本發(fā)明涉及牧草栽培領(lǐng)域，具體涉及一種白三葉的栽培方法。
背景技術(shù)：
白三葉(trifoliumrepens)是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的多年生豆科牧草，產(chǎn)草量高、品質(zhì)好，各種家畜均喜采食，在草地中兼有提供優(yōu)質(zhì)飼草和固定土壤氮素的雙重作用。此外，白三葉也是環(huán)境保護(hù)和生態(tài)建設(shè)中重要的水土保持和庭院綠化植物。但是，在生產(chǎn)中因干旱導(dǎo)致的減產(chǎn)或枯死現(xiàn)象日益突出。因此，在白三葉栽培中，急需探尋提高白三葉抗旱性的栽培措施與方法。
干旱脅迫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的主要非生物逆境因子之一。因全球氣候變化，我國(guó)北方大多數(shù)地區(qū)的持續(xù)干旱形勢(shì)可能更加嚴(yán)峻，而南方的季節(jié)性和持續(xù)性干旱亦愈益凸現(xiàn)，導(dǎo)致我國(guó)農(nóng)作物干旱受災(zāi)面積逐年增加。
農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，通過施用外源添加物提高作物抗旱性具有操作簡(jiǎn)單、見效快等特點(diǎn)，在果樹、蔬菜、小麥等作物上已有大量報(bào)道。然而，目前有關(guān)外源添加提高植物抗逆性的研究報(bào)道絕大多數(shù)采用的是單一的添加物，而國(guó)內(nèi)外通過外源添加提高白三葉抗旱性的相關(guān)研究少有報(bào)道，有效的添加組合尤其罕見。
因此，針對(duì)生產(chǎn)栽培中白三葉抗旱性差，對(duì)水分需求量大，干旱脅迫對(duì)白三葉生長(zhǎng)及產(chǎn)量造成的損失極為嚴(yán)重，且當(dāng)前缺乏能有效改善白三葉抗旱性且施用簡(jiǎn)單的外源添加及其組合，急需探尋提高白三葉在干旱下的存活率和生長(zhǎng)量的簡(jiǎn)單有效手段，以期為生產(chǎn)中白三葉的抗旱栽培提供實(shí)用、有效的途徑和方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠顯著提高白三葉抗旱性的白三葉的栽培方法。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：該白三葉的栽培方法，包括以下步驟：
a、選取白三葉種子，并對(duì)選取的白三葉種子進(jìn)行消毒處理；
b、將經(jīng)過消毒處理的白三葉種子撒入育苗盤中，并在育苗盤中加入去離子水；
c、將育苗盤放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-9天進(jìn)行種子萌發(fā)，并每天更換育苗盤內(nèi)的去離子水，所述培養(yǎng)箱內(nèi)白天的溫度為21-25℃，培養(yǎng)箱內(nèi)晚上的溫度為17-21℃，所述培養(yǎng)箱內(nèi)的相對(duì)濕度為70-80％，培養(yǎng)箱內(nèi)的光照強(qiáng)度為280-320μmol·m-2·s-1；
d、當(dāng)種子萌發(fā)結(jié)束后，將育苗盤內(nèi)的去離子水更換成霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)21-25天進(jìn)行育苗處理，并每隔一天更換育苗盤內(nèi)的霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液；
e、制備外源添加劑，所述外源添加劑包括溶劑和溶質(zhì)，所述溶劑為霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液，所述溶質(zhì)包括殼聚糖(cts)和精胺(spm)，所述cts的濃度為0.5g/l-1.5g/l，所述spm的濃度為50.58mg/l-151.74mg/l；
f、將制備的外源添加劑施加在白三葉幼苗的根部即可。
進(jìn)一步的是，在步驟a中，所述消毒處理的過程如下所述：首先，采用0.1％氯化汞對(duì)白三葉種子進(jìn)行連續(xù)消毒，所述連續(xù)消毒的時(shí)間為5分鐘，連續(xù)消毒后采用蒸餾水進(jìn)行4次漂洗。
進(jìn)一步的是，在步驟b中，所述育苗盤中鋪滿石英砂，育苗盤大小為長(zhǎng)35cm、寬25cm、高10cm。
進(jìn)一步的是，在步驟c中，育苗盤放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的時(shí)間為7天，所述培養(yǎng)箱內(nèi)白天的溫度為23℃，培養(yǎng)箱內(nèi)晚上的溫度為19℃，所述培養(yǎng)箱內(nèi)的相對(duì)濕度為75％，培養(yǎng)箱內(nèi)的光照強(qiáng)度為300μmol·m-2·s-1。
進(jìn)一步的是，在步驟d中，進(jìn)行育苗處理的時(shí)間為23天。
進(jìn)一步的是，在步驟e中，所述cts的濃度為1g/l，所述spm的濃度為101.17mg/l。
本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明所述的白三葉的栽培方法通過對(duì)選取的白三葉種子進(jìn)行消毒處理；然后將其撒入育苗盤中，并在育苗盤中加入去離子水；放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-9天進(jìn)行種子萌發(fā)，當(dāng)種子萌發(fā)結(jié)束后，將育苗盤內(nèi)的去離子水更換成霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)21-25天進(jìn)行育苗處理，育苗處理結(jié)束后，白三葉長(zhǎng)出幼苗，然后在幼苗的根部施加外源添加劑，所述外源添加劑包括溶劑和溶質(zhì)，所述溶劑為霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液，所述溶質(zhì)包括殼聚糖(cts)和精胺(spm)，所述cts的濃度為0.5g/l-1.5g/l，所述spm的濃度為50.58mg/l-151.74mg/l；上述抗旱組合物形成的外源添加劑可以有效緩解干旱脅迫下白三葉生長(zhǎng)受阻、葉片萎蔫，相對(duì)于單劑具有顯著的增效效應(yīng)，可以顯著的提高白三葉的抗旱性。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
該白三葉的栽培方法，包括以下步驟：
a、選取白三葉種子，并對(duì)選取的白三葉種子進(jìn)行消毒處理；
b、將經(jīng)過消毒處理的白三葉種子撒入育苗盤中，并在育苗盤中加入去離子水；
c、將育苗盤放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-9天進(jìn)行種子萌發(fā)，并每天更換育苗盤內(nèi)的去離子水，所述培養(yǎng)箱內(nèi)白天的溫度為21-25℃，培養(yǎng)箱內(nèi)晚上的溫度為17-21℃，所述培養(yǎng)箱內(nèi)的相對(duì)濕度為70-80％，培養(yǎng)箱內(nèi)的光照強(qiáng)度為280-320μmol·m-2·s-1；
d、當(dāng)種子萌發(fā)結(jié)束后，將育苗盤內(nèi)的去離子水更換成霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)21-25天進(jìn)行育苗處理，并每隔一天更換育苗盤內(nèi)的霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液；
e、制備外源添加劑，所述外源添加劑包括溶劑和溶質(zhì)，所述溶劑為霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液，所述溶質(zhì)包括殼聚糖(cts)和精胺(spm)，所述cts的濃度為0.5g/l-1.5g/l，所述spm的濃度為50.58mg/l-151.74mg/l；
f、將制備的外源添加劑施加在白三葉幼苗的根部即可。
本發(fā)明所述的白三葉的栽培方法通過對(duì)選取的白三葉種子進(jìn)行消毒處理；然后將其撒入育苗盤中，并在育苗盤中加入去離子水；放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-9天進(jìn)行種子萌發(fā)，當(dāng)種子萌發(fā)結(jié)束后，將育苗盤內(nèi)的去離子水更換成霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)21-25天進(jìn)行育苗處理，育苗處理結(jié)束后，白三葉長(zhǎng)出幼苗，然后在幼苗的根部施加外源添加劑，所述外源添加劑包括溶劑和溶質(zhì)，所述溶劑為霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液，所述溶質(zhì)包括殼聚糖(cts)和精胺(spm)，所述cts的濃度為0.5g/l-1.5g/l，所述spm的濃度為50.58mg/l-151.74mg/l；上述抗旱組合物形成的外源添加劑可以有效緩解干旱脅迫下白三葉生長(zhǎng)受阻、葉片萎蔫，相對(duì)于單劑具有顯著的增效效應(yīng)，可以顯著的提高白三葉的抗旱性。
在上述實(shí)施方式中，為了保證白三葉種子的消毒處理效果，在步驟a中，所述消毒處理的過程如下所述：首先，采用0.1％氯化汞對(duì)白三葉種子進(jìn)行連續(xù)消毒，所述連續(xù)消毒的時(shí)間為5分鐘，連續(xù)消毒后采用蒸餾水進(jìn)行4次漂洗。
為了保證白三葉種子的發(fā)芽率，在步驟b中，所述育苗盤中鋪滿石英砂。同時(shí)，為了提高白三葉種子的發(fā)芽率，在步驟c中，育苗盤放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的時(shí)間為7天，所述培養(yǎng)箱內(nèi)白天的溫度為23℃，培養(yǎng)箱內(nèi)晚上的溫度為19℃，所述培養(yǎng)箱內(nèi)的相對(duì)濕度為75％，培養(yǎng)箱內(nèi)的光照強(qiáng)度為300μmol·m-2·s-1。
為了使白三葉幼苗長(zhǎng)出健康完整的幼苗，在步驟d中，進(jìn)行育苗處理的時(shí)間為23天。
為了使白三葉的抗旱性最大限度的提高，在步驟e中，所述cts的濃度為1g/l，所述spm的濃度為101.17mg/l。
對(duì)比試驗(yàn)1
試驗(yàn)材料：以干旱敏感型的‘拉丁諾’白三葉作為供試材料。
材料培育：種子經(jīng)0.1％氯化汞消毒5分鐘，蒸餾水漂洗4次后備用。消毒后的種子0.1g均勻地撒在長(zhǎng)35cm、寬25cm、高10cm鋪滿石英砂的育苗盤中，倒入去離子水并將育苗盤置于培養(yǎng)箱中(23/19℃，白天/黑夜；75％的相對(duì)濕度；300μmol·m-2·s-1的光照強(qiáng)度)讓種子進(jìn)行為期7d的萌發(fā)，每天更換去離子水。待種子萌發(fā)完成后，倒出所有的去離子水更換為霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔一天更換一次營(yíng)養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)23天(2片成熟葉片)時(shí)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的材料用于試驗(yàn)。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)：①cts濃度水平：設(shè)0g/l(對(duì)照)、0.50g/l、0.75g/l、1.00g/l、1.25g/l、1.50g/l、5個(gè)濃度梯度，共計(jì)6個(gè)處理，每處理4次重復(fù)。
外源添加及干旱脅迫處理：用培育材料的霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液作為溶劑分別配制上述不同濃度的cts溶液，并加入20％(w/v)聚乙二醇6000(peg-6000)滲透劑模擬干旱脅迫，現(xiàn)配現(xiàn)用。在霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液中加入相應(yīng)濃度的cts預(yù)處理6天后，更換為含有20％(w/v)peg-6000的處理液(含相應(yīng)濃度的cts)進(jìn)行干旱脅迫處理。處理期間，每天更換一次處理液，每次300ml。所有材料置于智能光照培養(yǎng)箱中，條件同材料培育。從更換為含有20％(w/v)peg-6000的處理液時(shí)開始計(jì)時(shí)，調(diào)查白三葉葉片在中度脅迫(7天)和重度脅迫(14天)的萎蔫程度。所述萎蔫程度采用1、2、3、4、5、6、7、8、9表示，其中1表示萎蔫程度最輕，9表示萎蔫程度較重，結(jié)果見表1。
表1不同cts濃度根施預(yù)處理提高白三葉抗旱性效應(yīng)
由表1可以看出，根施cts1.0g/l時(shí)，提高白三葉抗旱性的效果較好，與對(duì)照相比，在同等滲透脅迫強(qiáng)度下可延遲白三葉葉片萎蔫。
對(duì)比試驗(yàn)2
試驗(yàn)材料：以干旱敏感型的‘拉丁諾’白三葉作為供試材料。
材料培育：種子經(jīng)0.1％氯化汞消毒5分鐘，蒸餾水漂洗4次后備用。消毒后的種子0.1g均勻地撒在長(zhǎng)35cm、寬25cm、高10cm鋪滿石英砂的育苗盤中，倒入去離子水并將育苗盤置于培養(yǎng)箱中(23/19℃，白天/黑夜；75％的相對(duì)濕度；300μmol·m-2·s-1的光照強(qiáng)度)讓種子進(jìn)行為期7d的萌發(fā)，每天更換去離子水。待種子萌發(fā)完成后，倒出所有的去離子水更換為霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔一天更換一次營(yíng)養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)23天(2片成熟葉片)時(shí)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的材料用于試驗(yàn)。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)：①spm濃度水平：設(shè)0mg/l(對(duì)照)、20.23mg/l、50.58mg/l、101.17mg/l、151.74mg/l、202.34mg/l，5個(gè)濃度梯度，共計(jì)6個(gè)處理，每處理4次重復(fù)。
外源添加及干旱脅迫處理：用培育材料的霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液作為溶劑分別配制上述不同濃度的spm溶液，并加入20％(w/v)聚乙二醇6000(peg-6000)滲透劑模擬干旱脅迫，現(xiàn)配現(xiàn)用。在霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液中加入相應(yīng)濃度的spm預(yù)處理6天后，更換為含有20％(w/v)peg-6000的處理液(含相應(yīng)濃度的spm)進(jìn)行干旱脅迫處理。處理期間，每天更換一次處理液，每次300ml。所有材料置于智能光照培養(yǎng)箱中，條件同材料培育。從更換為含有20％(w/v)peg-6000的處理液時(shí)開始計(jì)時(shí)，調(diào)查白三葉葉片在中度脅迫(7天)和重度脅迫(14天)的萎蔫程度。所述萎蔫程度采用1、2、3、4、5、6、7、8、9表示，其中1表示萎蔫程度最輕，9表示萎蔫程度較重，結(jié)果見表2。
表2不同spm濃度根施預(yù)處理提高白三葉抗旱性效應(yīng)
由表2可以看出，根施spm101.17mg/l時(shí)，提高白三葉抗旱性的效果較好，與對(duì)照相比，在同等滲透脅迫強(qiáng)度下可延遲白三葉葉片萎蔫。
實(shí)施例
試驗(yàn)材料：以干旱敏感型的‘拉丁諾’白三葉作為供試材料。
材料培育：種子經(jīng)0.1％氯化汞消毒5分鐘，蒸餾水漂洗4次后備用。消毒后的種子0.1g均勻地撒在長(zhǎng)35cm、寬25cm、高10cm鋪滿石英砂的育苗盤中，倒入去離子水并將育苗盤置于培養(yǎng)箱中(23/19℃，白天/黑夜；75％的相對(duì)濕度；300μmol·m-2·s-1的光照強(qiáng)度)讓種子進(jìn)行為期7d的萌發(fā)，每天更換去離子水。待種子萌發(fā)完成后，倒出所有的去離子水更換為霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔一天更換一次營(yíng)養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)23天(2片成熟葉片)時(shí)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的材料用于試驗(yàn)。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)：cts設(shè)5個(gè)濃度梯度，包括0.50g/l、0.75g/l、1.00g/l、1.25g/l和1.50g/l；spm設(shè)3個(gè)濃度梯度，50.58mg/l、101.17mg/l和151.74mg/l，兩兩組合共15個(gè)處理組，每個(gè)處理組重復(fù)4次。
外源添加及干旱脅迫處理：用培育材料的霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液作為溶劑分別配制上述不同濃度的處理組溶液，并加入20％(w/v)聚乙二醇6000(peg-6000)滲透劑模擬干旱脅迫，現(xiàn)配現(xiàn)用。在霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液中加入相應(yīng)濃度的處理組預(yù)處理6天后，更換為含有20％(w/v)peg-6000的處理液(含相應(yīng)濃度的處理組)進(jìn)行干旱脅迫處理。處理期間，每天更換一次處理液，每次300ml。所有材料置于智能光照培養(yǎng)箱中，條件同材料培育。從更換為含有20％(w/v)peg-6000的處理液時(shí)開始計(jì)時(shí)，調(diào)查白三葉葉片在中度脅迫(7天)和重度脅迫(14天)的萎蔫程度。所述萎蔫程度采用1、2、3、4、5、6、7、8、9表示，其中1表示萎蔫程度最輕，9表示萎蔫程度較重，結(jié)果見表3。
表3外源cts與spm不同濃度組合處理提高白三葉抗旱性效應(yīng)
由表3可以看出，與對(duì)照(未經(jīng)預(yù)處理)相比，不同濃度cts與spm組合處理都能在一定程度上延遲干旱脅迫下白三葉葉片萎蔫。其中，效果最好的組合是1g/lcts+101.17mg/lspm，可有效減輕白三葉萎蔫程度，其它效果較好的組合還包括1g/lcts+50.58mg/lspm，1g/lcts+151.74mg/lspm，1.25g/lcts+101.17mg/lspm，1.5g/lcts+101.17mg/lspm由此可見，cts與spm組合處理的最適濃度范圍分別為1-1.5g/l與50.58-101.17mg/l。并且，結(jié)合對(duì)比試驗(yàn)1和對(duì)比試驗(yàn)2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，濃度范圍分別為1-1.5g/l與50.58-101.17mg/l的cts與spm組合的抗旱效果顯著優(yōu)于單劑最優(yōu)施用濃度(cts1g/l、spm101.17mg/l)的效果。結(jié)果表明，本發(fā)明提供的cts與spm組合在濃度范圍分別為1-1.5g/l與50.58-101.17mg/l時(shí)具有顯著的增效效應(yīng)，可以顯著的提高白三葉的抗旱性。
驗(yàn)證試驗(yàn)1：外源cts與spm最佳濃度組合，即1g/lcts+101.17mg/lspm，對(duì)正常條件下白三葉生理指標(biāo)的影響
試驗(yàn)材料：以干旱敏感型的‘拉丁諾’白三葉作為供試材料。
材料培育：種子經(jīng)0.1％氯化汞消毒5分鐘，蒸餾水漂洗4次后備用。消毒后的種子0.1g均勻地撒在長(zhǎng)35cm、寬25cm、高10cm鋪滿石英砂的育苗盤中，倒入去離子水并將育苗盤置于培養(yǎng)箱中(23/19℃，白天/黑夜；75％的相對(duì)濕度；300μmol·m-2·s-1的光照強(qiáng)度)讓種子進(jìn)行為期7d的萌發(fā)，每天更換去離子水。待種子萌發(fā)完成后，倒出所有的去離子水更換為霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔一天更換一次營(yíng)養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)23天(2片成熟葉片)時(shí)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的材料用于試驗(yàn)。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)：試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理：?jiǎn)我桓ヽts、spm，以及cts與spm組合，以霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液為對(duì)照處理(control)。用霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液溶劑分別配制1g/lcts、101.17mg/lspm以及1g/lcts+101.17mg/lspm混合溶液各300ml進(jìn)行根施，現(xiàn)配現(xiàn)用，每處理4次重復(fù)。
觀測(cè)指標(biāo)：處理6天后取樣測(cè)定如下指標(biāo)，反映白三葉體內(nèi)多胺情況的多胺含量以及s腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)活性；反映白三葉體內(nèi)激素水平的脫落酸、細(xì)胞分裂素、赤霉素和生長(zhǎng)素含量；抗氧化酶基因表達(dá)水平：鐵超氧化物歧化酶(fesod)、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶(gpox)、抗壞血酸過氧化物酶(apx)、單脫氫抗壞血酸還原酶(mdhar)、谷胱甘肽還原酶(gr)、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(gst)；以及與生長(zhǎng)和抗旱相關(guān)的次生代謝物類黃酮和總酚含量。結(jié)果見表4。
表4外源cts與spm組合處理對(duì)白三葉生理指標(biāo)的影響
注：同行數(shù)據(jù)上標(biāo)字母相同者表示差異不顯著(p＞0.05)，同行數(shù)據(jù)上標(biāo)字母不相同者表示差異顯著(p＜0.05)。
從表4可以看出，不同處理的生理指標(biāo)證明了在正常條件下1g/lcts或101.17mg/lspm單一處理能有效促進(jìn)白三葉生長(zhǎng)，且1g/lcts和101.17mg/lspm組合處理比單一處理效果更為突出。
驗(yàn)證試驗(yàn)2：外源cts與spm最佳濃度組合對(duì)干旱脅迫下白三葉生理指標(biāo)的影響
試驗(yàn)材料：以干旱敏感型的‘拉丁諾’白三葉作為供試材料。
材料培育：種子經(jīng)0.1％氯化汞消毒5分鐘，蒸餾水漂洗4次后備用。消毒后的種子0.1g均勻地撒在長(zhǎng)35cm、寬25cm、高10cm鋪滿石英砂的育苗盤中，倒入去離子水并將育苗盤置于培養(yǎng)箱中(23/19℃，白天/黑夜；75％的相對(duì)濕度；300μmol·m-2·s-1的光照強(qiáng)度)讓種子進(jìn)行為期7d的萌發(fā)，每天更換去離子水。待種子萌發(fā)完成后，倒出所有的去離子水更換為霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔一天更換一次營(yíng)養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)23天(2片成熟葉片)時(shí)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的材料用于試驗(yàn)。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)：試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理：?jiǎn)我桓?g/lcts、101.17mg/lspm，以及1g/lcts+101.17mg/lspm，以霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液(control)和直接peg滲透脅迫為對(duì)照。
外源添加及干旱脅迫處理：用培育材料的營(yíng)養(yǎng)液(hoagland全營(yíng)養(yǎng)液)作為溶劑分別配制上述相應(yīng)濃度的cts、spm、cts+spm溶液，預(yù)處理6天后，更換為含有20％(w/v)peg-6000的處理液(含相應(yīng)濃度的cts及spm)進(jìn)行干旱脅迫處理。處理期間，每天更換一次處理液，每次300ml。所有材料置于智能光照培養(yǎng)箱中，條件同材料培育。從更換為含有20％(w/v)peg-6000的處理液時(shí)開始計(jì)時(shí)，調(diào)查白三葉葉片在中度脅迫(7天)和重度脅迫(14天)的相關(guān)生理指標(biāo)，每處理4次重復(fù)。
觀測(cè)指標(biāo)如下：反映白三葉生長(zhǎng)及水分狀況的相對(duì)含水量相對(duì)生長(zhǎng)速率；反映白三葉體內(nèi)多胺代謝情況的多胺含量以及s腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)、精氨酸脫羧酶(adc)、多胺氧化酶(pao)和二胺氧化酶(dao)活性；反映白三葉體內(nèi)激素水平的脫落酸、細(xì)胞分裂素、赤霉素和生長(zhǎng)素含量；抗氧化酶基因表達(dá)水平：鐵超氧化物歧化酶(fesod)、錳超氧化物歧化酶(mnsod)、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶(gpox)、抗壞血酸過氧化物酶(apx)、單脫氫抗壞血酸還原酶(mdhar)、脫氫抗壞血酸還原酶(dhar)、谷胱甘肽還原酶(gr)、谷胱甘肽過氧化物酶(gpx)、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(gst)；與生長(zhǎng)和抗旱相關(guān)的次生代謝物類黃酮和總酚含量。以及活性氧和膜穩(wěn)定性相關(guān)指標(biāo)超氧陰離子、過氧化氫、丙二醛含量、相對(duì)電導(dǎo)率。結(jié)果見表5、6。
表5外源cts與spm組合處理對(duì)白三葉抗旱生理指標(biāo)的影響(7天)
注：同行數(shù)據(jù)上標(biāo)字母相同者表示差異不顯著(p＞0.05)，同行數(shù)據(jù)上標(biāo)字母不相同者表示差異顯著(p＜0.05)。
表6外源cts與spm組合處理對(duì)白三葉抗旱生理指標(biāo)的影響(14天)
注：同行數(shù)據(jù)上標(biāo)字母相同者表示差異不顯著(p＞0.05)，同行數(shù)據(jù)上標(biāo)字母不相同者表示差異顯著(p＜0.05)。
從表5和6可以看出，不同處理的生理指標(biāo)證明了1g/lcts或101.17mg/lspm單一處理能有效提高白三葉抗旱性，且1g/lcts和101.17mg/lspm組合處理比單一處理效果更能有效緩解干旱脅迫。
驗(yàn)證試驗(yàn)3：外源添加劑施用時(shí)間對(duì)施用效果的影響
試驗(yàn)材料：以干旱敏感型的‘拉丁諾’白三葉作為供試材料。
材料培育：種子經(jīng)0.1％氯化汞消毒5分鐘，蒸餾水漂洗4次后備用。消毒后的種子0.1g均勻地撒在長(zhǎng)35cm、寬25cm、高10cm鋪滿石英砂的育苗盤中，倒入去離子水并將育苗盤置于培養(yǎng)箱中(23/19℃，白天/黑夜；75％的相對(duì)濕度；300μmol·m-2·s-1的光照強(qiáng)度)讓種子進(jìn)行為期7d的萌發(fā)，每天更換去離子水。待種子萌發(fā)完成后，倒出所有的去離子水更換為霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔一天更換一次營(yíng)養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)23天(2片成熟葉片)時(shí)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的材料用于試驗(yàn)。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)及處理：設(shè)上午8:00、上午10:00、下午15:00、傍晚18:00，共計(jì)4個(gè)時(shí)間根施處理(1g/lcts+101.17mg/lspm)，每處理4次重復(fù)。
外源添加及干旱脅迫處理：同實(shí)例1，結(jié)果見表7。
表7外源cts與spm組合處理不同施用時(shí)間提高白三葉抗旱性效應(yīng)
由表7可知，不同根施時(shí)間對(duì)cts與spm組合提高白三葉抗旱性效應(yīng)無明顯影響。
以上所述的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)和技術(shù)方案的情況下，都可以利用上述的方法和技術(shù)內(nèi)容對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動(dòng)和修飾。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的變動(dòng)和修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。