11倍量的水煎煮2.5h后，過濾，取濾渣，干燥，粉碎成粗顆粒，粗顆粒與蔗糖、紅薯泥、土豆泥、玉米糊和黃豆渣混勻，即得；

(4)種植后每隔4天噴施1次菌靈液，連續(xù)噴施25天；之后采用噴施方式進行澆水，澆水次數(shù)為1-3月份2-3天1次，3-6月份1-2天1次，6-9月份5-6天1次，9-12月份2-3天1次，11月至次年3月，采收，即可。

實施例2.

一種鐵皮石斛的提取方法：取前處理后的鐵皮石斛，洗凈后加10倍量的水和12倍量的檸檬酸，浸泡3h后，煎煮3次，每次2h，均趁熱濾過，合并濾液，濾液70-80℃0.07mpa下減壓薄膜濃縮成浸膏，浸膏干燥后粉碎，即得。

所述前處理為：具體包括以下步驟：

(1)取鐵皮石斛種子，洗凈后，在超凈工作臺上采用80％的乙醇消毒15min后，再用無菌水沖洗4次，置于滅菌的濾紙上吸干后，接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上，在晝溫為20-25℃，夜溫18-20℃條件下，暗培養(yǎng)，直至種子萌發(fā)；所述萌發(fā)培養(yǎng)基由蔗糖6kg、瓊脂15kg、黃連20kg和貝母20kg按下述方法制成：黃連和貝母加12倍量的水煎煮3h后，過濾，取濾渣，干燥，粉碎成粗顆粒，粗顆粒與蔗糖、瓊脂混勻，即得；

(2)待種子萌發(fā)后，將1-2cm高的單苗接種到增殖培養(yǎng)基上，在23-28℃，光強1500-2500lx下每天光照10h，直至鐵皮石斛苗高為5-8cm；所述增殖培養(yǎng)基由蔗糖6kg、紅薯泥20kg、黃豆渣15kg、naa10kg、當歸20kg和麻黃20kg按下述方法制成：當歸和麻黃加12倍量的水煎煮3h后，過濾，取濾渣，干燥，粉碎成粗顆粒，粗顆粒與蔗糖、紅薯泥、黃豆渣和naa混勻，即得；

(3)移栽，移栽時間為4-6月，苗高為5-8cm的鐵皮石斛苗，先用清水洗凈幼苗根部的培養(yǎng)基，再用0.5％的高錳酸鉀稀釋液浸根消毒，按行距為10-15cm鐵皮石斛苗種于基質中，確?；|覆蓋住根系，使根系與基質接觸；所述基質由蔗糖6kg、紅薯泥20kg、土豆泥20kg、玉米糊15kg、黃豆渣15kg、熟地20kg、丹皮15kg、苦參20kg、女貞子15kg和吳茱萸20kg按下述方法制成：熟地、丹皮、苦參、女貞子和吳茱萸加12倍量的水煎煮3h后，過濾，取濾渣，干燥，粉碎成粗顆粒，粗顆粒與蔗糖、紅薯泥、土豆泥、玉米糊和黃豆渣混勻，即得；

(4)種植后每隔3-5天噴施1次菌靈液，連續(xù)噴施30天；之后采用噴施方式進行澆水，澆水次數(shù)為1-3月份2-3天1次，3-6月份1-2天1次，6-9月份5-6天1次，9-12月份2-3天1次，11月至次年3月，采收，即可。

實施例3.

取前處理后的鐵皮石斛，洗凈后加6倍量的水和10倍量的檸檬酸，浸泡1h后，煎煮2次，每次1h，均趁熱濾過，合并濾液，濾液70-80℃0.07mpa下減壓薄膜濃縮成浸膏，浸膏干燥后粉碎，即得。

所述前處理為：具體包括以下步驟：

(1)取鐵皮石斛種子，洗凈后，在超凈工作臺上采用70％的乙醇消毒5min后，再用無菌水沖洗3次，置于滅菌的濾紙上吸干后，接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上，在晝溫為20-25℃，夜溫18-20℃條件下，暗培養(yǎng)，直至種子萌發(fā)；所述萌發(fā)培養(yǎng)基由蔗糖3kg、瓊脂5kg、黃連10kg和貝母10kg按下述方法制成：黃連和貝母加10倍量的水煎煮2h后，過濾，取濾渣，干燥，粉碎成粗顆粒，粗顆粒與蔗糖、瓊脂混勻，即得；

(2)待種子萌發(fā)后，將1-2cm高的單苗接種到增殖培養(yǎng)基上，在23-28℃，光強1500-2500lx下每天光照9h，直至鐵皮石斛苗高為5-8cm；所述增殖培養(yǎng)基由蔗糖3kg、紅薯泥10kg、黃豆渣5kg、naa5kg、當歸10kg和麻黃10kg按下述方法制成：當歸和麻黃加10倍量的水煎煮2h后，過濾，取濾渣，干燥，粉碎成粗顆粒，粗顆粒與蔗糖、紅薯泥、黃豆渣和naa混勻，即得；

(3)移栽，移栽時間為4-6月，苗高為5-8cm的鐵皮石斛苗，先用清水洗凈幼苗根部的培養(yǎng)基，再用0.3％的高錳酸鉀稀釋液浸根消毒，按行距為10-15cm鐵皮石斛苗種于基質中，確保基質覆蓋住根系，使根系與基質接觸；所述基質由蔗糖3kg、紅薯泥10kg、土豆泥10kg、玉米糊5kg、黃豆渣5kg、熟地10kg、丹皮5kg、苦參10kg、女貞子5kg和吳茱萸10kg按下述方法制成：熟地、丹皮、苦參、女貞子和吳茱萸加10倍量的水煎煮2h后，過濾，取濾渣，干燥，粉碎成粗顆粒，粗顆粒與蔗糖、紅薯泥、土豆泥、玉米糊和黃豆渣混勻，即得；

(4)種植后每隔3天噴施1次菌靈液，連續(xù)噴施20天；之后采用噴施方式進行澆水，澆水次數(shù)為1-3月份2-3天1次，3-6月份1-2天1次，6-9月份5-6天1次，9-12月份2-3天1次，11月至次年3月，采收，即可。