本發(fā)明屬于植物種質資源保存技術領域，具體地，涉及一種提高低溫(-18℃至-20℃)保存后尼泊爾野桐種子胚乳活力的方法。
背景技術：
尼泊爾野桐(mallotusnepalensismüll.arg.)是大戟科(euphorbiaceae)野桐屬(mallotuslour.)落葉灌木或小喬木樹種。分布于西藏云南海拔1700到2500米的山坡或溝谷中，國外主要分布在不丹、印度東北、緬甸及尼泊爾，國內研究報道較少，國外有報道其提取物具有溫和抑制中樞神經的作用。未見尼泊爾野桐種子儲藏方面的研究報道。
將正常型種子干燥后低溫(-18℃至-20℃)保藏可以極大的延長其壽命，這在國際上已經形成共識，并且基于這一理論建立了多個農作物及野生植物種子庫；但一些植物的種子在冷藏后胚乳的活力會發(fā)生變化，而胚乳也是一種重要的種質資源，并且是天然的三倍體育種材料。因此提高及改善低溫冷藏后種子胚乳的活力對于長期高效保存及合理利用植物種質資源有著重要的意義。
目前對種子進行活力檢測的方法主要有萌發(fā)及氯化三苯基四氮唑(ttc)染色法(也叫tz染色法)。在保存實踐中本發(fā)明發(fā)現冷藏后尼泊爾野桐種子幾乎不能萌發(fā)，對其進行ttc染色后發(fā)現，胚可以被染成紅色，而胚乳不能染色；因此本發(fā)明判斷可能是由于胚乳在冷藏過程中發(fā)生某種變化而導致的活力下降，進而影響種子的整體活力及萌發(fā)率；為此發(fā)明了本發(fā)明的方法，用以提高胚乳的活力。胚乳活力的評價辦法以ttc染色為主，輔以種子萌發(fā)率為參考，以保證實驗結果的嚴謹性及可信度。
技術實現要素：
本發(fā)明的目的在于針對現有技術中在低溫(-18℃至-20℃)保存一段時間后的尼泊爾野桐種子胚乳活力大幅下降甚至幾乎完全喪失的技術難題，提供一種簡便高效提高低溫保存后尼泊爾野桐種子胚乳活力的方法。為實現該物種的長期有效保存，特別是胚乳這種天然的三倍體種質資源的長期有效保存及高效利用提供技術支持。
為了實現本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術方案：
一種提高低溫保存后尼泊爾野桐種子胚乳活力的方法，包括如下步驟：
(1)將在-18℃至-20℃冷藏保存后的種子連同其密閉容器取出，在溫度為15℃、相對濕度15％的環(huán)境中放置24小時回溫；
(2)將回溫后的種子從密閉容器中取出，放置在溫度為45℃的培養(yǎng)箱中，熱處理6小時后取出；
(3)將步驟(2)處理后的種子取出，待種子溫度恢復到室溫后放置于1％的瓊脂培養(yǎng)基上，放置于20℃培養(yǎng)間24小時；
(4)將上述步驟(3)處理后的種子切破種皮及胚乳；
(5)將上述步驟(4)處理后的種子浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑(ttc)溶液中，放置于30℃黑暗條件下48小時；
(6)將上述步驟(5)處理后的種子切開觀測胚乳染色情況，具有活力的胚乳顯示均勻的紅色。
根據所述的一種提高低溫保存后尼泊爾野桐種子胚乳活力的方法，其中所述步驟(1)在-18℃至-20℃冷藏保存的種子是采集成熟飽滿的種子，先將種子置于溫度為15℃、相對濕度15％的環(huán)境中直到種子的平衡相對濕度達到15％(此時種子的含水量通常低于10％)，然后再將種子放入密閉容器中，保存于-18℃至-20℃。
本發(fā)明為一種提高低溫保存后尼泊爾野桐種子胚乳活力的方法，更具體的步驟是：
采集成熟飽滿的種子，將種子置于溫度為15℃、相對濕度15％的環(huán)境中，至種子的平衡相對濕度達到15％時，將種子放入密閉容器，保存于-18℃至-20℃中；種子保存一段時間后，將裝有種子的密閉容器取出，在溫度為15℃、相對濕度15％的環(huán)境中放置24小時回溫；隨后將種子從容器中取出，放置在培養(yǎng)箱溫度為45℃的培養(yǎng)箱中，熱處理6小時后取出，待種子溫度恢復到室溫后放置于1％的瓊脂培養(yǎng)基上，放置于20℃培養(yǎng)間24小時；處理后的種子切破種皮及胚乳，浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑(ttc)溶液中，放置于30℃黑暗條件下48小時；取出種子切開觀測胚乳染色情況，具有活力的胚乳顯示均勻的紅色。
具體實施方式
下面用本發(fā)明實施例來進一步說明本發(fā)明的實質性內容，但并不以此來限定本發(fā)明。
實施例1：
1.材料和方法：
1.1研究材料：
2014年10月，安徽黃山徽州區(qū)富溪鄉(xiāng)新田村采集成熟的新鮮尼泊爾野桐(mallotusnepalensis)種子。采集后運回昆明植物研究所西南野生生物種質資源庫種子保藏中心。
1.2研究方法：
1.2.1干燥冷藏及冷藏后的回溫：將1.1步驟采集到的種子置于15℃，15％相對濕度的干燥間中干燥。定期以rotronicltd.公司生產的hygrolabc1unit相對濕度測定儀結合同一公司生產的rotronichc2-aw探頭對種子相對濕度進行測定，待平衡相對濕度達到15％后裝入密閉的容器中。2015年9月14日將裝有種子的密閉容器放入-18℃至-20℃冷藏。冷藏處理1年后將裝有種子的密閉容器取出。放入15℃，15％相對濕度的干燥間中24小時回溫后打開裝有種子的容器，隨機取出實驗所需種子。
1.2.2實驗設計：將種子分為2組處理，分別為對照組和冷藏后熱處理組；熱處理溫度設置為45、60及70℃，時間為6個小時。每個處理3個重復，每個重復20粒種子。
1.2.3熱處理方法：將種子放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱溫度設定為45、60及70℃。處理6小時后隨機取出60粒種子用于檢測胚乳活力。對于45及60℃的種子，同時隨機取出60粒做萌發(fā)實驗，以萌發(fā)率佐證熱處理對胚乳活力的影響。
1.2.4ttc染色：待熱處理后的種子溫度恢復到室溫，將種子放置于1％的瓊脂培養(yǎng)基上，放置于20℃培養(yǎng)間24小時；取出種子切破種皮及胚乳，并將種子浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑(ttc)溶液中，放置于30℃黑暗條件下48小時，染色完成后取出種子，用吸水紙吸干表面殘余溶液，將種子切開，觀測胚乳染色情況，具有活力的胚乳顯示均勻的紅色。
1.2.5萌發(fā)：對對照組及冷藏后45及60℃熱處理6小時的種子進行萌發(fā)實驗，以佐證胚乳活力變化。將種子播種于含有200毫克每升赤霉素的1％瓊脂培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基裝入透明自封袋中防止水分散失，然后置于于20℃的光照培養(yǎng)箱中，光照強度為1000勒克斯，光周期為12小時光照/12小時黑暗。每間隔2-3天檢查一次萌發(fā)，胚根伸長超過5mm即認為種子萌發(fā)，將萌發(fā)種子取出，并記錄萌發(fā)數量；實驗開始4周后連續(xù)2周無萌發(fā)即結束實驗。
1.2.6數據分析：利用spss16.0軟件對胚乳染色比例數據進行分析，采用one-wayanova進行方差分析，并用s-n-k法對不同處理時間的染色比例做多重比較。
2.結果
2.1熱處理對采自安徽黃山冷藏后的尼泊爾野桐種子胚乳活力的影響：
表1熱處理對冷藏后安徽黃山尼泊爾野桐種子胚乳染色率(％)及萌發(fā)率(％)的影響
注：數字為平均值±標準誤，不同字母表示不同處理間的染色率具有顯著差異
由表1可以看出，-20℃下冷藏1年后未經熱處理的種子胚乳染色率只有4.2％，對應的種子萌發(fā)率為0；45℃處理6小時后胚乳染色比例即開始升高，萌發(fā)率也提高到28.3％，隨著溫度的上升到60℃，胚乳活力及萌發(fā)均未見顯著上升，70℃與45及60℃相比胚乳活力有顯著下降。
綜合考慮效果及能耗，本發(fā)明選定45℃處理6小時，能有效的提高胚乳活力，并在以下實施例中采用45℃處理6小時的方法。
實施例2：
1.材料和方法：
1.1研究材料：
2012年9月4日云南省文山州文山縣采集成熟的新鮮尼泊爾野桐(mallotusnepalensis)種子。采集后運回昆明植物研究所西南野生生物種質資源庫種子保藏中心。
1.2研究方法：
1.2.1干燥冷藏及冷藏后的回溫：將1.1采集到的種子置于15℃，15％相對濕度的干燥間中干燥。定期以rotronicltd.公司生產的hygrolabc1unit相對濕度測定儀結合同一公司生產的rotronichc2-aw探頭對種子相對濕度進行測定，待平衡相對濕度達到15％后裝入密閉的容器中。2013年8月6日將裝有種子的密閉容器放入-18℃至-20℃冷藏。冷藏3年2個月后將裝有種子的容器取出。放入15℃，15％相對濕度的干燥間中24小時回溫后打開裝有種子的容器，隨機取出實驗所需種子。
1.2.2實驗設計：將種子分為2組處理，分別為對照組和熱處理組；熱處理溫度設置45℃，處理6小時。每個處理3個重復，每個重復20粒種子。
1.2.3熱處理方法：將種子放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱溫度設定為45℃。處理6小時后取出60粒種子用于ttc染色實驗。
1.2.4ttc染色：待熱處理后的種子溫度恢復到室溫，將種子放置于1％的瓊脂培養(yǎng)基上，放置于20℃培養(yǎng)間24小時；取出種子切破種皮及胚乳，并將種子浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑(ttc)溶液中，放置于30℃黑暗條件下48小時，染色完成后取出種子，用吸水紙吸干表面殘余溶液，將種子切開，觀測胚乳染色情況，具有活力的胚乳顯示均勻的紅色。
1.2.6數據分析：利用spss16.0軟件對胚乳染色率數據進行分析，采用paired-samplesttest進行方差分析。
2.結果
2.1熱處理對冷藏后云南文山尼泊爾野桐種子胚乳活力的影響。
表2熱處理對冷藏后云南文山尼泊爾野桐種子胚乳染色率(％)的影響
注：數字為平均值±標準誤，不同字母表示不同處理間的染色率具有顯著差異
由表2可以看出，-20℃下冷藏3年2個月的尼泊爾野桐種子，未經熱處理的種子胚乳染色率為0；經45℃熱處理后，胚乳染色率提高到42.4％，說明熱處理有效提高的-20℃冷藏后的種子胚乳活力。
實施例3：
1.材料和方法：
1.1研究材料：
2009年10月08日，云南普洱鎮(zhèn)沅九甲鄉(xiāng)采集成熟的新鮮尼泊爾野桐(mallotusnepalensis)種子。采集后運回昆明植物研究所西南野生生物種質資源庫種子保藏中心。
1.2研究方法：
1.2.1干燥冷藏及冷藏后的回溫：將1.1采集到的種子置于15℃，15％相對濕度的干燥間中干燥。定期以rotronicltd.公司生產的hygrolabc1unit相對濕度測定儀結合同一公司生產的rotronichc2-aw探頭對種子相對濕度進行測定，待平衡相對濕度達到15％后裝入密閉的容器中。2011年9月將裝有種子的密閉容器放入-18℃至-20℃冷藏。冷藏5年后將裝有種子的容器取出。放入15℃，15％相對濕度的干燥間中24小時回溫后打開裝有種子的容器，根據實驗需要隨機取出相應數量的種子。
1.2.2實驗設計：將種子分為2組處理，分別為對照組和熱處理組；熱處理溫度設置45℃，處理6小時。每個處理3個重復，每個重復20粒種子。
1.2.3熱處理方法：將種子放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱溫度設定為45℃。處理6小時后取出60粒種子用于ttc染色實驗。
1.2.4ttc染色：待熱處理后的種子溫度恢復到室溫，將種子放置于1％的瓊脂培養(yǎng)基上，放置于20℃培養(yǎng)間24小時；取出種子切破種皮及胚乳，并將種子浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑(ttc)溶液中，放置于30℃黑暗條件下48小時，染色完成后取出種子，用吸水紙吸干表面殘余溶液，將種子切開，觀測胚乳染色情況，具有活力的胚乳顯示均勻的紅色。
1.2.6數據分析：利用spss16.0軟件對胚乳染色率數據進行分析，采用paired-samplesttest進行方差分析。
2.結果與討論
2.1熱處理對冷藏后云南普洱尼泊爾野桐種子胚乳染色率的影響。
表4熱處理對冷藏后云南普洱尼泊爾野桐種子胚乳染色率(％)的影響
注：數字為平均值±標準誤，不同字母表示不同處理間的染色率具有顯著差異
由表4可以看出，-20℃下冷藏5年的尼泊爾野桐種子，未經熱處理的種子胚乳染色率為0；經45℃熱處理后，胚乳染色率達到了48.1％，表明活力得到顯著提高。
3、本發(fā)明的積極效果如下：
與現有技術相比，本發(fā)明顯著提高了不同產地(安徽及云南)，干燥后低溫(-18℃至-20℃)下儲存不同時間(1年、3年2個月及5年)的尼泊爾野桐種子胚乳的活力。較好的解決了尼泊爾野桐種子低溫保藏后胚乳活力降低的問題。且處理方法簡便易行，45℃處理6個小時即有顯著效果，而且無任何危險性及毒副作用。本發(fā)明有利于實現該物種在種子庫條件下的長期保存，且對于胚乳這一天然三倍體種質資源的長期有效保存和合理利用提供了技術支持。